黃沁愉，蔣學建，蘇宏飛,2**，隆正良，陳 凡，黃麗萍，張志鵬

(1.廣西大學海洋學院，廣西南寧 530004;2.廣西大學，廣西南海珊瑚礁研究重點實驗室，廣西大學珊瑚礁研究中心，廣西南寧 530004;3.廣西大學工程實踐與訓練中心，廣西南寧 530004)

0 引言

群體感應(yīng)(Quorum Sensing,QS)是細菌根據(jù)自身細胞密度變化進行自我協(xié)調(diào)的一種群體行為[1]。QS調(diào)控機制與病原微生物的毒力和致病性密切相關(guān)。受QS調(diào)控的細菌，通過產(chǎn)生不同的信號分子如AHL、AI-2、CAI-1等，控制其不同的性狀表達，如抗生素的合成、毒素的產(chǎn)生、生物膜成熟及生物發(fā)光等[2-5]。

近年來，珊瑚白化現(xiàn)象日益嚴重。導致珊瑚白化的主誘因有很多種，其中由各類致病菌引起的珊瑚疾病已成為世界三大珊瑚礁區(qū)白化的重要因素[6]。頻繁發(fā)生的珊瑚疾病造成主要造礁物種突發(fā)性大范圍死亡，嚴重減少礁區(qū)的生物多樣性，對珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不可控的甚至是難以逆轉(zhuǎn)的生態(tài)破壞[7]。Weir-Brush等[8]發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)濃度與海水表溫相關(guān)性良好，是引發(fā)珊瑚死亡，尤其是引起變形角珊瑚疾病的主要病原體。溶珊瑚弧菌(V.coralliilyticus)作為較新發(fā)現(xiàn)的珊瑚疾病病原體，也是近年來多種珊瑚的隱形殺手[9]。Bhedi等[10]研究表明，高溫脅迫下黑帶病菌大量繁殖并合成AHL，加速侵染健康珊瑚，導致珊瑚大范圍白化。有研究發(fā)現(xiàn)，機會條件下部分珊瑚共附生細菌如溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、創(chuàng)傷弧菌(V.vuLnificus)等，利用QS信號因子改變珊瑚共附生微生物種群組成，打破珊瑚內(nèi)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，導致宿主珊瑚白化[11]。Papenfort等[2]發(fā)現(xiàn)致病弧菌霍亂弧菌(V.cholerae)和哈維氏弧菌(V.harveyi)受QS系統(tǒng)調(diào)控，通過分泌信號因子AI-2、CAI-1與膜受體結(jié)合，激活體內(nèi)群體感應(yīng)基因的表達。Certner等[12]對健康鹿角珊瑚(A.cervicornis)添加外源AHL信號分子，發(fā)現(xiàn)也會促使其白化。這些研究證據(jù)表明，珊瑚細菌性白化與寄生珊瑚的病原細菌群體感應(yīng)密切相關(guān)，意味著致病菌的群體淬滅完全有可能降低甚至解除珊瑚患病的威脅。

群體淬滅(Quorum Quenching，QQ)指通過抑制致病菌的QS效應(yīng)，阻斷胞間“信息交流”，達到抵御致病菌感染的目的[13]。群體淬滅產(chǎn)生菌可通過降解病原菌信號因子，阻斷細菌的信號交流，從而在不產(chǎn)生耐藥性的情況下有效抑制毒力基因的表達，是新型環(huán)境友好型的病菌防治策略[14]。目前已發(fā)現(xiàn)多例群體淬滅現(xiàn)象，Dong等[4]在蘇云金芽孢桿菌中克隆獲得的AiiA基因編碼的AHL內(nèi)酯酶，能高效抑制具有QS效應(yīng)的植物致病菌軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)；Koch等[15]在布魯氏菌(Brucellamelitensis)中發(fā)現(xiàn)，酰基轉(zhuǎn)移酶AibP在體外條件下能夠降解自身產(chǎn)生的內(nèi)生信號分子，并在巨噬細胞的侵染期間減少內(nèi)生信號分子的積累；Chan等[16]從馬來西亞雨林的生姜根圍中分離出 3 株具有抑制群體感應(yīng)效果的菌，其中兩株通過自身產(chǎn)生的內(nèi)酯水解酶產(chǎn)生廣譜的AHL降解活性從而抑制群體感應(yīng)，另一株則通過?；D(zhuǎn)移酶改變 AHL 的結(jié)構(gòu)實現(xiàn)群體感應(yīng)的抑制?？梢?，干擾病原細菌間的QS效應(yīng)有可能成為解決珊瑚白化的新方法。群體淬滅現(xiàn)象同樣可以在珊瑚中實現(xiàn)，Meyer等[17]從珊瑚藍細菌中分離得到一種抑制劑，該化合物能夠結(jié)合珊瑚致病菌V.harveyi群體感應(yīng)受體蛋白，產(chǎn)生群體淬滅，還能夠使珊瑚共附生弧菌熒光淬滅。因此，挖掘具有群體淬滅活性的菌株，開展其對珊瑚共附生微生物中群體感應(yīng)和群體淬滅介導的相互作用機制的研究，可為深入解析珊瑚共附生微生物抗病分子機制提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為今后深入研究珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的生物修復提供理論依據(jù)。

