王俊鋒，陳偉豪，陳春梅，劉永宏

(1.中國科學院南海海洋研究所，中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，廣東省海洋藥物重點實驗室，廣東廣州 510301；2.南方海洋科學與工程廣東省實驗室(廣州)，廣東廣州 511458；3.中國科學院大學，北京 100049；4.廣西中醫(yī)藥大學，廣西南寧 530200)

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以語言、學習、記憶等認知能力受損為特征的慢性神經(jīng)退行性疾病，同時也是癡呆最常見的病因[1]。AD目前已是65歲以上的老齡人群發(fā)病率最高的神經(jīng)退行性疾病，而且隨著年齡的增加，AD的發(fā)病率也在逐漸增加。根據(jù)趨勢預測，到21世紀中葉，全球每85人就將出現(xiàn)1例AD病例[2]。目前的研究表明，AD的病理學特征主要是由細胞外的β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積產(chǎn)生的老年斑(Senile Plaques,SP)，以及在細胞內(nèi)由Tau蛋白的過度磷酸化導致的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(Neurofibrillary Trangles，NFTs)[3]。AD的病因以及發(fā)病機制尚不明確，但隨著研究的深入，目前已經(jīng)有一部分被廣泛接受的AD發(fā)病機制假說，其中包括Aβ沉積毒性、Tau蛋白異常磷酸化、基因突變、乙酰膽堿能缺失、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、自由基損傷、線粒體缺陷、激素缺乏、金屬離子與神經(jīng)元凋亡等假說[4-7]?，F(xiàn)階段已經(jīng)上市可用于治療AD的藥物(圖1)包括他克林(tacrine，1)(已停用)[8]、多奈哌齊(donepezil，2)、卡巴拉汀(rivastigmine，3)、加蘭他敏(galanthamine，4)、鹽酸美金剛胺(memantine hydrochloride，5)和石杉堿甲(huperzine A,6)(僅在中國上市)，這些藥都只能改善AD中輕度患者的癥狀，無法預防和治愈AD[9,10]。

真菌(Fungus)廣泛分布在自然界的各個角落，并且種類繁多、形態(tài)各異，是微生物三大類群之一。隨著天然產(chǎn)物研究學者的不斷努力，人們逐漸從不同來源的真菌中得到大量結(jié)構(gòu)新穎復雜且具有廣泛生物活性的次級代謝產(chǎn)物。真菌次級代謝產(chǎn)物的類型多為聚酮類、萜類、內(nèi)酯類、生物堿類、多糖類以及肽類等，其中多數(shù)表現(xiàn)出抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等生理活性[11,12]。目前已經(jīng)有不少學者有針對性地從分離鑒定到的真菌來源天然產(chǎn)物中，篩選出對治療AD有幫助的相關(guān)靶點活性，比如抗Aβ沉積活性、乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制活性、抗氧化應(yīng)激活性，以及神經(jīng)保護作用等[13]。

圖1 已上市抗AD藥物結(jié)構(gòu)

1 與抗Aβ沉積相關(guān)的真菌來源天然產(chǎn)物

Aβ是由淀粉樣前體蛋白(APP)在體內(nèi)代謝后生成的具有39—43個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。APP在β分泌酶和γ分泌酶的剪切加工下會形成Aβ40/42，其中Aβ42是AD患者腦內(nèi)SP的主要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，β分泌酶1(BACE1)的活性異常升高會導致AD患者腦內(nèi)產(chǎn)生大量的不溶性多肽Aβ42，而Aβ42的不斷沉積會啟動一個涉及Aβ沉積、炎癥、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元的損傷和凋亡等的級聯(lián)反應(yīng)，并最終形成斑塊[14]。

