官小鳳，劉志云,2，肖 融,2，劉作華,2

液態(tài)發(fā)酵飼料連續(xù)發(fā)酵工藝

官小鳳1，劉志云1,2，肖 融1,2，劉作華1,2※

（1. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460； 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部養(yǎng)豬科學(xué)重點實驗室，重慶 402460）

為建立一套液態(tài)發(fā)酵飼料的連續(xù)生產(chǎn)工藝，該研究以玉米-豆粕-麥麩混合物為發(fā)酵基質(zhì)進行液態(tài)發(fā)酵菌株的篩選，通過監(jiān)測發(fā)酵過程中液態(tài)飼料的pH值、乳酸菌數(shù)量、大腸桿菌數(shù)量、霉菌數(shù)量、酵母菌數(shù)量、酸溶蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量等指標(biāo)變化規(guī)律探究發(fā)酵菌株、連續(xù)發(fā)酵過程中保留比例、發(fā)酵溫度、外源苯甲酸和外源酶制劑對發(fā)酵進程的調(diào)控及飼料營養(yǎng)價值的影響。結(jié)果表明：1）篩選出的乳酸菌菌株28-7具有較強的大腸桿菌抑制能力和產(chǎn)乳酸能力，發(fā)酵6 h時飼料pH值下降到4.45，發(fā)酵飼料中未檢出大腸桿菌；2）接種乳酸菌28-7的連續(xù)發(fā)酵過程中，20%、30%、50%的保留比例對發(fā)酵飼料的pH值、乳酸菌數(shù)量、霉菌數(shù)量的影響差異不大，大腸桿菌均無檢出，20%的保留比例可使連續(xù)發(fā)酵正向進行；3）外源非淀粉多糖酶的加入可顯著提高發(fā)酵飼料中酸溶蛋白含量、酸溶蛋白/粗蛋白質(zhì)比值和可溶性糖含量（<0.05），外源苯甲酸的加入可有效抑制發(fā)酵過程中霉菌的增殖。4）37 ℃條件下發(fā)酵可顯著提高飼料中酸溶蛋白含量、酸溶蛋白/粗蛋白質(zhì)比值（<0.05），3～12 、20 、37 ℃條件下獲得的飼料的pH值<4.0、乳酸菌數(shù)量大于1010CFU/mL，大腸桿菌、酵母、霉菌未檢測出。綜上，本研究建立的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝為：將乳酸菌28-7（接種量1.0×108CFU/mL）、非淀粉多糖酶（250 g/kg）、苯甲酸（0.1 g/kg）于發(fā)酵起始時同時加入，以24 h為發(fā)酵周期、20%的保留比例在3～12 （冬季室溫）、20 （春秋平均室溫）、37 ℃（夏季平均室溫）條件下進行生產(chǎn)。該工藝生產(chǎn)所得的液態(tài)發(fā)酵飼料色澤淡黃，富有溫和的酸香味，飼料pH值<4.0，乳酸菌數(shù)量>1010CFU/mL，酸溶蛋白含量、酸溶蛋白/粗蛋白質(zhì)比值均顯著提升（<0.05），霉菌、酵母、大腸桿菌無檢出，相比春、秋、冬3季，夏季生產(chǎn)更有利于飼料酸溶蛋白含量的提升（<0.05）。