微生物界中常見的病原菌幾乎都可以形成生物被膜，病原菌生物被膜的形成是造成宿主慢性感染的主要原因。溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌為常見的珊瑚病原菌，廣泛分布于海洋環(huán)境中，Cervino等[18]發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌與其他弧菌協(xié)同作用可使健康的圓菊珊瑚(Montastreaspp.)感病，其中溶藻弧菌也常常被認為是魚類、甲殼類和人類疾病的病原[19]；而Kimes等[20]揭露溶珊瑚弧菌的毒力因子表達受溫度調(diào)控，可在水生動物組織的表面形成生物被膜。可形成生物被膜的細菌對抗生素和宿主免疫防御機制的抗性較普通病原菌強[21]，相比物理、化學方法，通過抑制病原菌的QS調(diào)控形成生物被膜的生物治療方法解決珊瑚感病問題，具有環(huán)境友好、安全性高及可持續(xù)強等優(yōu)勢[22]。

三亞珊瑚岸礁是我國岸礁最為發(fā)育的地點之一，鹿回頭岸段一直是我國開展珊瑚礁研究和保護管理的代表地區(qū)[23]，該地區(qū)珊瑚及其共附生微生物物種豐富度高，是熱帶海洋中最突出的代表性生態(tài)系統(tǒng)之一[24]。雖然近年來鹿回頭地區(qū)珊瑚面臨著多重威脅，珊瑚覆蓋率從以前的80%—90%下降到如今的21.83%，但已有相關(guān)研究表明，這種情況主要是人類活動影響和全球氣候變化所導致的[25]，而該地區(qū)極少有關(guān)于珊瑚疾病的研究及報道[7]，由此推測，該地區(qū)可能存在群體淬滅活性菌。

紫色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)是一類具QS效應(yīng)的革蘭氏陰性細菌，當自身細胞密度達到一定臨界濃度時，會向環(huán)境釋放信號分子C6-HSL與特定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，調(diào)控紫色素相關(guān)基因的表達[26]，產(chǎn)生紫色素用以指示QS作用的產(chǎn)生。目前作為一種簡便、直觀的QS抑制因子篩選模型[27]，被廣泛應(yīng)用于各類細菌的QS研究中。本項目選取三亞鹿回頭7類珊瑚樣品為研究對象，以紫色桿菌為指示菌，篩選出具有較高群體淬滅活性的珊瑚共附生菌株，運用16S rDNA測序分析并結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫進行種屬鑒定，研究其對海洋致病菌溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌的生長、運動性和生物被膜生成的影響，為防治病原細菌群體感應(yīng)引起的珊瑚白化提供新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

從三亞市鹿回頭半島三亞灣(109°28′E,18°13′N)采集覆蓋度高的、具有代表性的珊瑚樣品，包括鹿角珊瑚(Acroporaaustera)、鹿角杯型珊瑚(Pocilloporadamicornis)、扁腦珊瑚(Platygyrasp.)、片狀薔薇(Turgescenssp.)、濱珊瑚(Poritessp.)、盾形陀螺(Scleractinlasp.)及角蜂巢(Favitessp.)等7類珊瑚。每類珊瑚采集3個樣品，每個樣品剪碎后裝入10 mL海水，振蕩儀振蕩后，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