Penicitrinone A (7)和phenol A acid (8)是來源于一株深海真菌Aspergillussp.SCSIOW3的兩種橘霉素衍生物，利用硫黃素T (ThT)熒光模型進行抗Aβ42多肽聚集的活性篩選，結(jié)果顯示penicitrinone A在100 μmol/L濃度下具有與陽性藥表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)同等水平的相對抑制率，前者為(72.25±4.38)%，EGCG為(71.20±3.26)%；單倍體phenol A acid的相對抑制率則弱一些，為(40.33±6.33)%，可見真菌來源的橘霉素衍生物penicitrinone A具有較高的抗Aβ42多肽沉積活性，顯示其有抗AD的潛力[15]。Fang等[16]和Zhao等[17]從一株木霉菌Trichodermasp.HPQJ-34的發(fā)酵提取物中分離鑒定了新環(huán)戊烯酮化合物5-hydroxycyclopenicillone (9)，在體外實驗中發(fā)現(xiàn)其可以顯著降低Aβ多肽低聚物纖維化，同時具有清除2,2-二苯基-1-甲基肼自由基的能力，并從SH-SY5Y細胞中觀察到其可以顯著降低H2O2誘導的細胞毒性，這些證據(jù)表明5-hydroxycyclopenicillone可以從抗Aβ沉積和抗氧化應(yīng)激兩方面保護神經(jīng)元細胞。

苯并呋喃類化合物被證實可以作為γ-分泌酶、BACE1、Tau蛋白錯誤折疊和Aβ聚集的抑制劑，對AD的治療具有良好應(yīng)用前景[18]。但是研究者們多采用合成的苯并呋喃類化合物來測試活性，真菌來源的天然苯并呋喃鮮有抗AD相關(guān)活性的報道。2018年，González-Ramírez等[19]對來自Aleurodiscusvitellinus的苯并呋喃衍生物fomannoxin (10)進行抗Aβ聚集活性測試，結(jié)果顯示fomannoxin可以在1 μmol/L的濃度下對抗5 μmol/L Aβ造成的細胞毒性，神經(jīng)元PC12細胞存活率達100%；更深入的試驗發(fā)現(xiàn)，fomannoxin通過干擾Aβ與細胞質(zhì)膜的結(jié)合，從而達到消除Aβ介導的細胞毒性的目的。

Asperterpenes A (11)和B (12)是來源于曲霉Aspergillusterreus的新骨架二萜類化合物，可在體外抑制BACE1，其半數(shù)抑制濃度(50% Inhibitory Concentration,IC50)分別為78和59 nmol/L，活性均優(yōu)于陽性對照LY2811376 (IC50=260 nmol/L)；在AD模型小鼠體內(nèi)，asperterpene A表現(xiàn)出與LY2811376相似的抑制BACE1活性，降低了Aβ的產(chǎn)生[20]。

以上化合物的化學結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 具有抗Aβ活性的化合物結(jié)構(gòu)(7—12)

2 與乙酰膽堿酯酶抑制劑相關(guān)的真菌來源天然產(chǎn)物

乙酰膽堿能缺失假說是AD發(fā)病假說中最經(jīng)典的假說。乙酰膽堿是神經(jīng)系統(tǒng)中非常重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，能與學習和記憶相關(guān)的受體結(jié)合發(fā)揮作用。膽堿酯酶主要作用是分解神經(jīng)突觸間隙的膽堿能，終止膽堿與突觸后膜的相互作用。根據(jù)作用底物的特異性，膽堿酯酶可分為乙酰膽堿酯酶(AChE)和丁酰膽堿酯酶(BuChE)。乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEI)可以抑制AChE，減少乙酰膽堿的分解，提高乙酰膽堿在突觸間隙的含量，增強膽堿能傳遞，保護神經(jīng)元[21]。目前已經(jīng)上市的抗AD藥物，除了鹽酸美金剛胺，其余皆為AChEI。因此，尋找可靠有效的AChEI也是抗AD藥物開發(fā)的一大方向。

2006年，Houghton等[22]綜述了來源于植物和真菌的具有抑制膽堿酯酶活性的天然產(chǎn)物，以下討論從2007至今所報道的部分來源于真菌的膽堿酯酶抑制劑(圖3)。