飼料；發(fā)酵；工藝優(yōu)化

0 引 言

中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號規(guī)定自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)將停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料[1]。液態(tài)發(fā)酵飼料可抑制病原菌增殖、改善畜禽胃腸道健康[2-9]，對提高動物生產(chǎn)性能、實現(xiàn)無抗養(yǎng)殖具有重要意義。液態(tài)發(fā)酵飼料的飼喂效果取決于發(fā)酵飼料的pH值、有機酸組成、微生物組成、營養(yǎng)價值、適口性等方面，國外對液態(tài)發(fā)酵飼料的研究與應(yīng)用較成熟，Adams等[10]提出監(jiān)測發(fā)酵生產(chǎn)過程中微生物的變化對評價發(fā)酵食品的品質(zhì)具有重要意義。Plumed等[11]發(fā)現(xiàn)隨著自然發(fā)酵時間的延長，酵母易成為優(yōu)勢菌群而影響飼料適口性和干物質(zhì)含量，自然發(fā)酵不是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)液態(tài)發(fā)酵飼料的可靠的方式。添加外源乳酸菌[11]或已發(fā)酵成熟產(chǎn)物[5]、弱酸[12]可抑制發(fā)酵過程中大腸桿菌、酵母等雜菌的增殖，是引導(dǎo)發(fā)酵進程正向進行、提高發(fā)酵飼料品質(zhì)的有效策略。中國對液態(tài)發(fā)酵飼料的研究起步較晚，現(xiàn)有研究主要集中于飼料營養(yǎng)價值的提升及應(yīng)用效果評價[13-16]等方面，而關(guān)于液態(tài)發(fā)酵飼料的生產(chǎn)工藝及其發(fā)酵過程中微生物及營養(yǎng)物質(zhì)動態(tài)變化的研究較少，加之中國生物飼料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化工作剛起步，缺乏液態(tài)發(fā)酵飼料品質(zhì)檢測標(biāo)準(zhǔn)，因此，監(jiān)測、調(diào)控發(fā)酵進程以保證液態(tài)發(fā)酵飼料的品質(zhì)顯得尤為重要。

本文以玉米-豆粕-麥麩混合物為發(fā)酵基質(zhì)進行乳酸菌菌株的篩選，通過監(jiān)測發(fā)酵過程中液態(tài)飼料的pH值、主要微生物、酸溶蛋白等指標(biāo)變化規(guī)律來探究篩選菌株、保留比例、發(fā)酵溫度、外源苯甲酸和外源酶對發(fā)酵進程的調(diào)控及飼料營養(yǎng)價值的影響，以期將飼料生物安全性和營養(yǎng)價值的提升相結(jié)合，建立一套液態(tài)發(fā)酵飼料的連續(xù)生產(chǎn)工藝，為液態(tài)發(fā)酵飼料生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株：乳酸菌28-7、29-3、29-4、29-8、20765為實驗室自行分離保存的乳酸菌菌株；乳酸菌CICC20765購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。

非淀粉多糖酶制劑：果膠酶（500 U/mg）、纖維素酶(綠色木霉，50 U/mg)購于上海源葉生物科技有限公司，使用時按比例（實驗室數(shù)據(jù)，未發(fā)表）混合。

發(fā)酵基料：豆粕，購于重慶新涪食品有限公司；玉米、麥麩購自于重慶匯光飼料廠。玉米（適當(dāng)粉碎）、豆粕、麥麩按31.5:22:4的比例混合均勻。

主要儀器：HQ-40d便攜式pH計，美國哈希；L-8900氨基酸自動分析儀，日本日立；FOSS840自動凱氏定氮儀，丹麥福斯；UVIKON923紫外分光光度計，美國伯樂。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵菌株的篩選

稱取15 g發(fā)酵基料（自然風(fēng)干）于100 mL三角瓶，加水，按4%（質(zhì)量分數(shù),下同）的接種量分別加入菌液 28-7、29-3、29-4、29-8、20765后充分混勻，使最終料水比為1:3，37℃恒溫發(fā)酵24 h。試驗以不接種乳酸菌的發(fā)酵組為對照（CK），共設(shè)置6組，每組2個重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后，測定發(fā)酵飼料的pH值，通過目測和鼻嗅評定其感官品質(zhì)。測定待選菌株對大腸桿菌的抑菌性能，結(jié)合菌株對發(fā)酵飼料感官品質(zhì)的影響及抑大腸桿菌性能進行篩選，并對篩選菌株進行產(chǎn)有機酸性能的測定。

