甘雨滿，黃炳耀，唐振洲，林 霄，高程海

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院，廣西南寧 530200)

0 引言

傳統(tǒng)抗生素的無節(jié)制使用，導(dǎo)致病原菌抗藥性問題日益突出，挖掘新型結(jié)構(gòu)、高活性的抗生素已成為解決病原菌抗藥性問題的重要手段。隨著從陸地資源挖掘新型化合物的潛力下降，人們逐漸將目光轉(zhuǎn)向海洋生物資源，種群豐富的海洋微生物將是挖掘新型化合物的聚寶盆。海洋生境是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其高鹽、無光、低溫(局部高溫)、低營養(yǎng)及高壓的特殊環(huán)境孕育了海洋生物物種的多樣性。物種種類優(yōu)勢以及復(fù)雜的海洋環(huán)境造就了微生物獨特的代謝方式，賦予了人類從海洋微生物獲取新型化合物的可能。截至2017年，已完成分離鑒定的海洋微生物來源的新型天然產(chǎn)物達(dá)1 490種，來源微生物集中在細(xì)菌、霉菌、放線菌和藍(lán)藻[1]。二十四元大環(huán)內(nèi)酯化合物Macrolactins (MLNs)主要來源于海生Bacillussp.和Actinomadurasp.，包含超過32種Macrolactin (MLN)單體化合物[2]。自Fenical首次從深海芽孢桿菌中分離鑒定MLN A-F 6種單體以來，MLNs因具備抗病毒、抗腫瘤和抗病菌等多種生物抑制活性而備受關(guān)注。MLN A 除了可抑制HIV外，還對哺乳動物皰疹病毒和腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出抑制作用；MLN F 對鯊烯合成酶具有抑制作用，可作為調(diào)控膽固醇水平的潛在藥物[3,4]。在抑菌活性方面，MLN W可有效抑制革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌[5]。MLN T不僅能夠?qū)ΤＲ姴≡图籽跷髁纸瘘S色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus)表現(xiàn)出抑制作用，而且對植物致病菌交鏈孢(Alternariaspp.)和稻瘟霉(Pyriculariaoryzae)也表現(xiàn)出較明顯的抑制效果[6]。可見MLNs是一類具有廣譜生物抑制活性的化合物，在治療疾病、防治農(nóng)業(yè)病蟲害生物等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用潛力[7]。但野生菌株代謝產(chǎn)生的MLNs產(chǎn)量較低，限制了該類化合物的進(jìn)一步研究。 鑒于此，本文對MLNs生物合成研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，包括MLNs合成基因簇、代謝菌株遺傳改造、發(fā)酵工藝優(yōu)化等，以期為MLNs的批量生產(chǎn)提供研究資料。

1 MLNs合成基因簇

MLNs是一類聚酮化合物，是由生物體通過聚酮合酶(Polyketide Synthase,PKS)基因簇逐級縮合產(chǎn)生的天然化合物。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的差異，PKS酶系可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型PKS是由多個模塊按線性排列而成的酶催化體系，每個模塊含有一個特有的催化結(jié)構(gòu)域，常用來催化形成具有大環(huán)結(jié)構(gòu)的硫酯化合物[8]；Ⅱ型PKS是一個多功能酶復(fù)合體，由一套獨立的4—6個可重復(fù)使用的酶組成，每一種酶在重復(fù)的反應(yīng)步驟中可多次催化相同的反應(yīng)[9]；Ⅲ型PKS與前兩種類型的明顯區(qū)別是，可在不需要ACP的情況下直接催化泛酞輔酶A的縮合[10]。

