楊 斌，龍潔怡,2，劉永宏，2，3**

(1.中國科學(xué)院南海海洋研究所，中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510301；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530200)

0 引言

炎癥是免疫系統(tǒng)對外部挑戰(zhàn)或組織損傷的一種普遍、復(fù)雜和有益的生理反應(yīng)，可以恢復(fù)組織結(jié)構(gòu)和功能。炎癥反應(yīng)的發(fā)生有助于傷口治愈，但當(dāng)炎癥過激或不可控時(shí)，異常而長時(shí)間的炎癥反應(yīng)將引發(fā)多種疾病。由免疫細(xì)胞活性氧物質(zhì)引起的基因突變，以及炎癥反應(yīng)中涉及的炎癥介質(zhì)，可能會(huì)引發(fā)許多疾病，例如癌癥、多發(fā)性硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、心臟疾病、胰島素抵抗等[1]。因此，研究抑制炎癥介質(zhì)的過度產(chǎn)生是治療這些疾病的有力策略。目前臨床常用的抗炎藥主要有甾體類抗炎藥、非甾體抗炎藥和生物制劑，但這些藥物都有一定的副作用，所以在臨床使用上受到限制。

海洋生物為了更好地適應(yīng)極端的生存環(huán)境，形成獨(dú)特的遺傳系統(tǒng)和生物合成途徑，并產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新穎、生物活性豐富的次級代謝物[2]，為藥物開發(fā)開辟了新的前景，越來越多的候選藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)或已批準(zhǔn)上市[3]。其中，多肽因具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)、活性高、分子量小、靶向性強(qiáng)、毒性低、易于跨膜吸收等特點(diǎn)被廣泛研究，并且許多化合物已被證實(shí)具有抗真菌、抗病毒和抗增殖等作用[4]。但迄今為止從海洋棲息地中發(fā)現(xiàn)抗炎肽的例子還很少，海洋來源的具有特殊細(xì)胞靶標(biāo)的新型生物活性肽的發(fā)現(xiàn)，可能有助于尋找有前途的先導(dǎo)藥物或候選藥物[5,6]。本文綜述了自20世紀(jì)90年代以來，具有治療炎癥相關(guān)疾病潛力的海洋來源活性肽的研究進(jìn)展，為開發(fā)新的抗炎藥物提供參考。

1 炎癥信號途徑及抗炎活性研究模型

海洋來源環(huán)肽類抗炎化合物多數(shù)作用于NF-κB信號途徑，該途徑是經(jīng)典的炎癥信號途徑[7]。位于細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB由兩個(gè)亞基(p50和p65)組成，它們是抑制蛋白IκB-α的非活性異二聚體。在刺激條件下，IκB-α的磷酸化和蛋白水解使NF-κB易位進(jìn)入核內(nèi)，然后通過與DNA結(jié)構(gòu)中的κB位點(diǎn)結(jié)合來調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[8]。NF-κB的反式激活會(huì)增加下游炎癥介質(zhì)的表達(dá)，例如IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎細(xì)胞因子[9]，重要的促炎酶(例如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS和環(huán)氧化酶COX-2)及其派生產(chǎn)物NO和PGE2[10]。炎癥介質(zhì)的過度產(chǎn)生引起細(xì)胞損傷，例如發(fā)紅、疼痛、發(fā)燒和腫脹[11]。因此，抑制炎癥介質(zhì)的過度產(chǎn)生是治療炎癥性疾病的重要目標(biāo)，可以作為評估藥物發(fā)揮抗炎作用的指標(biāo)。除NF-κB活化外，還有一種涉及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、p38和cJun NH2末端激酶(JNK)的MAPK信號途徑，也可以激活炎癥，并調(diào)節(jié)各種炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)炎癥因子的基因表達(dá)[12]。

