金愛(ài)萍，李 蔚，李 冰，張倩榕

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年心血管科，陜西 西安710004)

AMP激活蛋白激酶(Mammalian AMP-activated protein kinase，AMPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包含催化α亞單位和調(diào)節(jié)β和γ亞單位[1]。AMPK對(duì)心臟肥大和心力衰竭具有保護(hù)作用，可通過(guò)阻斷各種信號(hào)通路，包括活化T細(xì)胞核因子(Activated T cells nuclear factor，NFAT)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)、核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead box O，F(xiàn)OXO)和肌肉特異性環(huán)指蛋白1(Muscle specific ring finger protein 1，MuRF1)的核因子減輕由壓力超負(fù)荷或去氧腎上腺素(Phenylephrine，PE)引起心臟肥大[2]。已有研究顯示[3]，抑制自噬反應(yīng)和鈣離子/鈣調(diào)素依賴激酶β-(CAMKK-β)-AMPK信號(hào)通路活性能夠延緩心臟肥大進(jìn)程；激活A(yù)MPK有助于提高心肌細(xì)胞肥大代償能力、改善心肌缺血缺氧狀態(tài)。此外AMPK誘導(dǎo)自噬反應(yīng)能夠干擾心臟肥大進(jìn)程，阻止心力衰竭病情發(fā)展；但自噬調(diào)節(jié)異常亦可能是導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生發(fā)展。目前對(duì)于AMPK能否通過(guò)調(diào)節(jié)自噬來(lái)達(dá)到保護(hù)心力衰竭患者心臟功能作用尚存在爭(zhēng)議[4]。本次研究通過(guò)探討AMPK激活對(duì)慢性心力衰竭病情的影響及作用機(jī)制，旨在尋找潛在有效治療靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 GAPDH、Beclin-1、Pho核糖體蛋白S6激酶(P70S6K)(T389)、P70S6K、Pho-4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)(T37/46)、4EBP1、Pho-AKT(Ser308)、Pho-AKT(Ser473)及AKT均由Cell Signaling Technology公司提供；Lc3b由Novus公司提供；α肌動(dòng)蛋白和P62由Sigma公司提供；Ampk激動(dòng)劑(AICAR)由Toronto chemicals公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、造模及給藥方法：選擇8～10周齡雄性C57BL/6J小鼠共40只，體重24～26 g，均由我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；小鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥麻醉后行主動(dòng)脈縮窄術(shù)，4周后建立心力衰竭模型；其中A組為生理鹽水(NS)注射+假手術(shù)(sham)，B組為AICAR注射+假手術(shù)(sham)，C組為NS注射+行主動(dòng)脈縮窄手術(shù)，D組為AICAR注射+行主動(dòng)脈縮窄手術(shù)。

1.2.2 超聲心動(dòng)圖檢查：檢查前小鼠吸入1.5%～2%異氟醚；采用Visual Sonics公司生產(chǎn)Vevo 2000型動(dòng)物專用超聲診斷儀，探頭頻率為30 MHz；小鼠取左側(cè)臥位或仰臥位，并在剃毛區(qū)均勻涂抹耦合劑，選取左心室乳頭肌短軸切面測(cè)量。

1.2.3 組織取材測(cè)量：稱量小鼠體重并記錄，頸椎脫臼法迅速處死小鼠，沿胸骨正中向頸部剪開(kāi)皮膚及橫隔，充分暴露心臟和肺臟；剪下心臟后輕輕擠壓心腔內(nèi)血液，修剪心臟周圍多余部分，記錄心臟重量。取出小鼠肺臟，修剪后濾紙吸干，稱重并記錄。剪開(kāi)小鼠后肢脛骨處皮膚，測(cè)量并記錄脛骨長(zhǎng)度；計(jì)算心重量與體重的比值(HW/BW)，肺重量與體重的比值(LW/BW)以及心重與脛骨長(zhǎng)度的比值(HW/TL)。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)：采用細(xì)胞溶解緩沖液+PMSF+蛋白酶抑制劑混合液提取左心室組織蛋白質(zhì)；蛋白濃度檢測(cè)采用Bio-Rad 蛋白分析試劑盒；Western blotting操作完成后通過(guò)Quality One軟件完成定量分析。