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，生物遺傳密碼被不斷破譯[11]。Borriss 研究團(tuán)隊通過分析BacillusamyloliquefaciensFZB42基因組，首次確認(rèn)了Ⅰ型PKS基因簇參與MLNs合成[12]。整個基因簇大小約54 kb，共由11個重復(fù)模塊組成，每個模塊至少包括酰基轉(zhuǎn)移酶、酮基合成酶和?；d體蛋白3個元件。每個元件在 MLNs碳骨架的合成過程中承擔(dān)著不同的生物功能：?；D(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)底物的激活和運轉(zhuǎn)，酮基合成酶負(fù)責(zé)延伸聚酮鏈，?；d體蛋白負(fù)責(zé)將完成延伸2個碳原子的聚酮鏈運轉(zhuǎn)到下一模塊。MLNs聚酮鏈的合成過程與脂肪酸碳骨架的合成過程類似，具體過程如下：延伸單元丙二酰輔酶A被?；D(zhuǎn)移酶激活后，在酮基合成酶作用下，激活態(tài)的丙二酰輔酶A與酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的底物分子發(fā)生克萊森(Claisen)反應(yīng)，底物延伸2個碳原子；延伸產(chǎn)物由?；d體蛋白運轉(zhuǎn)到下一模塊的酰基載體蛋白，完成一次二碳單元的延伸。經(jīng)過11輪重復(fù)“激活、延伸、運轉(zhuǎn)”3個步驟，完成二十四元環(huán)骨架的合成(圖1)。隨后，脫水酶、酮還原酶、烯醇還原酶進(jìn)一步對二十四元環(huán)骨架側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾，修飾模塊多樣化決定了MLNs化合物結(jié)構(gòu)的多樣化[13]。

圖1 Macrolactin A生物合成基因簇[12]

2 PKS基因簇多樣化

PKS基因簇根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，各類型的PKS基因簇由于序列、調(diào)控元件等因素差異也呈現(xiàn)多樣化狀態(tài)。海洋生態(tài)系統(tǒng)中微生物種類豐富，孕育著多樣化的基因資源，董曉毅[14]根據(jù)Ⅰ型PKS保守序列設(shè)計簡并引物，擴(kuò)增海水、沿岸土壤、海洋沉積物等不同生境的微生物基因組，獲得多樣化的Ⅰ型PKS，為挖掘新型結(jié)構(gòu)的MLNs化合物提供理論基礎(chǔ)。在PKS結(jié)構(gòu)分析過程中，研究者發(fā)現(xiàn)酮縮合酶(KS)片段可能來源于PKS-NRPS雜合基因簇，Moffitt等[15]研究表明，PKS-NRPS雜合基因簇的KS結(jié)構(gòu)域在活性半胱氨酸N-末端方向的第三個氨基酸殘基被谷氨酰胺替代，突變后的KS可以以氨基酸作為起始單元參與生物合成。據(jù)文獻(xiàn)報道，PKS-NRPS雜合基因簇包括兩種類型，一是整體PKS模塊和整體NRPS模塊相連接(介導(dǎo)雜合化合物的合成)，二是由PKS和NRPS的單一模塊交替相接形成雜合體[14]。由于PKS-NRPS雜合基因簇的特殊性，對PKS-NRPS雜合基因簇的深入研究將有利于新型MLNs化合物的挖掘[16]。

此外，陸生和海生微生物PKS基因簇也表現(xiàn)出差異，宋婧文[17]對陸生和海生MLNs代謝菌株的基因組進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)海生微生物PKS基因簇啟動子區(qū)缺失25個堿基，根據(jù)MLNs代謝水平與代謝時間的線性關(guān)系，研究者推斷這段缺失序列可能參與MLNs合成調(diào)控。

3 人工設(shè)計PKS基因簇

PKS各個模塊按線性排列，每個模塊均具有特定的生物學(xué)功能，PKS模塊重排有利于合成“人工設(shè)計”的天然產(chǎn)物。在酮基合成酶作用下，激活態(tài)的丙二酰輔酶A與酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的底物分子發(fā)生克萊森反應(yīng)，底物延伸2個碳原子，通過多次的克萊森反應(yīng)完成目標(biāo)化合物的碳骨架延伸，最后在硫酯酶的作用下長鏈碳骨架閉環(huán)合成環(huán)形結(jié)構(gòu)?？梢?，PKS模塊的排列順序決定了化合物骨架的碳原子數(shù)目和結(jié)構(gòu)，同理，改變這些模塊的排列順序也可導(dǎo)致新化合物的生成[18]。PKS模塊這種一一的對應(yīng)關(guān)系，為編輯PKS基因簇基因(具體操作包括結(jié)構(gòu)域或模塊的互換、突變、插入、刪除)提供了可能。但是對PKS的模塊編輯面臨不少問題[18-20]，一是對野生菌株而言導(dǎo)入目的DNA片段具有一定挑戰(zhàn)性，尤其是部分不可培養(yǎng)或者生長極其緩慢的菌株；二是PKS基因簇具有不易操作性，具體表現(xiàn)為基因簇往往太長(35-200 kb)、沒有保守位點，以及模塊重復(fù)不利于定點編輯。針對PKS基因簇不易操作性難題，Menzella等[18]在模塊和結(jié)構(gòu)域兩端插入限制性酶切位點，模塊間或結(jié)構(gòu)域間通過限制性酶切位點重新組合，高效獲得重構(gòu)PKS基因簇(圖2)，接近一半的重構(gòu)基因簇表現(xiàn)出正常的基因簇生物學(xué)功能，并獲得結(jié)構(gòu)多樣的化合物。