Xyloketal A (13)是來源于一株南海紅樹林真菌Xylariasp.的聚酮類化合物，其在1.5 μmol/L的濃度下對AChE表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.01)[23]。從另外一株紅樹林內(nèi)生真菌Sporothrixsp.#4335中分離得到的，具有罕見骨架的聚酮類化合物sporothrin A (14)，在體外也表現(xiàn)出較強的抑制AChE活性，IC50為1.05 μmol/L[24]。聚酮類化合物13-hydroxypalitantin (15)和(+)-palitantin (16)來源于紅樹林內(nèi)生真菌Penicilliumsp.sk14JW2P，體外AChE抑制活性測試顯示其具有顯著的抗AChE活性，IC50分別為(12±0.3)和(79±2) nmol/L[25]。

來源于植物內(nèi)生真菌Aspergillusterreus的吲哚類生物堿16α-hydroxy-5N-acetylardeemin (17)，具有與陽性藥他克林相當?shù)囊种艫ChE活性，前者IC50為(58.3±3.3) μmol/L，后者IC50為(37.9±3.8) μmol/L[26]。另外兩個來源于CortinariusinfractusBerk的生物堿infractopicrin (18)和10-hydroxy-infractopicrin (19)同樣具有抑制AChE活性(IC50分別是9.72和12.7 μmol/L)，其活性與加蘭他敏相當(IC50為8.70 μmol/L)[27]。從一株海洋來源的曲霉屬真菌AspergillusterreusSCSGAF0162發(fā)酵提取物中分離鑒定到的兩個內(nèi)酯類territrem衍生物(20和21)，展現(xiàn)出比陽性藥石杉堿甲更強的AChE抑制活性，前兩者IC50分別為(4.2±0.6)和(4.5±0.6) nmol/L，后者IC50為(39.3±7.6) nmol/L[28]。來源于另一株海洋曲霉屬真菌Aspergillusterreus(No.GX7-3B)的anhydrojavanicin (22)、8-O-methylbostrycoidin (23)和環(huán)肽beauvericin (24)，這3個化合物皆對α-AChE有顯著的抑制活性，IC50分別為2.01，6.71和3.09 μmol/L[29]。Wang等[30]從一株來源于西沙海綿的共附生節(jié)菱孢菌ArthriniumarundinisZSDS1-F3中，分離鑒定了兩個具有抗AChE活性的萘環(huán)吡啶酮生物堿(25和26)，IC50分別為47和0.81 μmol/L。

圖3 具有抗AChE活性的化合物結(jié)構(gòu)(13—26)

3 與抗神經(jīng)炎癥相關(guān)的真菌來源天然產(chǎn)物

神經(jīng)炎癥是AD患者腦內(nèi)主要病理特征之一，是一種復雜的腦損傷反應(yīng)，涉及膠質(zhì)細胞的激活，炎癥介質(zhì)如細胞因子和趨化因子的釋放,以及活性氧、活性氮的生成。正常情況下，腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞可以檢測腦內(nèi)異常情況，清除有害因子，防止大腦損傷。在AD發(fā)病進程中，Aβ的異常沉積導致小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞被持續(xù)異常激活，逐漸分泌白細胞介素(IL，包括IL-1β和IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF，包括TNF-α和TNF-γ)等細胞炎癥因子，誘導神經(jīng)炎癥的產(chǎn)生，最終造成神經(jīng)元細胞損傷或者凋亡[31,32]。此外膠質(zhì)細胞分泌產(chǎn)生的環(huán)氧合酶-2(COX-2)和一氧化氮合酶(iNOS)會促進神經(jīng)元細胞的氧化應(yīng)激水平，進一步損傷神經(jīng)元細胞。有研究表明，細胞因子IL-17在AD神經(jīng)炎癥早期階段活化膠質(zhì)細胞，對神經(jīng)系統(tǒng)可能起保護作用，但是在AD神經(jīng)炎癥晚期階段，膠質(zhì)細胞持續(xù)活化，在IL-17的參與下會誘導神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡，加重AD的病理損傷。因此，調(diào)控IL-17信號通路的關(guān)鍵因子可能成為有前景的AD治療新靶點[33]。