胰蛋白胨粉末(LP0042)、酵母粉末、技術(shù)瓊脂粉末(Agar Powder)購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖粉購自國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉、檸檬酸鐵購自天津市大茂化學試劑廠；宿主弧菌溶珊瑚弧菌、溶藻弧菌購自國家海洋局第三研究所海洋微生物保藏中心；紫色桿菌CV12614 購自美國微生物保藏中心；2×Taq Mastermix購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Glycine、TRIS、SDS購自北京索萊寶科技有限公司；膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配制

Marine Agar (MA)培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨5.0，酵母提取粉1.0，葡萄糖0.5，檸檬酸鐵0.1，海水定容，pH值為 7.2—7.5。

MA固體培養(yǎng)基：在MA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入10.0 g/L瓊脂，海水定容。

珊瑚內(nèi)環(huán)境原位模擬培養(yǎng)基[28]：0.22 μm有機過濾膜過濾珊瑚組織勻漿，去除細菌，制備無細胞珊瑚組織液(CFCF)。以CFCF∶MA固體培養(yǎng)基=1∶10體積比例配制模擬珊瑚內(nèi)環(huán)境的營養(yǎng)固體培養(yǎng)基。

2.0%瓊脂固體培養(yǎng)基：瓊脂20.0 g/L，海水定容。

Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨5.0，酵母提取粉1.0，氯化鈉10.0，雙蒸水定容，pH值為7.4。

LB固體培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入10.0 g/L瓊脂。

群體淬滅活性篩選培養(yǎng)基：融化的40℃ LB固體培養(yǎng)基200 mL，加入紫色桿菌CV12614發(fā)酵液200 μL混勻。

1.2 珊瑚共附生微生物的分離培養(yǎng)

1.2.1 菌體收集

參考文獻[28]的方法：稱取1 g含骨骼、黏液及珊瑚組織的珊瑚樣品碎塊，同一種珊瑚樣品稱取3份，分別用無菌海水浸泡在15 mL收集管中，1 920 r/min轉(zhuǎn)速下漩渦振動15 min，獲得濃稠的珊瑚組織勻漿，放置在4℃冰箱內(nèi)短時間保存。

1.2.2 原位模擬培養(yǎng)

蔗糖密度梯度離心是將珊瑚組織勻漿中不同類屬的微生物分層的有效方法，大大提高珊瑚共附生微生物的存活率，獲得更多種類的可培微生物。參考文獻[29]的蔗糖密度梯度離心方法：在1.5 mL EP管中依次加入0.3 mL 40%、30%、20%、10%梯度濃度的蔗糖溶液；移液槍取0.4 mL各珊瑚組織勻漿0.5 μm過濾膜過濾液，移入EP管溶液上層，低速離心；以0.4 mL為1個級分，用移液槍定量移取不同級分離心液至EP管，用無菌海水稀釋至3個濃度(10-1、10-2、10-3)；取200 μL稀釋10-3倍后的不同級分菌液，在珊瑚內(nèi)環(huán)境原位模擬固體培養(yǎng)基上涂布，常溫培養(yǎng)24 h。

1.3 群體淬滅活性產(chǎn)生菌的篩選

1.3.1 單菌落分離純化

從1.2.2節(jié)培養(yǎng)的平板中挑出不同單菌落，在MA固體培養(yǎng)基平板上劃線，純化培養(yǎng)出單一菌落，再接種到10 mL MA液體培養(yǎng)基內(nèi)，160 r/min 25℃條件下擴大培養(yǎng)。

1.3.2 群體淬滅活性菌株的篩選

紫色桿菌CV12614具備顯著的群體感應(yīng)現(xiàn)象[27]，共附生菌株會抑制紫色菌素的分泌，產(chǎn)生透明圈，具備該現(xiàn)象的菌株即為群體淬滅活性菌株。實驗中考慮到紫色桿菌CV12614在液體培養(yǎng)基中難以把控存活周期及紫色菌素分泌量，故利用固體培養(yǎng)基對群體淬滅活性菌株進行篩選。

