張卜元，范靜華

(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科，西安 710038)

咳嗽變異性哮喘(CVA)是臨床上常見的呼吸道疾病，在兒童中發(fā)病率較高，患者以慢性咳嗽為主要臨床表現(xiàn)，并具有哮喘的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的病理特征，疾病呈慢性發(fā)展，部分患者最終可進(jìn)展為典型哮喘[1]。CVA的氣道高反應(yīng)性與氣道敏感性增高有關(guān)，氣道敏感性增高與炎性細(xì)胞數(shù)目增加、上皮損傷、氣道炎癥及神經(jīng)細(xì)胞等活動(dòng)有關(guān)[2]。神經(jīng)生長因子(NGF)對(duì)于控制氣道神經(jīng)源性炎癥具有重要作用，有研究[3]顯示其參與了哮喘疾病的發(fā)展。感覺神經(jīng)和副交感神經(jīng)中含有多種神經(jīng)肽，包括神經(jīng)激肽A(NKA)、P物質(zhì)(SP)，這些神經(jīng)肽在支氣管血液中廣泛存在，并與呼吸道炎癥、支氣管收縮、黏液分泌等有著密切關(guān)系[4]。隨著研究的深入，許多研究[5-6]發(fā)現(xiàn)輔助性T淋巴細(xì)胞(Th1和Th2)及其分泌的細(xì)胞因子平衡失調(diào)也是導(dǎo)致CVA發(fā)生發(fā)展的重要原因。而NGF、NKA及SP表達(dá)與Th1/Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子之間是否存在聯(lián)系目前研究較少。因此，本研究對(duì)CVA患兒及正常兒童的NGF、NKA及SP表達(dá)與Th1/2細(xì)胞及其細(xì)胞因子的相關(guān)性進(jìn)行了分析，以期為CVA的發(fā)病機(jī)制及臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2018年9月至2019年9月收治的80例CVA患兒作為研究組，納入標(biāo)準(zhǔn)：1)符合《咳嗽的診斷與治療指南》[7]中CVA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)臨床檢查確診；2)患兒家屬均知情且自愿參與，簽署知情同意書；3)患兒年齡3～15歲，且在最近3個(gè)月以內(nèi)未接受支氣管擴(kuò)張或者激素治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)有嚴(yán)重腎、心臟、肝或造血系統(tǒng)疾病病史；2)同時(shí)患有其他肺部疾病，如肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張癥等；3)入組前曾在他院接受過治療；4)存在無法全程配合該項(xiàng)目研究可能性；5)有嚴(yán)重精神障礙。其中男43例，女37例；年齡3～15歲，平均(8.2±1.4)歲。另選取同期在本院進(jìn)行健康體檢的正常兒童80例作為對(duì)照組，其中男45例，女35例，年齡3～14歲，平均(7.8±1.3)歲。2組研究對(duì)象的性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 支氣管誘導(dǎo)痰上清液(BALF)炎性細(xì)胞檢測(cè)

誘導(dǎo)前10 min，給受試者吸入霧化3%的高滲鹽水、沙丁胺醇400 μg，隨后收集痰液，將痰液加入到4倍體積的0.1%二硫蘇糖醇中進(jìn)行水浴，水浴后離心處理，提取上清液，對(duì)炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 NGF、NKA及SP測(cè)定

于清晨空腹抽取5 mL靜脈血，3000 r·min-1離心10 min取血清，-80 ℃保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)NGF、NKA及SP水平，試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.2.3 神經(jīng)源性相關(guān)炎癥因子測(cè)定

于清晨空腹抽取5 mL靜脈血，3000 r·min-1離心10 min取血清，-80 ℃保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素5(IL-5)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9，試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，所有操作嚴(yán)格依照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 Th1/Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子測(cè)定

于清晨空腹抽取5 mL靜脈血，3000 r·min-1離心10 min取血清，-80 ℃保存待測(cè)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th1和Th2細(xì)胞濃度。采用ELISA法測(cè)定血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、IgG、IgE水平，實(shí)驗(yàn)中各血清細(xì)胞因子試劑盒均來自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)過整齊性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 支氣管誘導(dǎo)痰炎性細(xì)胞水平