1.2.2 連續(xù)發(fā)酵過程保留量的篩選

將發(fā)酵基料、發(fā)酵菌液和水加入10 L的發(fā)酵罐中，使最終整料水比為1:3，發(fā)酵罐內(nèi)物料的乳酸菌濃度達到1.0×108CFU/mL，200 r/min充分混勻后調(diào)整轉(zhuǎn)速為70 r/min，不通空氣，于夏季自然溫度（33～40 ℃）下發(fā)酵。設(shè)定每24 h為一個發(fā)酵階段，試驗進行4階段共計96 h，第24、48、72 h時取料，使保留比例分別為50%、30%、20%，再按取料量補充等量的新鮮發(fā)酵基料和水，繼續(xù)進行下一階段的發(fā)酵，測定發(fā)酵飼料的pH值和大腸桿菌數(shù)量，以選擇適宜的留樣量。

1.2.3 發(fā)酵添加劑的篩選

根據(jù)1.2.2的試驗結(jié)果進行該階段試驗。

將發(fā)酵基料、發(fā)酵菌液和水加入發(fā)酵瓶中，使最終整料水比為1:3，發(fā)酵瓶內(nèi)物料的乳酸菌濃度達到1.0×108CFU/mL，于秋季自然溫度（21～28 ℃）下進行連續(xù)發(fā)酵。試驗進行3階段共計72 h，設(shè)置乳酸菌發(fā)酵組，乳酸菌+酶發(fā)酵組，乳酸菌+苯甲酸發(fā)酵組，乳酸菌+酶+苯甲酸發(fā)酵組，每組3個重復(fù)，具體分組及其處理參照表1。發(fā)酵起始（0 h）及每階段的第4、8、12、24 h，測定飼料中的主要微生物含量、pH值。取出的飼料于55 ℃烘干，測定發(fā)酵飼料中的可溶性糖、粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白質(zhì)含量，計算酸溶蛋白質(zhì)/粗蛋白質(zhì)值。

1.2.4 溫度對發(fā)酵飼料的影響

將發(fā)酵基料、發(fā)酵菌液和水加入發(fā)酵瓶中，使最終整料水比為1:3，發(fā)酵罐內(nèi)物料的乳酸菌濃度達到1.0×108CFU/mL，分別于冬季自然溫度（3～12 ℃）、20 （代表春秋季溫度）、37 ℃（代表夏季溫度）下進行連續(xù)發(fā)酵，每個處理3個重復(fù)，通過5階段（120 h）的連續(xù)發(fā)酵驗證不同季節(jié)溫度下發(fā)酵工藝的可行性。發(fā)酵起始（0 h）及每階段結(jié)束時，測定飼料中的主要微生物含量及pH值。取出的飼料于55 ℃烘干，測定發(fā)酵飼料中的可溶性糖、粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白質(zhì)含量，計算酸溶蛋白質(zhì)/粗蛋白質(zhì)值。

表1 乳酸菌28-7、酶、苯甲酸不同組合的發(fā)酵試驗分組及其處理

注：有“＋”表示添加相應(yīng)的試驗處理項目，無“＋”則表示不添加。

Note: With "+" means add corresponding processing items, without "+" means not add.

1.3 指標(biāo)測定及方法

發(fā)酵飼料技術(shù)通則（T/CSWSL 002-2018）中規(guī)定，發(fā)酵飼料應(yīng)色澤均一，具弱酸味且氣味柔和，無霉變結(jié)塊，pH值、有效活菌數(shù)、酸溶蛋白、粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白/粗蛋白質(zhì)等指標(biāo)應(yīng)符合相應(yīng)的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。

pH值：發(fā)酵罐內(nèi)飼料的pH值由發(fā)酵罐pH電極自動測定并記錄；三角瓶和發(fā)酵瓶內(nèi)飼料的pH值用便攜式pH計在飼料充分混勻后測定，每個重復(fù)測定3次。

主要微生物含量：發(fā)酵飼料充分混勻后稍靜置，用無菌移液管吸取飼料上清液于無菌離心管內(nèi)，每個（重復(fù)）飼料上清樣不稀釋或稀釋3個梯度，每個梯度2個平行，用平板傾注法測定飼料中霉菌、酵母、大腸桿菌、乳酸菌數(shù)量。霉菌、酵母、大腸桿菌、乳酸菌數(shù)量測定范圍分為≥0～102、≥102～104、≥104～106、≥106CFU/mL。