研究人員常用的體外抗炎活性研究模型有兩種：(1)建立脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)、佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)或其他藥物刺激的體外免疫單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(BMDM細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞等)等體外模型[13]。通過這些模型評價(jià)藥物對一氧化氮釋放的影響，以及ELISA、Western blotting分析相關(guān)炎癥因子(IL-1、IL-6、TNF-α、PGE2等)和蛋白( iNOS和COX-2等)表達(dá)水平，是判斷天然產(chǎn)物是否具有潛在抗炎活性的有效手段[14]。(2)通過LPS刺激中性粒細(xì)胞，檢測中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Enutorphil Elastase,NE)的表達(dá)，NE抑制劑抑制NE活性，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，抑制炎細(xì)胞激活、跨膜遷移及組織毒性物質(zhì)釋放[15]，發(fā)揮多層次的抗炎效應(yīng)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也主要有兩種研究模型：(1)在大鼠足跖內(nèi)注射卡拉膠能使大鼠出現(xiàn)局部毛細(xì)血管擴(kuò)張、血管通透性增高、組織液滲出、足水腫等一系列類似于人體急性炎癥的反應(yīng)[16]。(2)二甲苯或PMA誘導(dǎo)小鼠耳腫脹，然后通過檢測炎癥部位改善情況評估抗炎效果[17]。

2 海洋來源抗炎活性肽分子

海洋環(huán)境復(fù)雜多變，生物種類豐富，蘊(yùn)含著大量結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物，肽類為其中一類重要的活性天然產(chǎn)物，是未來藥物開發(fā)的方向之一。目前為止，已發(fā)現(xiàn)的具有抗炎作用的海洋來源活性肽主要有4類。

2.1 環(huán)肽類及其抗炎機(jī)制

Gulavita等[18]從澳大利亞西南部采集到的海綿Theonellasp.中分離得到環(huán)八肽perthamide B (1)，化合物1顯示輕微的抑制細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)，半抑制濃度(50% Inhibitory Concentraton,IC50)為27.6 μmol/L。Festa等[19]從所羅門群島的海綿Theonellasp.中發(fā)現(xiàn)perthamides C—K (2—10)，其中perthamides C (2)和D (3)具有顯著的抗炎活性；在卡拉膠誘導(dǎo)的小鼠足水腫模型中，化合物2，3，8，7和10均能顯著降低卡拉膠誘導(dǎo)的足水腫，且無論在早期階段(0—6 h)還是在晚期階段(24—96 h)，其作用程度呈劑量相關(guān)，當(dāng)化合物2腹腔注射(ip)用藥劑量為300 μg/kg時(shí)能降低60%小鼠足水腫。佛波酯(PMA)能誘導(dǎo)死后人腎(PHK)細(xì)胞引起的末端分化和炎癥反應(yīng)，是研究銀屑病常用的體外模型之一[20]。perthamide C (2)和perthamide E (4)能抑制組織型纖溶酶原激活劑(Tissue Plasminogen Activator,TPA)誘導(dǎo)PHK細(xì)胞炎癥因子上調(diào)，化合物4能抑制IL-8表達(dá)，而化合物2能同時(shí)抑制TNF-α和IL-8的表達(dá)起抑制炎癥作用，提供新的抗銀屑病研究方向[21]。當(dāng)perthamide G (6)中的脯氨酸替代化合物2的γ-甲基脯氨酸，抗炎作用消失；具有ADAA殘基的perthamide J (9)具有強(qiáng)抗炎作用。研究表明同時(shí)擁有γ-甲基脯氨酸、AHMHA和ADAA結(jié)構(gòu)片段,是perthamides化合物分子產(chǎn)生抗炎作用的藥效條件[4]。

以上化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物perthamides (1—10)的結(jié)構(gòu)

Cyclomarins A (11)、B (12)和C (13)是從海洋放線菌Streptomycessp.提取得到的環(huán)七肽(圖2)；cyclomarin A由3種常見氨基酸和4種特殊的氨基酸組成，在體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)都表現(xiàn)出顯著的抗炎作用；在PMA誘導(dǎo)小鼠耳腫脹模型中，cyclomarin A在50 μg/耳的劑量下耳腫抑制率達(dá)92%；腹腔注射給藥劑量30 mg/kg時(shí)，耳腫抑制率達(dá)45%[22]，表明該化合物是一種潛在的抗炎候選藥物。