操作步驟：將群體淬滅活性篩選培養(yǎng)基劃分16格打孔，取200 μL 1.3.1節(jié)分離培養(yǎng)的菌株發(fā)酵液置于孔內(nèi)培養(yǎng)初篩，以產(chǎn)生透明抑菌圈為陽性菌株[26]。牛津杯均勻排布在2.0%瓊脂固體培養(yǎng)基平板上，倒入群體淬滅活性篩選培養(yǎng)基，制成四孔雙層群體淬滅活性驗證平板。待平板凝固后，每個孔加入200 μL陽性菌株發(fā)酵液，30℃培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

1.4 16S rDNA序列分析

使用16S rDNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGGY-TACCTTGTATACGACTT-3′)對群體淬滅活性菌株的基因片段進行PCR擴增[28]。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳驗證條帶后,將PCR產(chǎn)物送深圳華大基因股份有限公司進行基因測序，測定序列通過GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對鑒定。

1.5 菌株發(fā)酵和活性物質(zhì)提取

取群體淬滅活性菌株各100 μL置于10 mL MA培養(yǎng)基中，恒溫過夜振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液的OD600為1，即得純化培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液。發(fā)酵液于8 000 r/min離心5 min取上清液，用0.22 μm有機濾膜過濾，除菌保存，獲得無菌陽性菌株的發(fā)酵液上清，即為含有群體淬滅活性物質(zhì)的溶液。

1.6 群體淬滅活性物質(zhì)對珊瑚病原菌V545和Z-14生長的影響

以比濁法測定海洋病原菌生長曲線[30,31]。微生物生長曲線是描述微生物生長狀況的基本指標[32]。比濁法測定生長量的原理是以細菌懸浮液的生物量與懸浮液的混濁程度成正比為基礎(chǔ)，利用紫外可見分光光度計測定OD600，間接推斷樣品中微生物總量[33]。

操作步驟：將病原菌V545和Z-14接種到MA液體培養(yǎng)基中，恒溫過夜振蕩培養(yǎng)至OD600為1，即為病原菌液。取2 mL無菌陽性菌株發(fā)酵液上清與10 mL MA液體培養(yǎng)基混合，接種1%病原菌液。以12 mL MA接種1%病原菌液為空白對照。25℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔一定時間測定OD600并記錄。至菌株生長進入衰弱期時停止培養(yǎng)，以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600值為縱坐標繪制生長曲線。

1.7 群體淬滅活性物質(zhì)對珊瑚病原菌V545和Z-14運動性的影響

弧菌具有極性鞭毛，可在液體環(huán)境中游動，并可在半固態(tài)表面上顯示出運動性[34]，本實驗采用半固體培養(yǎng)基法分析病原菌運動性[35]。

操作步驟：將珊瑚病原菌V545和Z-14分別接種至MA培養(yǎng)基中，恒溫過夜振蕩培養(yǎng)至OD600為1。以MA液體培養(yǎng)基∶菌液=100∶1的比例稀釋珊瑚病原菌發(fā)酵液，將稀釋后的珊瑚病原菌發(fā)酵液與無菌陽性菌株發(fā)酵液上清按1∶1的比例混合，取0.5 μL接種于LB固體培養(yǎng)基平板；將稀釋后的珊瑚病原菌發(fā)酵液與MA液體培養(yǎng)基1∶1混合，取0.5 μL作為空白對照，每株菌種平行點樣3個；室溫靜置過夜培養(yǎng)，記錄菌團直徑(mm)。

1.8 群體淬滅活性物質(zhì)對珊瑚病原菌V545和Z-14生物被膜生成的影響

采用96孔微量板法[36]并參考文獻[36-38]的實驗方法進行一定改動。采用1.7節(jié)培養(yǎng)的珊瑚病原菌V545和Z-14，然后用MA/2液體培養(yǎng)基(濃度為MA液體培養(yǎng)基的一半)將病原菌發(fā)酵液稀釋至OD600為0.05。取100 μL稀釋后的病原菌發(fā)酵液和100 μL無菌陽性菌株發(fā)酵液上清混合，加入96孔聚苯乙烯微培養(yǎng)板，每孔200 μL。另外取100 μL稀釋后的病原菌發(fā)酵液與100 μL MA培養(yǎng)基混合，作為空白對照，每孔200 μL。每組設(shè)置3個平行實驗。