乳酸菌抑大腸桿菌性能：以大腸桿菌（豬糞中分離，實驗室保存）為指示菌，用牛津杯法測定乳酸菌培養(yǎng)液的上清對大腸桿菌抑菌圈的大小，每個平板3個牛津杯，每株菌重復(fù)測定2次。

粗蛋白質(zhì)含量的測定參照《GB/T 6432-2018》；酸溶蛋白含量的測定參照《GB/T 22492-2008》；有機酸含量的測定參照《GB5009.157-2016》；可溶性糖含量的測定參照蒽酮法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016分析軟件進行統(tǒng)計和初步處理，SPSS19.0軟件中的One-way ANOVA進行方差分析，圖表采用Excel 2016繪制，主要微生物含量用平均值表示，其余結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

相比自然發(fā)酵，接種乳酸菌發(fā)酵顯著降低了飼料的pH值（＜0.05），各組飼料pH值均降低到4.0以下，且各組差異不顯著（＞0.05），改善了飼料感官品質(zhì)，其中乳酸菌28-7發(fā)酵的飼料色澤米黃，具有溫和的酸香味（表2）。乳酸菌28-7對大腸桿菌的抑菌圈最大，其直徑為（1.25±0.20）cm（表3和圖1）；在培養(yǎng)36 h時其乳酸、乙酸、丙酸產(chǎn)量分別為14.86、3.39、＜0.01g/mg，因此，篩選乳酸菌28-7為本試驗液態(tài)發(fā)酵用菌株。

表2 發(fā)酵飼料的pH值及其感官品質(zhì)

注：不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。

Note: The different superscript letter differ significantly (<0.05).

表3 乳酸菌對大腸桿菌的抑菌圈直徑

注：“-”表示無抑菌圈產(chǎn)生。

Note: “-” indicates that there is no bacteriostatic circle.

2.2 連續(xù)發(fā)酵過程保留比例對發(fā)酵效果的影響

由圖2和圖3可知，0～8 h飼料的pH值快速下降，6 h飼料pH值（4.45）下降到4.5以下，24 h飼料的pH值和乳酸菌數(shù)量分別為3.90、4.10×1011CFU/mL。保留比例分別為50%、30%、20%時，補料后飼料pH值分別為3.97、4.64、4.82，發(fā)酵結(jié)束時飼料的pH值分別3.90、3.78、3.85，乳酸菌數(shù)量分別為4.65×1011、5.12×1011、6.03×1011CFU/mL。自24 h后，大腸桿菌無檢出，霉菌數(shù)量在920～1 100 CFU/mL范圍內(nèi)較穩(wěn)定存在。

注：0～24 h為第一階段，保留比例為50%；24～48 h為第二階段，保留比例為30%；48～72 h為第三階段，保留比例為20%；72～96 h為第四階段。

圖3 不同保留比例對發(fā)酵飼料中主要微生物含量的影響

雖保留比例不一致，但發(fā)酵飼料的pH值、乳酸菌數(shù)量、霉菌數(shù)量變化差異不大，大腸桿菌無檢出，故本試驗采用20%的保留比例進行后續(xù)研究。

2.3 發(fā)酵添加劑對發(fā)酵效果的影響

乳酸菌28-7、外源酶、外源苯甲酸的不同組合對發(fā)酵飼料的pH值和主要微生物的影響見下圖4。各階段發(fā)酵結(jié)束時飼料中的乳酸菌數(shù)量（圖4b）均達到1012CFU/mL，pH值（圖4a）均小于4.0，且不同處理組飼料的pH值、乳酸菌數(shù)量的動態(tài)變化幾乎一致；飼料中的大腸桿菌數(shù)量（圖4c）在0～12 h內(nèi)有一個快速增長和快速下降的過程，12 h后其數(shù)量≤200 CFU/mL。未加苯甲酸處理飼料中的酵母菌數(shù)量（圖4e）在28～60 h內(nèi)有小幅增加，60～72 h大幅增加，72 h達到106CFU/mL；霉菌數(shù)量（圖4d）呈波形動態(tài)增長，在各階段發(fā)酵結(jié)束時達到該階段內(nèi)峰值，但均符合GB 13078飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的要求。添加苯甲酸的飼料中的酵母和霉菌數(shù)量在0 h有最大值，此后霉菌數(shù)量始終≤80 CFU/mL，酵母無檢出。可見外源苯甲酸的加入可有效抑制發(fā)酵過程中霉菌的增殖。