圖2 化合物cyclomarins (11—13)的結(jié)構(gòu)

Solomonamides A (14)和B (15)是來自海綿Theonellaswinhoei的環(huán)肽新骨架(圖3)，化合物14能夠降低卡拉膠誘導(dǎo)的足水腫，以100μg/kg(ip)的劑量能使抑制率達(dá)60%，呈劑量相關(guān)[23]。

來自海綿Stylissamassa的新天然產(chǎn)物 stylissatin A(16)[24]及其全合D-allo-Ile4叔丁基衍生物(17)[25](圖3)，在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中，能顯著抑制一氧化氮的生成，IC50分別為87和12 μmol/L。

IL-10作為免疫抑制因子，通過抑制多種效應(yīng)分子來抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-2和IFN-C來抑制IL-12及TNF-α的表達(dá)，同時(shí)作為促炎細(xì)胞因子參與TNF-α的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。Liu等[26]從海綿共附生真菌Aspergillusviolaceofuscus中發(fā)現(xiàn)環(huán)四肽violaceomide A (18)(圖3)，在LPS誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞中，當(dāng)用藥濃度在10 μmol/L時(shí)，化合物18顯著抑制促炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，抑制率為84.3%。

圖3 化合物Solomonamides (14，15)、stylissatin A (16)和(17)，violaceomide A (18)的結(jié)構(gòu)

Nalli等[27]從海洋鏈霉屬Streptomycessp.中分離獲得10個(gè)吡嗪-1,4-二酮取代環(huán)二肽類化合物(19—28)(圖4)，其中化合物21，22，23，25和26對脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中的兩種促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6均具有良好的抑制作用，在10 μmol/L用藥劑量下，抑制率為23.7%—62.1%；體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都證實(shí)化合物25是TNF-α的特異性抑制劑，可有效抑制LPS誘導(dǎo)的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中TNF-α的產(chǎn)生。

圖4 吡嗪-1,4-二酮取代環(huán)二肽類化合物(19—28)的結(jié)構(gòu)

2.2 縮肽類及其抗炎機(jī)制

縮肽化合物是一類包含酯鍵的多肽，是羥基酸和氨基酸由酯鍵和酰胺鍵連接構(gòu)成的一類寡聚物，具有抗菌、抗病毒、抗血栓、抗蟲以及抗腫瘤等多種生物活性[28]。

TPA誘導(dǎo)小鼠耳腫是一種模擬非特異炎癥的動(dòng)物模型，TPA誘導(dǎo)小鼠耳組織角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子[29]。從水母表面共附生放線菌Streptomycessp.中提取得到的salinamides A—E (29—33)(圖5)，其中salinamides A (29)和B (30)具有較好的抗炎作用，在TPA誘導(dǎo)的小鼠耳腫模型下，以50 μg/耳的給藥劑量，抑制率分別達(dá)84%和83%[30]。

圖5 化合物Salinamides (29—33)的結(jié)構(gòu)

Halipeptins A—C (34—36)[31]是從海綿Haliclonasp.提取獲得的17元環(huán)縮酯肽(圖6)，化合物34具有較好的抗炎特性，在體內(nèi)的抗炎作用比商業(yè)抗炎藥物如萘普生和吲哚美辛更強(qiáng)。在小鼠皮下氣囊(Subcutaneous Air Pouch，SAP)慢性炎癥模型中，通過足下注射卡拉膠誘發(fā)炎癥反應(yīng)，經(jīng)藥物處理后發(fā)現(xiàn)，在300 μg/kg給藥劑量下，能減輕60%足水腫[32]。

圖6 化合物halipeptins (34—36)的結(jié)構(gòu)