將微孔板室溫放置24 h后，孔壁上附著一層厚度均勻的薄膜(生物被膜)，小心除去培養(yǎng)液，以一級水浸洗微孔板，風干后用1%結(jié)晶紫染色20 min。待染色完全后，以一級水浸微孔洗板并風干，再加入200 μL無水乙醇充分溶解，用酶標儀測定OD570，取3個復孔均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 珊瑚共附生菌株的分離與群體淬滅活性

本研究通過蔗糖密度梯度離心法和原位模擬培養(yǎng)法，共從7類不同珊瑚的樣品中分離出256株共附生菌種(未鑒定物種)。如圖1為蔗糖密度梯度離心法稀釋樣品后，在原位模擬環(huán)境下培養(yǎng)出的角珊瑚共附生菌菌落。

圖1 原位模擬培養(yǎng)平板

紫色桿菌 CV12614具備顯著的群體感應(yīng)現(xiàn)象[2]，本研究通過判斷其紫色菌素的分泌，篩選出群體淬滅活性菌株。由圖2可見，鹿角珊瑚中分離培養(yǎng)出的共附生菌株周圍產(chǎn)生透明圈，且仍可見密集無色的紫色桿菌菌落，說明該菌為具群體淬滅活性的陽性菌株。同樣原理，從256株共附生菌種中初步篩選出20株具備潛在群體淬滅活性的菌株。

圖2 群體淬滅活性篩選平板

2.2 16S rDNA序列檢測結(jié)果

對篩選得到的20株群體淬滅活性菌株進行16S rDNA測序鑒定及BLAST同源性比對，編號依次為GXU-HJ-1—20。測序結(jié)果顯示(表1)：GXU-HJ-1、GXU-HJ-2、GXU-HJ-3、GXU-HJ-4、GXU-HJ-7以及GXU-HJ-13—20等13個菌株屬于Vibrio屬；GXU-HJ-5、GXU-HJ-6、GXU-HJ-8、GXU-HJ-10、GXU-HJ-11等5個菌株屬于Ralstonia屬；GXU-HJ-9屬于Bacillus屬，GXU-HJ-12屬于Sphingomonas屬。

2.3 群體淬滅活性物質(zhì)對病原菌V545和Z-14生長的影響

菌株GXU-HJ-5、GXU-HJ-8、GXU-HJ-10、GXU-HJ-12、GXU-HJ-18因濃度過低，無法獲得有效的生長曲線，進而無法研究其對致病菌的運動情況及對生物被膜生長的影響，故不列入后續(xù)研究項目。通過生長曲線來判斷菌株是否有抑制作用，并對有抑制作用的菌株平穩(wěn)期OD600與空白對照平穩(wěn)期OD600進行統(tǒng)計分析，使用方差檢驗(P值)，檢驗抑制作用是否具有顯著差異。結(jié)果顯示(圖3，4)：GXU-HJ-1、GXU-HJ-3、GXU-HJ-7、GXU-HJ-15對溶珊瑚弧菌V545有抑制作用；其中，GXU-HJ-15抑制作用較輕微，平穩(wěn)期較空白對照濃度降低了0.53×107cfu/mL；GXU-HJ-1、GXU-HJ-3、GXU-HJ-7抑制作用較明顯，平穩(wěn)期較空白對照濃度分別降低了0.87×107，0.82×107，2.00×107cfu/mL (P<0.05)。GXU-HJ-4、GXU-HJ-7、GXU-HJ-9、GXU-HJ-19對溶藻弧菌Z-14有抑制作用。其中GXU-HJ-19抑制作用較輕微，平穩(wěn)期較空白對照濃度降低了0.73×107cfu/mL，GXU-HJ-4、GXU-HJ-7、 GXU-HJ-9抑制作用較明顯，平穩(wěn)期較空白對照濃度分別降低了1.63×107，1.83×107，1.39×107cfu/mL (P<0.05)。