1.2.5 熒光共焦顯微鏡檢查：制備心臟組織冰凍切片(厚度5 mm)，干燥后采用PBS洗滌并在過(guò)氧化氫(0.3%)溶液中孵育30 min；制備樣品在室溫下以BSA(10%)封閉1 h，一抗孵育，再采用熒光二抗洗滌孵育；采用Zeiss LSM 600型共聚焦顯微鏡系統(tǒng)成像。

1.2.6 透射電子顯微鏡檢查：制備1～2 mm3組織塊，浸泡于2%多聚甲醛和2.5%戊二醛4 h以上，1%OsO4中固定1 h；采用超顯微切片機(jī)將組織制備成60～80 nm切片，放置于透射電鏡網(wǎng)格并行檸檬酸鉛染色，80 kV電壓下采用FEI公司雙透射電子顯微鏡成像。

2 結(jié) 果

2.1 兩組心臟功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較 C組HW/BW、LW/BW、HW/TL、肺重量/脛骨長(zhǎng)度比(LW/TL)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)及左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)水平均顯著高于A、B組(P<0.05)；C組射血分?jǐn)?shù)(Ejection fraction，EF)水平顯著低于A、B組(P<0.05)；D組HW/BW、LW/BW、HW/TL、LW/TL、LVEDd及LVESd水平均顯著高于A、B組，但低于C組(P<0.05)；D組EF水平顯著低于A、B組，但高于C組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 AMPK對(duì)心力衰竭模型動(dòng)物mTOR信號(hào)通路的影響 B組術(shù)后4EBP1、P70S6K及AKT磷酸化水平顯著高于A組(P<0.05)；D組術(shù)后4EBP1、P70S6K及AKT(Thr308)磷酸化水平顯著低于C組(P<0.05)；D組術(shù)后AKT(Ser473)磷酸化水平顯著高于C組(P<0.05)。

2.3 AMPK對(duì)于慢性心力衰竭患者自噬的抑制作用 D組術(shù)后LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ/GAPDH比值顯著低于C組，P62表達(dá)顯著高于C組(P<0.05)；C組和D組Beclin-1水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C組和D組心臟LC3b蛋白表達(dá)量顯著高于A組、B組(P<0.05)；D組心臟LC3b蛋白表達(dá)量顯著低于C組(P<0.05)；同時(shí)B組心臟LC3b蛋白表達(dá)量顯著高于A組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

表1 兩組心臟功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較

圖1 AICAR給藥后心臟自噬現(xiàn)象(熒光染色，×200倍)

3 討 論

自噬反應(yīng)是維持心肌形態(tài)及心臟功能重要組成部分之一；已有研究顯示[5]，脂聯(lián)素可刺激自噬反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞肥大，從而改善心臟功能；同時(shí)激活Sirt3可在調(diào)節(jié)自噬反應(yīng)同時(shí)改善心肌肥大病情。但亦有報(bào)道認(rèn)為[6-7]，心力衰竭和過(guò)度活躍自噬反應(yīng)密切相關(guān)。早期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[8]，AMPK可通過(guò)激活自噬有效抑制心臟肥大發(fā)生，但對(duì)于自噬反應(yīng)過(guò)度激活及調(diào)節(jié)紊亂亦可加速心力衰竭病情發(fā)展?；谝陨蠑?shù)據(jù)，本次研究目的在于探索AMPK是否可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬作用達(dá)到改善心力衰竭病情作用。