Thalassospiramides A (37)、B (38)、D (39)和G (40)[33]分離自海洋細(xì)菌Thalassospirasp.(圖7)，化合物38對Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答中上調(diào)的IL-5產(chǎn)生抑制作用，IC50為5 μmol/L[34]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，thalassospiramides A (37)和D (39)能抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中一氧化氮的釋放，IC50分別為16.4和4.8 μmol/L[35]。

圖7 化合物thalassospiramids (37—40)的結(jié)構(gòu)

從深海鏈霉菌SomaliensisSCSIOZH66中提取分離的抗霉素型縮肽somalimycin (41)、USF-19A(42)和urauchimycin D (43)(圖8)，能夠抑制卵白蛋白誘導(dǎo)哮喘小鼠脾細(xì)胞中IL-5的釋放?；衔?2的IC50達(dá)0.57 μmol/L，化合物41和43的IC50均大于10 μmol/L，但細(xì)胞毒半數(shù)致死量LD50僅為34.6—192.9 μmol/L，具有良好的抗炎潛力[36]。

圖8 化合物Somalimycin (41)、USF-19A (42)和urauchimycin D (43)的結(jié)構(gòu)

2.3 脂肽類及其抗炎機(jī)制

脂肽類是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生物活性顯著的化合物，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、抗炎[35]等生物活性。脂肽類化合物的應(yīng)用前景較為廣泛，具有較大的開發(fā)價(jià)值。

Microcolin A (44)、microcolin B (45)和microcolin D (46)是從藍(lán)藻Lyngbyamajuscula中分離得到的(圖9)[37]。淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原LFA-1是白細(xì)胞整合素家族的一員，參與T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞的結(jié)合。胞內(nèi)黏附分子ICAM-1是胞內(nèi)黏附分子的一種類型，在細(xì)胞與細(xì)胞互相作用時(shí)，抑制白細(xì)胞浸潤。LFA-1/ICAM-1相互作用在炎癥疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[38]。化合物45和46抑制LFA-I/ICAM-I介導(dǎo)的細(xì)胞黏附，IC50分別為0.15和0.9 μmol/L，有望被開發(fā)為LFA-I/ICAM-I抑制劑[39,40]。化合物44能夠阻止IL-2的產(chǎn)生與IL-2受體的表達(dá)，并且對刀豆凝集素A (Concanavalin A)活化小鼠脾細(xì)胞淋巴細(xì)胞的增殖有抑制作用[41]。

Malyngamides類化合物分子中的脂肪酸鏈與具有環(huán)己烯酮或環(huán)氧環(huán)己酮結(jié)構(gòu)的胺均通過酰胺鍵連接，是一類骨架新穎、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的脂肪酰胺化合物，具有良好的生物活性[42]。Malyngamide S (47)能抑制分別由趨化肽(fMLP)和PMA誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞中超氧陰離子的生成，抑制率分別為73%和83%[43]。Malyngamide C (48)、malyngamide J (49)和malyngamide L (50)分離自藍(lán)藻Lyngbyamajuscula，能抑制LFA-I/ICAM-I介導(dǎo)的細(xì)胞黏附，伴隨著較小的細(xì)胞毒性[39]。Malyngamide 2 (51)分離自未知藍(lán)藻，能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞一氧化氮的釋放，IC50為8.0 μmol/L。

以上化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖10。

圖9 化合物Microcolins (44—46)的結(jié)構(gòu)

圖10 化合物Malyngamides (47—51)的結(jié)構(gòu)

2.4 蛋白質(zhì)類及其抗炎機(jī)制

藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin,PC)是一種光合色素，廣泛存在于藍(lán)藻和紅藻細(xì)胞內(nèi)，其分子量在40 kU左右，由α和β兩個(gè)亞基組成，肽鏈上共價(jià)結(jié)合1個(gè)開鏈的四吡咯環(huán)輔基。藻藍(lán)蛋白在小鼠模型中被證明可以抑制各種類型的水腫和活性自由基的釋放，類似于其他非甾體抗炎藥，如吲哚美辛和布洛芬[43]。在花生四烯酸(AA)誘導(dǎo)的小鼠耳炎模型中，藻藍(lán)蛋白可以抑制前列腺素E2的產(chǎn)生、抑制磷脂酶A2的活性和組胺的釋放[44-46]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白能抑制COX-2蛋白的表達(dá)和促炎細(xì)胞因子TNF-α的釋放[47]。