注：0～24 h為第一階段，24～48 h為二階段，48～72 h為第三階段，下同。

乳酸菌28-7、外源酶、外源苯甲酸的不同組合對對發(fā)酵飼料營養(yǎng)價值的影響如圖5所示。就3階段均值而言，發(fā)酵飼料中粗蛋白含量（圖5d）較0 h無顯著變化，酸溶蛋白含量（圖5a）、酸溶蛋白/粗蛋白質(zhì)值（圖5b）、可溶糖含量（圖5c）較0 h均有顯著增加（<0.05），其中加酶組增幅更高，較未加酶組相比達到顯著水平（<0.05）。外源酶的加入可顯著提升發(fā)酵飼料中的酸溶蛋白含量、酸溶蛋白/粗蛋白質(zhì)比值、可溶性糖含量（<0.05）。

本試驗選擇菌、酶、苯甲酸3因素進行組合發(fā)酵以促進發(fā)酵飼料生物安全性和營養(yǎng)價值的提升。

2.4 溫度對發(fā)酵效果的影響

溫度對發(fā)酵飼料的pH值和主要微生物的影響見下圖6。相比其他溫度條件，37 ℃在pH值（圖6a）降低和乳酸菌（圖6b）增殖方面更具優(yōu)勢，3～12和20 ℃發(fā)酵的飼料的pH值、乳酸菌數(shù)量的變化趨勢幾乎一致。所有溫度條件下所得飼料的pH值均<4.5，乳酸菌數(shù)量均>1.0×1010CFU/mL，大腸桿菌（圖6c）、霉菌（圖6d）、酵母（<102CFU/mL，未制圖）自24 h后無檢出，飼料生物安全性獲得提高。

圖5 發(fā)酵添加劑對發(fā)酵飼料的營養(yǎng)價值的影響

注：此處為驗證不同季節(jié)溫度下發(fā)酵工藝的可行性，故將3階段發(fā)酵延長為5階段發(fā)酵。其中0～24 h為第一階段，>24～48 h為第二階段，>48～72 h為第三階段，>72～96 h為第四階段，>96～120 h為第五階段。延長發(fā)酵階段驗證不同季節(jié)溫度下發(fā)酵工藝的可行性，下同。

溫度對發(fā)酵飼料營養(yǎng)價值的影響如下圖7所示。就五階段均值而言，不同溫度條件下的發(fā)酵飼料中的可溶糖含量（圖7c）、粗蛋白質(zhì)含量（圖7d）與0 h相比無顯著差異。各發(fā)酵飼料中的酸溶蛋白含量（圖7a）、酸溶蛋白/粗蛋白值（圖7b）較0h均有顯著增加（圖7a、7b、7c，<0.05），其中37 ℃較3～12和20 ℃相比達到顯著水平（<0.05），3～12和20 ℃相比無顯著差異?？梢姕囟鹊纳哂欣陲暳现兴崛芎康奶岣?，對粗蛋白質(zhì)和可溶性糖含量無明顯影響。