圖2 PKS模塊組裝[18]

限制性酶切位點策略很好地解決了PKS基因簇重構(gòu)的難題，但在天然宿主菌種中表達(dá)PKS基因簇，產(chǎn)量往往較低,不利于檢測和后續(xù)的生物學(xué)研究。異源表達(dá)是快速、高效表達(dá)目的基因的重要手段，常用的異源表達(dá)宿主菌包括枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、畢赤酵母等，這些異源宿主菌具有易于培養(yǎng)、遺傳背景清晰、遺傳操作技術(shù)成熟等優(yōu)勢，便于構(gòu)建異源表達(dá)工程菌株。除此之外，PKS基因簇異源表達(dá)載體構(gòu)建需要考慮的因素包括選擇具備相當(dāng)容量的載體、密碼子優(yōu)化等問題。目前已成功表達(dá)PKS基因簇的異源宿主菌包括酵母菌、大腸桿菌、天藍(lán)色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、弗氏鏈霉菌、糖多孢紅霉菌等[14]。

4 從遺傳水平調(diào)控MLNs生物合成

從遺傳水平對微生物的MLNs合成途徑進(jìn)行調(diào)控，一方面可以挖掘新型結(jié)構(gòu)的MLNs化合物，另一方面也是提高已知MLNs化合物代謝水平的主要手段。高效的遺傳轉(zhuǎn)化手段是進(jìn)行遺傳操作的重要基礎(chǔ)，但和實驗室菌株相比較，從環(huán)境中篩選獲得的野生微生物由于細(xì)胞壁構(gòu)造特殊且遺傳背景不清晰，適用于實驗室菌株的遺傳操作技術(shù)對于其往往效率低下。針對野生菌株重新建立一套高效的遺傳操作技術(shù)對于微生物遺傳育種而言是必要的。Liu等[21]對一株產(chǎn)MLNs的海洋芽孢桿菌遺傳轉(zhuǎn)化參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，通過評價轉(zhuǎn)化體系、培養(yǎng)基、目的DNA去甲基化、滲透壓保護(hù)劑以及其他化學(xué)成分對海洋芽孢桿菌遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，首次建立了海洋芽孢桿菌的高效轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)7.1×104cfu/μg質(zhì)粒，為MLNs代謝菌株遺傳改造奠定了重要基礎(chǔ)。

Borriss研究組于2007年首次闡明了MLNs合成基因簇[12]，但一直以來其分子調(diào)控機(jī)理并不清晰，合成關(guān)鍵基因也鮮有報道，阻礙了從遺傳水平定向調(diào)控MLNs生物合成的研究進(jìn)程。MLNs合成模塊中，反式?；D(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)延伸單元丙二酰輔酶A的運轉(zhuǎn)，理論上提高丙二酰輔酶A的運轉(zhuǎn)速率有利于提高M(jìn)LNs合成水平。劉揚等[22]過度表達(dá)反式?；D(zhuǎn)移酶BmmA，結(jié)果顯示MLNs A的產(chǎn)量提高了約0.6倍，說明丙二酰輔酶A基因在MLNs生物合成過程中參與調(diào)控MLNs代謝。改變PKS基因簇主要元件的表達(dá)水平可調(diào)控MLNs代謝水平，改變修飾元件的表達(dá)水平也能影響MLNs的代謝。BmmGT1基因負(fù)責(zé)海洋芽孢桿菌B-9987的MLNs代謝產(chǎn)物的糖基化修飾，BmmGT1基因過度表達(dá)后，非糖基化MLNs水平迅速降低，并獲得5種糖基化的MLNs衍生物[23]。