凝集素(Lectin)是一種糖蛋白，分離自各種植物、無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物。最近的研究發(fā)現(xiàn)，海洋生物中也存在凝集素，并且具有一定的抗炎作用。在酵母聚糖誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中，預(yù)先用分離自綠藻Caulerpacupressoides的海藻凝集素保護(hù)，隨后用酵母聚糖誘導(dǎo)炎癥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可降低小鼠關(guān)節(jié)痛并抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的生成，并抑制白細(xì)胞浸潤以及降低髓過氧化物酶(MPO)的活性。在卡拉膠誘導(dǎo)小鼠足水腫模型中，該凝集素能顯著降低腫脹率和中性粒細(xì)胞的滲透，也可以抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和COX-2表達(dá)。除此之外，海藻凝集素對葡聚糖和組胺誘導(dǎo)的足水腫也有抑制作用，但對5-羥色胺和緩激肽誘導(dǎo)的足水腫沒有效果，表明該凝集素的抗炎作用可能與抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、COX-2和組胺受體的表達(dá)有關(guān)[48]。

抗菌肽因其在宿主免疫機(jī)能中的重要地位，又被稱為宿主防御肽(Host Defense Peptides)，參與機(jī)體先天性免疫反應(yīng)。天然抗菌肽通常由30多個(gè)氨基酸殘基組成，是堿性小分子多肽，這些肽通常具有一定的抗炎、調(diào)控免疫活性。Epinecidin-1是從海洋石斑魚Epinepheluscoioides中分離出來的抗菌肽，能促進(jìn)LPS激活的RAW264.7巨噬細(xì)胞中IL-10的分泌，但卻對TNF-α的分泌沒有明顯作用，表明該抗菌肽能通過促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的分泌來發(fā)揮抗炎作用[49]。Chrysophsin-1是從海洋真鯛Chrysophrysmajor中提取的抗菌肽，可以抑制LPS激活的RAW264.7巨噬細(xì)胞中TNF-α的釋放[50]。

3 展望

海洋生物來源的活性肽根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同表現(xiàn)出不同的藥理作用，這些不同類型的肽對在生物醫(yī)學(xué)研究上闡明疾病機(jī)理和藥物作用機(jī)理具有重要意義。例如，環(huán)肽在過去的幾年里引起越來越多的關(guān)注，許多研究主要集中在它們在體內(nèi)和體外炎癥模型中潛在的抗炎作用。對環(huán)肽的重視主要是因?yàn)槠浞肿恿啃?，可以保持良好的?xì)胞通透性，同時(shí)又保證它們與藥物作用時(shí)有足夠大的接觸面積，可以擴(kuò)大藥物界面，增強(qiáng)親和力和選擇性。因此，環(huán)肽可通過其環(huán)狀結(jié)構(gòu)克服蛋白的熵(吉布斯自由能)障礙，增強(qiáng)與靶蛋白表面的結(jié)合。環(huán)肽的剛性是另一個(gè)關(guān)鍵因素，其可以通過顯著降低熵，更好地使目標(biāo)分子與受體結(jié)合。由于這些原因，與線性結(jié)構(gòu)相比，環(huán)肽通常表現(xiàn)出更好的生物活性。此外，由于缺乏羧基和氨基末端，環(huán)肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)提高了它們對外肽酶水解的抵抗力。本文綜述的具有抗炎活性的海洋來源活性肽，由于環(huán)肽類物質(zhì)含量低，且易降解，使得其臨床開發(fā)較難，但是隨著研究的不斷深入，以及酶工程技術(shù)和生物合成技術(shù)的成熟運(yùn)用，開發(fā)海洋活性肽作為藥物先導(dǎo)化合物的研究有望在不久的將來得以實(shí)現(xiàn)。