以往實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[9]，心臟肥大時(shí)AMPK被激活并能夠延緩心力衰竭病情進(jìn)展，提示AMPK在心力衰竭病變發(fā)生前即已開(kāi)始誘導(dǎo)自噬反應(yīng)。同時(shí)在以往建模過(guò)程中往往行主動(dòng)脈縮窄手術(shù)4周后完成慢性心力衰竭模型建立，再于心力衰竭階段給予AICAR給藥，此時(shí)自噬反應(yīng)已被過(guò)度激活[10]。而本次研究結(jié)果中，AMPK可通過(guò)下調(diào)自噬反應(yīng)來(lái)促進(jìn)心力衰竭模型動(dòng)物心臟功能恢復(fù)；同時(shí)AMPK增強(qiáng)行假手術(shù)組模型動(dòng)物自噬反應(yīng)，但心臟功能仍正常。筆者推測(cè)AMPK可通過(guò)上調(diào)心肌肥大時(shí)自噬反應(yīng)和下調(diào)心力衰竭時(shí)過(guò)度自噬來(lái)達(dá)到改善心臟功能的作用。

mTOR包括兩個(gè)功能不同復(fù)合物，即mTORC1和mTORC2；其中mTORC1由mTORC、Raptor、Mlst8及Pras40組成，具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖、代謝及自噬等多方面作用；而mTORC2則由mTORC、Rictor、Mlst8、Protor(prr5)及Sin1組成，主要用于控制細(xì)胞存活及調(diào)節(jié)極性[11-12]。已有研究顯示[13]，損傷組織細(xì)胞往往失去增殖潛能和蛋白沉積調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞內(nèi)積聚大量毒性碎片，破壞正常細(xì)胞代謝進(jìn)程，最終誘導(dǎo)蛋白毒性應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生。另有研究表明[14-15]，心肌細(xì)胞肥大及凋亡可被mTORC1受體顯著抑制，可能機(jī)制為清除蛋白毒性應(yīng)激源和高炎癥性衰老表型組織細(xì)胞。AMPK是mTORC1重要調(diào)節(jié)因子之一，AMPK-mTORC1通路可參與到心力衰竭自噬及能量代謝調(diào)節(jié)過(guò)程中[16]。本次研究結(jié)果中，AMPK可有效抑制衰竭心臟自噬活性，下調(diào)mTORC1表達(dá)。目前并無(wú)特異性mTORC1抑制劑能夠在抑制TORC1功能同時(shí)不影響其他生理作用，故mTORC1對(duì)于心肌肥大影響無(wú)法完全歸因于其對(duì)于自噬反應(yīng)調(diào)節(jié)作用[17-18]。此外糖尿病心力衰竭患者中可見(jiàn)mTORC活性下降，但AMPK活性未見(jiàn)明顯變化[19]。故筆者認(rèn)為AMPK激活后mTORC1下調(diào)可能未參與到心力衰竭自噬調(diào)節(jié)過(guò)程。

mTORC2對(duì)于自噬反應(yīng)影響仍存在爭(zhēng)議；以往研究顯示[20]，AMPK通過(guò)調(diào)節(jié)mTORC1相關(guān)自噬反應(yīng)以抑制心臟肥大。但本次研究結(jié)果中，AMPK在下調(diào)模型動(dòng)物心臟自噬活性同時(shí)激活mTORC2，說(shuō)明AMPK可通過(guò)刺激mTORC2活性以調(diào)節(jié)過(guò)度激活自噬反應(yīng)，同時(shí)Stim1亦可通過(guò)抑制mTORC2以加快心力衰竭病情進(jìn)展；已有研究證實(shí)[21]，mTORC2可對(duì)心力衰竭模型小鼠心臟收縮功能進(jìn)行調(diào)節(jié)；筆者推測(cè)通過(guò)mTORC2下調(diào)自噬反應(yīng)及AMPK激活可延緩心力衰竭病情進(jìn)展。

綜上所述，慢性心力衰竭患者體內(nèi)AMPK激活可通過(guò)上調(diào)mTORC2表達(dá)、抑制心臟自噬活性，從而達(dá)到有效改善心臟功能的作用。