圖7 溫度對發(fā)酵飼料營養(yǎng)價值的影響

3 討 論

3.1 添加劑對發(fā)酵效果的影響

3.1.1 乳酸菌28-7的發(fā)酵效果

菌種質(zhì)量對發(fā)酵飼料的品質(zhì)有直接影響，發(fā)酵過程中低pH值（3.5～4.5[17]）和高濃度未解離形式的乳酸是抑制腸桿菌等致病菌增殖的重要保障[6,18]，也是緩解部分原料發(fā)酵后混合新鮮原料和水再發(fā)酵時病原菌爆發(fā)式增殖的有效策略[2,19]。因此，發(fā)酵菌種應(yīng)具備快速增殖、大量產(chǎn)生乳酸、快速降低發(fā)酵基料pH值的特點[20-22]。乳酸菌28-7液態(tài)發(fā)酵24 h飼料的pH值為3.97、乳酸菌數(shù)量達到4.10×1011CFU/mL，這與胡虹等[14,22]利用紫外線誘變后的乳酸菌菌種在最佳條件下發(fā)酵所得飼料的pH值和乳酸菌數(shù)量相差不多，同時符合Missotten等[3]提出的理想液態(tài)發(fā)酵飼料的pH值<4.5，乳酸菌活菌數(shù)>109CFU/mL的要求。在抑制大腸桿菌方面，乳酸菌28-7相比賈朋輝等[23]試驗中使用的專用發(fā)酵劑更具優(yōu)勢，這與其能快速產(chǎn)生高濃度乳酸有關(guān)，還可能與其能產(chǎn)生某些細菌素類物質(zhì)有關(guān)。此外，研究表明高濃度乳酸有利于提高飼料適口性[6]，適量乙酸可協(xié)同乳酸抑制病原菌的增殖，但高濃度乙酸會產(chǎn)生“異味”，降低適口性[24]。乳酸菌28-7培養(yǎng)36 h時乳酸、乙酸產(chǎn)量分別14.86、3.39g/mg，乙酸產(chǎn)量低，接種該菌發(fā)酵的飼料色澤米黃，具有溫和的酸香味。可見，乳酸菌28-7具備提高液態(tài)發(fā)酵飼料生物安全性及其感官品質(zhì)的能力。

3.1.2 外源酶的發(fā)酵效果

較未加酶組相比，外源酶的加入可進一步提高玉米-豆粕型液態(tài)發(fā)酵飼料中可溶性糖含量和酸溶蛋白的含量，在酸溶蛋白含量的提升方面與張煜等[25]的研究結(jié)果具有一致性。這是因為酶制劑可以破壞植物細胞的胞間層和細胞壁，降解纖維素、淀粉鏈和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)為單糖、小肽和氨基酸等小分子物質(zhì)[26]?？扇苄蕴鞘前l(fā)酵系統(tǒng)中乳酸菌等微生物迅速增殖的養(yǎng)分來源，其含量提高一方面可促進微生物發(fā)酵的快速啟動，另一方面可降低微生物對糖分的消耗，提高飼料甜香味。酸溶蛋白是分子質(zhì)量在10 KD以下的小肽，包括寡肽和游離氨基酸，現(xiàn)代飼料蛋白質(zhì)消化理論認為一定的寡肽和游離氨基酸的混合物可以提高動物的消化率[27]，這在張煜的試驗中也得到了驗證。

3.1.3 外源苯甲酸的發(fā)酵效果

某些乳酸菌可通過產(chǎn)生乳酸鏈球菌素、-聚賴氨酸、苯乳酸等物質(zhì)效抑制腐敗類微生物的增殖[28]，黃慧福等[29]發(fā)現(xiàn)乳酸菌液態(tài)發(fā)酵可有效抑制霉菌的增殖，在發(fā)酵5 d時霉菌無檢出。而本文試驗結(jié)果顯示發(fā)酵飼料中的霉菌數(shù)量并不隨pH值的降低和乳酸菌數(shù)量的增加而穩(wěn)定減少，與上述資料存在差異，致使霉菌成為影響飼料生物安全性的主要因素。研究表明有機弱酸[30]或有機酸鹽[31]可抑制發(fā)酵或青貯過程中霉菌的增殖，Carme Plumed-Ferrer等[12]研究表明液態(tài)酸性環(huán)境可進一步增強甲酸、山梨甲酸、苯甲酸等弱酸對真菌的抑制作用而不影響乳酸菌的增殖，本文試驗結(jié)果顯示，添加外源苯甲酸的發(fā)酵飼料中霉菌和酵母無檢出，同時飼料的pH值和乳酸數(shù)量的動態(tài)變化與未加苯甲酸組無明顯差異，這與上述文獻描述一致。