Chen等[34]從一株深海來源的青霉屬真菌PenicilliumchrysogenumSCSIO41001的發(fā)酵提取物中，分離得到具有抗促炎因子IL-17表達活性的chrysamide C (27)，活性測試表明，在10 μmol/L的濃度下，抑制率可達(62.61±0.55)%。Yang等[35]從一株分離自南海沿岸沉積物的真菌AspergillusterreusY10的培養(yǎng)液乙酸乙酯萃取物中，分離得到丁烯內(nèi)酯類化合物28和29，將BV-2小膠質(zhì)細胞與這兩個化合物(10 μg/mL)預孵育1 h，然后用脂多糖(LPS)誘導6 h，檢測TNF-α的產(chǎn)生作為細胞活化的標志，同時細胞毒測試表明化合物對BV-2小膠質(zhì)細胞無毒性作用，在這種情況下，化合物28和29對TNF-α產(chǎn)生的抑制率分別達55.1%和35.5%；在0.6—40.0 μg/mL濃度下，化合物28和29的IC50分別為(7.6±1.1)和(9.90±1.06) μg/mL。來源于另外一株珊瑚內(nèi)生真菌Aspergillusterreus的丁內(nèi)酯Ⅰ (butyrolactone-Ⅰ)(30)，可降低LPS誘導BV-2小膠質(zhì)細胞造成的炎癥反應(yīng)，同時還可以降低NO和IL-1β的產(chǎn)生；分子印跡和分子對接實驗表明，丁內(nèi)酯Ⅰ能通過抑制炎癥信號通路NF-κB相關(guān)因子的磷酸化從而抑制神經(jīng)炎癥，同時丁內(nèi)酯Ⅰ也是COX-2的潛在抑制劑[36]。除丁內(nèi)酯Ⅰ外，一系列丁內(nèi)酯類衍生物(31—37)也表現(xiàn)出抑制NO生成的活性。研究人員利用LPS在小鼠RAW264.7巨噬細胞內(nèi)誘導NO的產(chǎn)生作為指標，將巨噬細胞與化合物孵育后檢測各自的NO抑制率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在20 μmol/L濃度下，化合物31和32的NO抑制率分別達25.1%和25.3%[37]；而化合物33-37抑制NO的IC50為16.80-45.37 μmol/L[38]。

以上化合物的化學結(jié)構(gòu)見圖4。

圖4 具有抗神經(jīng)炎癥活性的化合物結(jié)構(gòu)(27—37)

前列腺素E2(PGE2)的水平升高也與腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，其可以通過與4種不同G蛋白偶聯(lián)受體共同介導小膠質(zhì)細胞的旁分泌神經(jīng)毒性，使小膠質(zhì)細胞分泌活動異常[39]。Kim等[40]從曲霉屬Aspergillussp.SF-5974和Aspergillussp.SF-5976的液體共培養(yǎng)發(fā)酵物中，分離鑒定出一個新穎的二氫異香豆素(38)，活性測試發(fā)現(xiàn)其能通過抑制iNOS和COX-2的表達，從而抑制LPS誘導的NO和PGE2的釋放。對靶點iNOS和COX-2具有抑制活性的真菌代謝產(chǎn)物還有聚酮類化合物phomaketide C (39)[41]、tanzawaic acid Q(40)[42]、diaporindenes A—D(41—44)[43]、9-O-methylneuchromenin(45)[44]，苯甲醛衍生物asperanins A—C (46—48)以及二酮哌嗪生物堿5-prenyl-dihydrorubrumazine A(49)[45]。以上化合物抑制NO或者PGE2釋放的IC50為4.2—28.2 μmol/L，具有發(fā)展成抗神經(jīng)炎癥的先導藥物的前景(圖5)。

圖5 具有抗神經(jīng)炎癥活性的化合物結(jié)構(gòu)(38—49)