研究組巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)均顯著低于對(duì)照組，嗜酸性粒細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)均顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 2組支氣管誘導(dǎo)痰上清液炎性細(xì)胞水平比較

2.2 血清NGF、NKA及SP水平比較

研究組血清NGF、NKA、SP水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 2組血清NGF、NKA及SP水平比較

2.3 血清神經(jīng)源性相關(guān)炎癥因子水平

研究組血清TNF-α、IL-5、MMP-2、MMP-9水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 2組血清神經(jīng)源性相關(guān)炎癥因子水平比較

2.4 Th1/Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

研究組Th1細(xì)胞數(shù)、Th1/Th2、IL-2水平、IFN-γ水平均顯著低于對(duì)照組，Th2細(xì)胞數(shù)、IL-4水平、IL-10水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表4 2組Th1/Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

2.5 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NGF、NKA及SP與Th1/Th2(r=-0.354、-0.457、-0.502，均P<0.01)、IL-2(r=-0.493、-0.398、-0.376，均P<0.01)、IFN-γ(r=-0.506、-0.385、-0.489，均P<0.01)呈顯著負(fù)相關(guān)，與IL-4(r=0.437、0.382、0.455，均P<0.01)、IL-10(r=0.396、0.508、0.449，均P<0.01)呈顯著正相關(guān)。

3 討論

CVA的發(fā)病機(jī)制與呼吸道炎癥有著顯著關(guān)系，其中存在大量炎性細(xì)胞參與，并導(dǎo)致氣道黏膜增厚，引發(fā)呼吸道狹窄，使患者出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難等臨床表現(xiàn)。有研究[8]顯示，嗜酸性粒細(xì)胞活性增強(qiáng)可促進(jìn)和釋放多種炎性介質(zhì)的表達(dá)，并參與了損傷氣道上皮細(xì)胞的介導(dǎo)反應(yīng)。嗜酸性粒細(xì)胞浸潤程度是判斷氣道炎癥嚴(yán)重程度的重要判斷指標(biāo)。CVA、哮喘等均為嗜酸性粒細(xì)胞浸潤的慢性氣道炎癥反應(yīng)[9]。本研究結(jié)果顯示，CVA患兒誘導(dǎo)痰液上清液中性粒細(xì)胞數(shù)顯著低于正常兒童，嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)顯著高于正常兒童，提示CVA患兒氣道癥狀與嗜酸性粒細(xì)胞浸潤及中性粒細(xì)胞減少有關(guān)。

有研究[10]顯示，神經(jīng)-受體機(jī)制參與了CVA患者呼吸道高反應(yīng)性及炎性細(xì)胞產(chǎn)生。反復(fù)咳嗽和呼吸道反應(yīng)增高長時(shí)間刺激機(jī)體同一感受器，促使氣道狹窄、咳嗽等癥狀逐漸加重。NGF主要由神經(jīng)元和其他神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生，有研究[11]指出，NGF在慢性咳嗽患者氣道反應(yīng)的控制和維持中具有重要作用。NKA、SP為氣道內(nèi)非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)(NANC)感覺神經(jīng)元釋放的具有不同生物活性的感覺神經(jīng)肽，NKA、SP可促進(jìn)血管通透性增加，引發(fā)血漿滲出、組織水腫等病理改變[12-13]，在CVA患者中表現(xiàn)為氣道神經(jīng)源性炎癥。本研究結(jié)果顯示，CVA患兒NGF、NKA、SP水平顯著高于正常兒童，提示CVA患兒NGF、NKA、SP水平增加促使嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、中性粒細(xì)胞減少，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子釋放，加重氣道炎癥反應(yīng)，表明NGF、NKA、SP參與了CVA患兒咳嗽、驗(yàn)證過程和氣道高反應(yīng)性的發(fā)展過程。NGF具有高效調(diào)控神經(jīng)肽的作用，因此其在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用引發(fā)關(guān)注。NGF可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞促進(jìn)速激肽受體表達(dá)和速激肽生成，從而可誘導(dǎo)和促進(jìn)神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生發(fā)展。本研究認(rèn)為其主要的機(jī)制為：NGF能夠上調(diào)氣道內(nèi)神經(jīng)肽的產(chǎn)生，促使神經(jīng)肽類物質(zhì)數(shù)量和類型的改變。NKA、SP與咳嗽敏感性存在明顯相關(guān)性，炎性狀態(tài)下CVA患者呼吸道NGF產(chǎn)生明顯增加，其誘導(dǎo)NKA、SP水平隨之上升，從而增強(qiáng)炎性細(xì)胞活性，放大氣道炎癥。嗜酸性粒細(xì)胞胞膜可以大量表達(dá)NGF受體并促進(jìn)NGF水平的上升，CVA患兒嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目增加，加重炎癥反應(yīng)，并進(jìn)一步刺激NGF的表達(dá)釋放，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致咳嗽敏感性和氣道神經(jīng)源性炎癥增強(qiáng)。本研究中，研究組TNF-α、IL-5、MMP-2、MMP-9水平均顯著高于對(duì)照組。提示，由于CVA患兒機(jī)體NGF、NKA、SP水平異常升高導(dǎo)致氣道炎癥反應(yīng)慢性進(jìn)展，促使TNF-α、IL-5等炎癥因子水平明顯增加。