3.2 保留量對發(fā)酵效果的影響

連續(xù)發(fā)酵是在發(fā)酵罐內(nèi)保留一定比例的發(fā)酵產(chǎn)物作為下一階段的發(fā)酵種子，再混合新鮮的發(fā)酵基料和水進行繼續(xù)發(fā)酵的過程，保留比例一般為20%～50%。Moran等[19]研究發(fā)現(xiàn)，20%的保留比例相比33%和42%的保留比例在降低飼料的pH值和抑制大腸桿菌增殖方面更具優(yōu)勢，而本文發(fā)現(xiàn)50%、30%和20%的保留比例在降低飼料pH值和抑制大腸桿菌方面無明顯差異，這與保留飼料中微生物的種類和數(shù)量有關(guān)系。Moran等人的研究中前期采用較長時間的自然發(fā)酵以積累有機酸、降低飼料pH值，Christensen等[32]發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵時發(fā)酵基料的pH值在6～8 h才開始下降，這期間易使發(fā)酵原料中天然存在的大腸桿菌等病原菌爆發(fā)性增殖而成為優(yōu)勢菌群，并隨保留飼料進入下一階段的發(fā)酵體系中。本試驗于發(fā)酵起始時接種乳酸菌28-7，發(fā)酵起始后第6 h時飼料pH值下降到4.45，以20%的保留比例進行連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)的飼料的pH值和乳酸菌數(shù)量分別為3.85、6.03×1011CFU/mL，大腸桿菌無檢出。低pH值、富乳酸菌、少病原菌的保留飼料作為下階段發(fā)酵體系中優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵種子，不僅可調(diào)控發(fā)酵進程持續(xù)正向進行，還提高了飼料生產(chǎn)效率

3.3 溫度對發(fā)酵效果的影響

溫度和時間是影響液態(tài)發(fā)酵飼料品質(zhì)最大的因素，在一定范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵溫度的提升和發(fā)酵時間的延長，乳酸的產(chǎn)率和累積量增大，抑制病原菌增殖的效果更好。本試驗設(shè)置的溫度模擬了西南地區(qū)的冬季、春秋兩季和夏季自然溫度，考察了西南地區(qū)氣候?qū)Πl(fā)酵進程及飼料品質(zhì)的影響。試驗結(jié)果顯示相比其他溫度，37 ℃在提升飼料酸溶蛋白產(chǎn)量方面優(yōu)勢明顯，這與酶活和菌株代謝速率相關(guān)。研究表明當(dāng)溫度上升至30 ℃時，乳酸產(chǎn)率顯著增大[33]，為保證乳酸產(chǎn)量及其對飼料品質(zhì)的影響，生產(chǎn)液態(tài)發(fā)酵飼料的溫度一般不能低于15 ℃[34]，而本試驗結(jié)果顯示3～12、20和37 ℃條件下發(fā)酵所得飼料的pH值均<4.5，乳酸菌數(shù)量均>1.0×1010CFU/mL，達到優(yōu)質(zhì)液態(tài)發(fā)酵飼料的要求，同時飼料中大腸桿菌、霉菌、酵母自24 h后無檢出。因此，本試驗所建立的液態(tài)發(fā)酵工藝可不受西南地區(qū)氣候影響以保證液態(tài)發(fā)酵飼料的適口性和生物安全性。

4 結(jié) 論

1）本研究篩選出了一株適用于液態(tài)連續(xù)發(fā)酵的乳酸菌菌株28-7，該菌具有較強產(chǎn)乳酸和抑制大腸桿菌增殖能力。

2）建立了一套液態(tài)發(fā)酵飼料連續(xù)發(fā)酵工藝：將乳酸菌28-7（接種量1.0×108CFU/mL）、非淀粉多糖酶劑（250 g/kg）、苯甲酸（0.1 g/kg）于發(fā)酵起始時同時加入，以24 h為發(fā)酵周期，以20%的保留比例進入下一發(fā)酵周期，在后續(xù)各階段起始時補充加入非淀粉多糖酶制劑及苯甲酸進行連續(xù)發(fā)酵。