4 與抗氧化活性相關(guān)的真菌來源天然產(chǎn)物

在AD的發(fā)病進程中，Aβ通過刺激神經(jīng)元細胞產(chǎn)生大量的氧自由基，造成腦部細胞成分中的脂質(zhì)和蛋白被氧化，活性氧的含量增加；或者由于神經(jīng)炎癥導致活性氧和活性氮含量增加令腦組織產(chǎn)生損傷。具有抗氧化活性的化合物可以清除氧自由基或者防止活性自由基的產(chǎn)生。

從一株赤散囊菌EurotiumrubrumHiji025中分離出的neoechinulin A(50)被證實具有神經(jīng)保護作用，其能夠使神經(jīng)元PC12細胞免受過氧硝酸鹽生成劑3-morpholino-sydnonimine (SIN-1)誘導的細胞毒性[46]。研究發(fā)現(xiàn)，neoechinulin A主要是對抗由NO或者NO生成劑(如SIN-1)導致的亞硝化應(yīng)激，而不是類似H2O2引起的氧化應(yīng)激，并且neoechinulin A需要高濃度才可以起到神經(jīng)保護活性[47]。利用同樣的方法，兩個帶乙烯基炔烴的對苯二酚衍生物pestalotioquinols A (51)和B (52)，也被證實可以使神經(jīng)生長因子誘導分化的PC12細胞免受SIN-1誘導的細胞毒作用[48]。Kanno等[48]通過構(gòu)效分析發(fā)現(xiàn)，對苯二酚基團對pestalotioquinols A和B的神經(jīng)保護活性具有重要作用，如果羥基被甲氧基取代，活性將大大降低，并且pestalotioquinols A和B能在1—3 μmol/L濃度下發(fā)揮作用，活性遠遠大于neoechinulin A，表明pestalotioquinols A和B在開發(fā)抗AD藥物方面具有更大的前景。此外，來源于紅樹林內(nèi)生真菌Xylariasp.的xyloketal B (53)，被證實在體外可以防止氧化低密度脂質(zhì)蛋白導致的細胞損傷[49]，通過抑制產(chǎn)生ROS和活性氮的酶及增強抗氧化酶來降低自由基水平[50]，防止自由基過高損傷細胞；增加抗凋亡蛋白的表達來抑制線粒體損傷和細胞凋亡的啟動；同時xyloketal B對缺糖誘導損傷的PC12細胞也表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用活性[51]。Xyloketal B是研究較多的、具有多靶點抑制活性的真菌來源天然產(chǎn)物，有廣闊的成藥前景。

以上化合物的化學結(jié)構(gòu)見圖6。

圖6 具有抗氧化活性的化合物結(jié)構(gòu)(50—53)