有研究[14-15]指出，哮喘、CVA等疾病患者機(jī)體存在不同程度的免疫功能異常，這與Th1/Th2細(xì)胞比例異常及功能失衡等有著明顯關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，CVA患兒Th1細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組，Th2細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組，Th1/Th2顯著低于對(duì)照組，并且CVA患兒IL-2、IFN-γ水平顯著低于對(duì)照，IL-4、IL-10水平顯著高于對(duì)照組。提示CVA患兒Th1/Th2細(xì)胞因子失衡，導(dǎo)致機(jī)體免疫力降低，并與CVA的病情進(jìn)展和反復(fù)發(fā)作關(guān)系密切。本研究中，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NGF、NKA及SP與Th1/Th2、IL-2、IFN-γ顯著負(fù)相關(guān)，與IL-4、IL-10顯著正相關(guān)。提示CVA患兒NGF、NKA及SP異常升高與患兒Th1/Th2細(xì)胞因子失衡存在相關(guān)性。Th1分泌IFN-γ對(duì)于IgE合成具有促進(jìn)作用，Th2分泌的IL-4對(duì)于IgE合成具有正調(diào)節(jié)作用，IL-2、IFN-γ水平降低和IL-4、IL-10水平增加可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量嗜酸性細(xì)胞、炎癥介質(zhì)、IgE等，IgE介導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)I 型變態(tài)反應(yīng)，從而導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性、支氣管痙攣和哮喘反復(fù)。王豪等[16]研究顯示，變應(yīng)性鼻炎患者NGF等神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA的表達(dá)量上調(diào)并影響Th1/Th2細(xì)胞平衡，從而導(dǎo)致變應(yīng)性鼻炎疾病發(fā)展。因此本研究推測(cè)，NGF、NKA及SP可誘導(dǎo)神經(jīng)源相關(guān)炎性介質(zhì)的合成和釋放，加重CVA患兒氣道炎性反應(yīng)，促使炎性細(xì)胞和免疫細(xì)胞活性改變和平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞因子水平改變；同時(shí)，Th1/2細(xì)胞失衡也導(dǎo)致機(jī)體炎性應(yīng)激加劇，嗜酸性細(xì)胞合成和釋放NGF等水平增加，促進(jìn)CVA病情發(fā)展；并且，Th1/Th2細(xì)胞失衡促使機(jī)體免疫力降低，導(dǎo)致機(jī)體抑制炎性發(fā)展的能力減弱，從而促進(jìn)了NGF、NKA及SP的水平升高。

綜上所述，CVA患兒存在明顯的Th1/Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子失衡，炎癥因子水平急增，通過NGF、NKA及SP檢測(cè)可有助于了解CVA患兒病情變化及免疫功能失衡情況。