3）該工藝可在冬季（3～12 ℃）、春秋兩季（20 ℃）、夏季（37 ℃）溫度下進行，所得液態(tài)發(fā)酵飼料色澤淡黃，富有溫和的酸香味；飼料的pH值低于4.0，乳酸菌數(shù)量達到1010CFU/mL，同時霉菌、酵母、大腸桿菌無檢出；酸溶蛋白含量、酸溶蛋白/粗蛋白比值顯著提升（<0.05）。其中夏季（37 ℃）發(fā)酵更有利于飼料酸溶蛋白含量的提升。

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Continuous fermentation process of fermented liquid feed

Guan Xiaofeng1, Liu Zhiyun1,2, Xiao Rong1,2, Liu Zuohua1,2※

(1.,402460,; 2.,402460,)

This study aims to evaluate the effects of fermentation strain, retention ratio, fermentation temperature, exogenous benzoic acid, and exogenous enzyme preparation on fermentation process and the nutritional value of feeds, by means of monitoring the variations invarious indicators of liquid feed during fermentation, including the pH, the numbers of Lacticacid(LAB),(), mold, and yeast, acid-soluble protein content, and soluble sugar content. The experiment was performed using a corn-soybean-wheat bran mixture as the fermentation substrate, to select strains for producing liquid fermented feed. The results show that: 1) The selected LAB28-7 has strong ability in inhibitingand producing lactic acid. The pH value of feed dropped to 4.45 after 6 hours of fermentation, and thecannot be detected. 2) During the continuous fermentation with theLABstrain28-7, little difference showed in the effects on the pH or the numbers of LAB and mold in the fermented feed with retention ratio at 20%, 30% or 50%, and thewas not detected. Therefore, the retention ratio of 20% can ensure a good fermentation. 3) The addition of exogenous non-starch polysaccharide enzyme can significantly increase the acid-soluble protein content, acid-soluble protein/crude protein ratio, and soluble sugar content in the fermented feed (<0.05). The addition of exogenous benzoic acid can effectively inhibit moldmultiplication. 4) The acid-soluble protein and the acid-soluble protein/crude protein ratio significantly increased (<0.05) with the fermentation at 37℃. The pH values of feed at 3-12, 20, and 37 ℃ were less than 4.0. The LAB number was more than 1010CFU/mL. The, yeastand mold were not detected. The liquid fermentation technique was established in this study:(inoculation amount 1.0×108CFU/mL), non-starch polysaccharide enzyme (250 g/kg), and benzoic acid (0.1 g/kg) were simultaneously added at the beginning of fermentation. The production was proceeded with the fermentation period of 24 h, the retention ratio of 20%, and temperature at 3-12 ℃ (room temperature in winter), 20 ℃ (average room temperature in spring and autumn), and 37 ℃ (average room temperature in summer). The liquid fermented feed produced inthis process was light yellow in color, and rich in mild sour flavor; the pH value of feed was less than 4.0; the LAB number was more than 1010CFU/mL; the content of acid-soluble protein and the ratio of acid soluble protein to crude protein significantly increased (<0.05). The mold, yeast andwere not detected. Compared with spring, autumn and winter, the acid-soluble protein content can be more easily increased in summer production (<0.05).

feed; fermentation; process optimization

官小鳳，劉志云，肖融，等. 液態(tài)發(fā)酵飼料連續(xù)發(fā)酵工藝[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2020，36(21)：300-307. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.21.036 http://www.tcsae.org

Guan Xiaofeng, Liu Zhiyun, Xiao Rong, et al. Continuous fermentation process of fermented liquid feed[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(21): 300-307. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.21.036 http://www.tcsae.org

2020-06-15

2020-10-11

重慶榮昌農(nóng)牧高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)研發(fā)專項（19254）；國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFD0500600）

官小鳳，從事生物飼料研發(fā)與應(yīng)用研究。Email：13627609867@qq.com

劉作華，研究員，從事生物飼料研發(fā)與機理研究。Email：liuzuohua66@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.21.036

S825.5

A

1002-6819(2020)-21-0300-08