5 與神經(jīng)營養(yǎng)活性相關(guān)的真菌來源天然產(chǎn)物

健康神經(jīng)元的活性是由神經(jīng)營養(yǎng)素促進和維持的，神經(jīng)營養(yǎng)素往往參與多個神經(jīng)元生理過程的調(diào)節(jié)，包括神經(jīng)元的存活、軸突的生長以及神經(jīng)干細胞的分化等[52]。神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor，NGF)是第一個發(fā)現(xiàn)的，也是最具特征的神經(jīng)營養(yǎng)素。其他神經(jīng)營養(yǎng)素家族成員包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3 (NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)素-4/5 (NT-4/5)、神經(jīng)營養(yǎng)靶標的調(diào)節(jié)劑如NGF受體酪氨酸蛋白激酶A (Tyrosine Kinase A，TrkA)等，對于治療包括AD在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病都具有巨大的潛力[53]。目前已有不少天然產(chǎn)物被報道具有類神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，可以促進神經(jīng)元細胞生長和分化[54]。其中來源于Penicilliumfellutanum的天然產(chǎn)物fellutamide B (54)，能夠誘導成纖維細胞和膠質(zhì)細胞釋放NGF，其作用機理是通過抑制蛋白酶體，促進NGF的基因表達[55]。從Acremoniumsp.TF-0356發(fā)酵液中分離得到的聚酮類化合物NGA0187(55)，在30 μg/mL的濃度下具有誘導PC12細胞突觸生長的作用，活性與NGF相當[56]。同樣地，來源于菌株P(guān)aecilomycesfarinosusRCEF 0101的兩個生物堿farinosones A (56)和C (57)，在50 μmol/L濃度下也表現(xiàn)出增強PC12細胞突觸生長的營養(yǎng)活性，而且在此濃度下沒有觀察到對PC12細胞具有細胞毒活性，但是神經(jīng)營養(yǎng)活性低于NGF[57]。Paecilomycesmilitaris來源的生物堿類化合物militarinone在2002年就被證實具有神經(jīng)營養(yǎng)活性，其中militarinone A (58)的活性最高，在10 μmol/L濃度下就可以促進PC12細胞的突觸生長，且沒有表現(xiàn)出細胞毒活性[58]。Militarinone A的脫羥基衍生物(+)-N-deoxymilitarinone (59)則需要在100 μmol/L濃度下才能表現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)活性，但該濃度下其對人神經(jīng)元細胞IMR-32表現(xiàn)出細胞毒性[59]。Militarinones B (60)和C (61)的神經(jīng)營養(yǎng)活性更弱，在100 μmol/L的濃度下只能邊緣性增強PC12細胞的突觸生長[60]。

一系列異戊二烯色氨酸來源的生物堿(62-68)從一株米曲霉大米培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到，并且同時表現(xiàn)出神經(jīng)保護活性和神經(jīng)營養(yǎng)活性；在100 μmol/L濃度下，化合物63，64和66—68可以對抗PC12細胞中H2O2誘導的氧化應(yīng)激，將細胞存活率從47.29%提高至70.16%-90.85%；在25—100 μmol/L濃度下，化合物62—68均能促進未分化的PC12細胞軸突的生長，表現(xiàn)出神經(jīng)營養(yǎng)活性[61]。

以上化合物的化學結(jié)構(gòu)見圖7和圖8。

圖7 具有神經(jīng)營養(yǎng)活性的化合物結(jié)構(gòu)(54—61)

圖8 具有神經(jīng)營養(yǎng)活性的化合物結(jié)構(gòu)(62—68)

6 展望

AD的發(fā)病機制尚不明確，涉及因素眾多，給抗AD藥物的篩選帶來非常大的挑戰(zhàn)和困難。所以，深入了解AD病理特征，探索更多有效的治療靶點，建立能更好模擬AD病理特征的生物學模型，優(yōu)化藥物篩選途徑，尋找多靶標抑制劑等，將是科研工作者未來努力的重要方向。真菌種類繁多，且能夠產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)獨特、活性新穎的次級代謝產(chǎn)物，是尋找治療各種疾病先導藥物的巨大寶庫。已在我國上市的抗AD藥物石杉堿甲，是從我國中草藥蛇足石杉(Huperziaserrata)中提取分離到的一種強活性倍半萜類生物堿，具有很強的抗AChE活性、抗氧化應(yīng)激，抑制Aβ沉積和上調(diào)抗凋亡蛋白等多重神經(jīng)保護作用[62]。近幾年來，已有不少學者從蛇足石杉或其他植物中分離得到多種具有產(chǎn)石杉堿甲能力的內(nèi)生真菌，如Fusariumsp.Rsp5.2和FusariumoxysporumNSG-1等[63-66]。未來可以設(shè)計培育石杉堿甲高產(chǎn)菌株，通過發(fā)酵條件優(yōu)化達到工業(yè)生產(chǎn)水平。研究此類內(nèi)生真菌還可以獲得石杉堿甲衍生物，為篩選新的抗AD藥物提供很大可能性。這同時預示著真菌來源的天然產(chǎn)物將來會是尋找抗AD藥物的一個新領(lǐng)域，相信隨著分離技術(shù)和活性篩選技術(shù)的不斷發(fā)展和進步，會有更多的具有抗AD活性的真菌天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，為人類社會解決AD這一世界難題提供新動力。