MLNs生物合成過程的調(diào)控機(jī)制和主要關(guān)鍵基因尚不清晰，不利于應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建優(yōu)良工程菌株。傳統(tǒng)微生物育種手段，如誘變[24]、適應(yīng)性馴化[25,26]、Genome shuffling[27]等，其突出優(yōu)點是不需要對目標(biāo)菌株遺傳背景有清晰的了解。Yi等[28]運用ARTP誘變育種技術(shù)對海洋芽孢桿菌進(jìn)行誘變，基于菌株的生長系數(shù)篩選獲得優(yōu)良突變菌，其MLNs代謝水平提高52.8%。研究者進(jìn)一步對突變菌株轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究，156個差異表達(dá)基因主要涉及5個生物過程，包括組氨酸代謝、核黃素代謝、非核糖體肽結(jié)構(gòu)、脂肪酸降解和脂肪酸代謝。這些基因組學(xué)研究數(shù)據(jù)為探索MLNs代謝調(diào)控機(jī)制提供了理論支撐，其中特別值得關(guān)注的生物途徑是脂肪酸代謝，因為細(xì)胞膜脂肪酸在提高細(xì)胞抗生素抗性方面發(fā)揮重要作用[29,30]。MLNs是一類廣譜抗生素，當(dāng)其濃度累積到一定程度后將不可避免地影響代謝菌株的生理狀態(tài)，而提高細(xì)胞膜脂肪酸濃度可能有利于高濃度的MLNs積累。

5 發(fā)酵優(yōu)化提高M(jìn)LNs代謝水平

野生菌株的MLNs代謝水平低，成為制約其進(jìn)行藥物開發(fā)研究的主要瓶頸。微生物培養(yǎng)法獲得大量目標(biāo)化合物需要滿足兩個基本條件：獲得代謝性能優(yōu)良的菌株和擴(kuò)大培養(yǎng)。擴(kuò)大培養(yǎng)的效果常受培養(yǎng)基組分、溶氧、pH值、溫度等因素的影響，因此基于實驗結(jié)果和經(jīng)濟(jì)因素考慮，在開展擴(kuò)大培養(yǎng)前需要對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面法是發(fā)酵優(yōu)化的常用技術(shù)手段，在提高M(jìn)LNs產(chǎn)量方面也取得比較理想的結(jié)果[31-34]，目前已報道的MLNs發(fā)酵優(yōu)化最高產(chǎn)量為851 mg/L[35]。

微生物只有進(jìn)入生長穩(wěn)定期才開始大量合成聚酮化合物，然而進(jìn)入穩(wěn)定期后，細(xì)胞對初級代謝產(chǎn)物的需求顯著下降[36]，此時作為初級代謝產(chǎn)物的中間代謝產(chǎn)物丙二酰輔酶A是否與MLNs的合成存在直接聯(lián)系，尚未明確。王明璐[34]嘗試在培養(yǎng)基中添加乙酸鈉、丙酸鉀營養(yǎng)成分，通過生物轉(zhuǎn)化以維持胞內(nèi)丙二酰輔酶A濃度，但MLNs產(chǎn)量并未受到影響，而添加低濃度的豆油則能明顯促進(jìn)MLNs代謝。Wang等[36]結(jié)合基因組學(xué)研究闡明豆油和聚酮化合物合成間的直接聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)菌株在對數(shù)期細(xì)胞生長的同時還積累三酰甘油(豆油主成分)，進(jìn)入穩(wěn)定期后胞內(nèi)三酰甘油降解機(jī)制被激活，為穩(wěn)定期細(xì)胞的聚酮化合物合成提供前體化合物以及還原力。

6 展望

MLNs具有廣譜生物抑制活性，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)具有潛在的應(yīng)用前景。目前針對改善菌株MLNs代謝水平的相關(guān)問題已開展了部分工作，但受限于MLNs代謝調(diào)控機(jī)制、關(guān)鍵基因不清晰，菌株MLNs代謝水平低的局面至今仍然沒有得到改善，一定程度上限制了MLNs的生物活性研究以及市場推廣。Ⅰ型PKS基因簇由多個模塊組成，這些基因共同受一個操縱子調(diào)控表達(dá)。因此，對操縱子的關(guān)鍵元件(如啟動子)進(jìn)行改造，通過改造一個位點實現(xiàn)對整個PKS基因簇的表達(dá)進(jìn)行定向調(diào)控，這方面的研究有望進(jìn)一步改善MLNs代謝水平，也能避免PKS基因簇基因元件因重復(fù)性而不利于遺傳操作、可能涉及的多位點操作等難題。