表1 群體淬滅菌株

圖3 群體淬滅活性菌株發(fā)酵液對V545生長的影響(P<0.05)

2.4 病原菌V545和Z-14的運動情況

圖5顯示，GXU-HJ-6對溶珊瑚弧菌V545運動性有輕微抑制作用，其運動范圍直徑較空白對照縮減0.2 mm。圖6顯示，GXU-HJ-1、GXU-HJ-6、GXU-HJ-7、GXU-HJ-14、GXU-HJ-15、GXU-HJ-16、GXU-HJ-19、GXU-HJ-20對溶藻弧菌Z-14有抑制作用；其中GXU-HJ-1、GXU-HJ-6、GXU-HJ-14、GXU-HJ-19抑制作用較輕微，運動范圍直徑較空白對照分別縮減0.3，0.3，0.2，0.3 mm；GXU-HJ-7、GXU-HJ-15、GXU-HJ-16、GXU-HJ-20抑制作用較明顯，運動范圍直徑較空白對照分別縮減3.0，0.7，0.5，0.5 mm。

圖5 群體淬滅活性菌株發(fā)酵液對V545運動性的影響

圖6 群體淬滅活性菌株發(fā)酵液對Z-14運動性的影響

2.5 病原菌V545和Z-14生物被膜生長情況

如圖7所示，9株菌株對病原菌V545生物被膜形成具有抑制作用，在溶珊瑚弧菌V545生物被膜形成階段，相同培養(yǎng)條件下，加入GXU-HJ-2、GXU-HJ-3、GXU-HJ-6、GXU-HJ-7、GXU-HJ-11、GXU-HJ-16、GXU-HJ-17、GXU-HJ-19、GXU-HJ-20的提取物后，其形成的生物膜吸光值均低于空白組，抑制率分別為(67.09±7.61)%、(84.18±3.27)%、(73.47±7.98)%、(30.26±1.82)%、(82.95±2.36)%、(72.68±4.70)%、(56.28±6.99)%、(20.29±11.97)%、(81.87±4.85)%(圖7a)。14株菌株對溶藻弧菌Z-14生物被膜形成具有抑制作用，在相同培養(yǎng)條件下，GXU-HJ-1、GXU-HJ-2、GXU-HJ-3、GXU-HJ-4、GXU-HJ-6、GXU-HJ-7、GXU-HJ-9、GXU-HJ-11、GXU-HJ-13、GXU-HJ-14、GXU-HJ-15、GXU-HJ-16、GXU-HJ-17、GXU-HJ-19對病原菌Z-14生物被膜生長的抑制率分別為(93.76±7.13)%、(93.30±5.00)%、(94.31±3.94)%、(95.93±8.62)%、(79.30±3.38)%、(94.51±2.64)%、(91.66±2.55)%、(51.20±1.52)%、(91.19±2.02)%、(93.77±1.76)%、(88.71±4.04)%、(89.62±6.05)%、(95.82±5.25)%、(14.83±0.53)%(圖7b)，有11個菌株抑制率超過85%。GXU-HJ-2、GXU-HJ-3、GXU-HJ-6、GXU-HJ-11、GXU-HJ-16、GXU-HJ-17等6個菌株對兩種病原菌的生物被膜形成均具有較強的抑制作用。

圖7 群體淬滅活性菌株發(fā)酵液對病原菌生物被膜生長的影響

3 討論

本研究在珊瑚共附生微生物中成功篩選出具有群體淬滅活性，且能抑制珊瑚病原菌V545和Z-14生長、運動及生物膜形成的菌株，說明三亞鹿回頭半島三亞灣的珊瑚中具備大量未開發(fā)的群體淬滅活性菌種資源。受限于培養(yǎng)條件，本研究中部分菌種難以擴大培養(yǎng)，優(yōu)化培養(yǎng)基后或有機會發(fā)掘更多群體淬滅活性菌株資源，進而在一定程度上改善珊瑚疾病防治現(xiàn)狀。

經(jīng)16S rDNA測序鑒定，本研究篩選出的群體淬滅活性菌株以弧菌為主，目前關(guān)于群體淬滅活性弧菌的研究較少，如田曉榮等[39]采用平板交互劃線和高通量篩選的方法，從青島近海沉積物生物被膜中分離得到83株共54種具有群體感應(yīng)和群體淬滅活性的細菌，其中優(yōu)勢屬為弧菌屬和魯杰氏菌屬；于敏等[40]發(fā)現(xiàn)，纖維弧菌科海洋細菌中的AHL酰基轉(zhuǎn)移酶與阿古菌素的AHL?；D(zhuǎn)移酶具有同源性。由此推測，海洋中可能有更多具有群體淬滅活性的弧菌，仍需科研人員進一步深入挖掘。

群體淬滅活性微生物的應(yīng)用現(xiàn)今正被一步步開發(fā)?？股氐陌l(fā)現(xiàn)與濫用導致病原菌抗性廣泛出現(xiàn)，而群體淬滅能減弱病原菌的致病毒性且不會產(chǎn)生相關(guān)抗藥性，是近年來替代抗生素的最有希望策略[41]。如Nhan等[42]應(yīng)用一種N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯降解菌富集培養(yǎng)物(ECs)取代抗生素來控制疾病，從而實現(xiàn)更可持續(xù)的水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)。以微生物繁殖代謝為主要原因的高蛋白食品腐敗以及果蔬產(chǎn)品病害對食品流通及銷售造成了巨大的障礙，阻礙相關(guān)產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展，以群體淬滅活性菌作為微生物群體感應(yīng)抑制劑成為食品工業(yè)中新的研究熱點[43]。Vinoj等[44]發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)DAHB1產(chǎn)生的AHL內(nèi)酯酶AiiA能夠抑制弧菌生物被膜的產(chǎn)生，同時顯著降低蝦的感染率和死亡率。本實驗篩選出的多株群體淬滅活性菌株可為珊瑚疾病的防治提供一定的原材料，推動群體淬滅活性菌在珊瑚疾病防治中的研究，并給予生物被膜污染治理提供較新的研究路徑和理論支持。

在后續(xù)研究中，應(yīng)對以上20株活性菌株進行大量發(fā)酵，分離活性物質(zhì)，探究其抑制紫色桿菌QS效應(yīng)的有效成分及抑制機制；優(yōu)化菌株的培養(yǎng)基配方及外界培養(yǎng)環(huán)境，將具備較高群體淬滅活性的菌株進行大批量發(fā)酵；提取純化其活性物質(zhì)，分析其化合物結(jié)構(gòu)，并于珊瑚實驗缸中進行初步抑制珊瑚白化的實驗驗證。相關(guān)成果可為國內(nèi)珊瑚礁生態(tài)修復工作提供支持，為研發(fā)新藥物抑制群體感應(yīng)型細菌感染提供有力依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究選用蔗糖密度梯度離心法稀釋珊瑚提取物，模擬珊瑚原生內(nèi)環(huán)境配制原位模擬培養(yǎng)基，在三亞鹿回頭半島三亞灣珊瑚礁的7類珊瑚中分離出256株珊瑚共生菌。根據(jù)紫色桿菌嚴格受QS調(diào)控產(chǎn)紫色菌素的特性，利用紫色桿菌CV12614作模式菌，對珊瑚共生菌進行多次篩選培養(yǎng)，得到20株具群體淬滅活性的菌株。經(jīng)16S rDNA測序鑒定，群體淬滅活性菌株大部分為弧菌屬。結(jié)合比濁法以及半固體培養(yǎng)基法，分析群體淬滅活性菌株對兩種珊瑚病原菌溶珊瑚弧菌V545和溶藻弧菌Z-14生長、運動的影響，結(jié)果顯示，5株菌株對溶珊瑚弧菌V545的生長、運動有抑制作用，10株菌株對溶藻弧菌Z-14的生長、運動有抑制作用。擴展研究表明，9株菌株對溶珊瑚弧菌V545生物被膜形成具有抑制作用，14株菌株對溶藻弧菌Z-14生物被膜形成具有抑制作用。上述結(jié)果證實珊瑚共附生的群體淬滅活性菌對弧菌的生長、運動及生物被膜形成具有抑制作用。