蘇艷麗，李 波

(湖北省棗陽(yáng)市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 棗陽(yáng) 441200)

非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%，其1年生存率僅10%左右[1]。針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體的靶向藥物和針對(duì)免疫檢查點(diǎn)的抑制劑為NSCLC的治療提供了新的手段[2]。通過(guò)外源性刺激源刺激免疫細(xì)胞，可逆轉(zhuǎn)其衰竭的功能狀態(tài)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，可達(dá)到抑制NSCLC生長(zhǎng)、減少?gòu)?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的目的[3]。Th9細(xì)胞是一類新鑒定的CD4+T細(xì)胞亞群，表型為CD4+CCR4-CCR6-CXCR3-，主要在轉(zhuǎn)錄因子PU.1的調(diào)控下分泌白細(xì)胞介素-9(Interleukin-9，IL-9)，可通過(guò)調(diào)控CD8+T細(xì)胞活性發(fā)揮抗腫瘤作用[4- 5]。但有關(guān)Th9細(xì)胞對(duì)肺癌患者CD8+T細(xì)胞調(diào)控作用的研究較少。本研究檢測(cè)NSCLC患者外周血及支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中Th9細(xì)胞比例和IL-9水平，利用體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)觀察Th9細(xì)胞對(duì)NSCLC患者CD8+T細(xì)胞抗腫瘤活性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年2-9月棗陽(yáng)市第一人民醫(yī)院診斷為NSCLC的患者32例，其中男19例，女13例，年齡27～64歲，平均(48.7±13.1)歲。所有患者均進(jìn)行了手術(shù)或肺活檢，經(jīng)病理學(xué)檢查確診為NSCLC；其中鱗癌17例，腺癌15例。根據(jù)影像學(xué)結(jié)果，中央型肺癌16例(鱗癌9例，腺癌7例)，周圍型肺癌16例(鱗癌8例，腺癌8例)。32例患者中，21例(鱗癌10例，腺癌11例)接受手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并活動(dòng)性肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒感染的患者；②合并嚴(yán)重肺部感染或敗血癥的患者；③合并心臟、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等重要臟器功能不全的患者；④自身免疫性疾病或長(zhǎng)期接收免疫調(diào)節(jié)劑治療的患者?；颊咴诮邮苁中g(shù)前均未進(jìn)行放療、化療或免疫治療。同時(shí)，選擇2018年3-6月于棗陽(yáng)市第一人民醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的、年齡和性別相匹配的健康對(duì)照者為對(duì)照組，其中男6例，女5例，年齡25～65歲，平均(47.2±11.8)歲。本研究通過(guò)棗陽(yáng)市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：市一倫20180819)，入組者或家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑和儀器：Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)Sigma公司)；CD4+T細(xì)胞分選試劑盒、CD8+T細(xì)胞分選試劑盒(德國(guó)美天旎公司)；抗CCR4-PE、抗CCR6-PE、抗CXCR3-PE、抗CD3-PerCP、抗CD4-PE、抗IL-9-APC(美國(guó)BD公司)；重組人IL-9、抗IL-9中和抗體(美國(guó)Peprotech公司)；IL-9、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國(guó)R&D公司)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(北京寶日生物技術(shù)有限公司)；CCK-8試劑盒、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(武漢碧云天公司)；穿孔素、顆粒酶B酶聯(lián)斑點(diǎn)吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)試劑盒(美國(guó)Abcam公司)。MCAS磁力分離架(德國(guó)美天旎公司)；FACS Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；微孔讀板儀(美國(guó)BioRad公司)；ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystem公司)；ELISPOT讀板儀(德國(guó)艾迪公司)。

1.2.2 血漿和外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)分離：于晨起空腹留取入組者抗凝外周血20 ml，于1000 g離心10 min收集上層血漿，-70 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。下層血?xì)胞使用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液、采用密度梯度離心法分離PBMCs，調(diào)整細(xì)胞濃度至107個(gè)/ml，加入含10 % DMSO的胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 BALF制備：經(jīng)活檢孔通過(guò)硅膠管向灌洗肺段注入利多卡因進(jìn)行局部麻醉，將纖維支氣管鏡頂端緊密楔入腫瘤部位亞段支氣管開(kāi)口處，經(jīng)硅膠管快速注入37 ℃無(wú)菌生理鹽水，共灌洗4次，每次50 ml。用100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)負(fù)壓吸引回收灌洗液，保證回收效率 >50%。用雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾灌洗液，記錄總量，導(dǎo)入無(wú)菌離心管中，于4 ℃、1000 g離心10 min，收集上清，-70 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩＝?jīng)離心沉淀的細(xì)胞成分使用Hank’s液洗滌2次，加入完全培養(yǎng)液(RPMI 1640培養(yǎng)液+10% FBS)，調(diào)整細(xì)胞濃度至106個(gè)/ml。對(duì)于可耐受灌洗的肺癌組患者，對(duì)未發(fā)生腫瘤的肺部也進(jìn)行灌洗，作為對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 原代NSCLC細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：對(duì)于接受手術(shù)的17例肺癌組患者，取新鮮的NSCLC組織，加入適量Hank’s液，去除組織中的血液、結(jié)締組織和脂肪組織，保留腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，用Hank’s液洗滌2次后加入少量RPMI 1640培養(yǎng)液，將組織剪成約1 mm3大小的碎塊。將組織碎塊轉(zhuǎn)入離心管中，用Hank’s液洗滌數(shù)次，組織碎塊自動(dòng)下沉后移除Hank’s液。將組織碎塊轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，加入5 ml膠原酶，吹散，置37 ℃恒溫?fù)u床、于150 次/min的速度下進(jìn)行消化，每隔30 min于顯微鏡下觀察1次。待組織碎塊呈絮狀、且透光性良好后，轉(zhuǎn)入離心管中，于1000 g離心10 min后棄上清，加入Hank’s液洗滌數(shù)次，反復(fù)吹打后于1000 g離心10 min后棄上清，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)板中，加入完全培養(yǎng)液，于37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.5 CD8+T細(xì)胞的純化：使用CD8+T細(xì)胞分選試劑盒對(duì)PBMCs和BALF中的CD8+細(xì)胞進(jìn)行分選。取107個(gè)細(xì)胞于4 ℃、300 g離心10 min，加入40 μl緩沖液重懸細(xì)胞，再加入10 μl生物素標(biāo)記的抗體雞尾酒，4 ℃孵育5 min，加入30 μl緩沖液和20 μl CD8+T細(xì)胞磁珠雞尾酒，4 ℃孵育10 min。用3 ml緩沖液浸潤(rùn)置于MACS分離架上的分離柱，加入標(biāo)記的細(xì)胞懸液，收集通過(guò)分離柱的細(xì)胞，即為CD8+T細(xì)胞。

1.2.6 Th9細(xì)胞(即CD4+CCR4-CCR6-CXCR3-細(xì)胞)的純化：首先使用CD4+T細(xì)胞分選試劑盒對(duì)PBMCs和BALF中的CD4+細(xì)胞進(jìn)行分選。取107個(gè)細(xì)胞于4 ℃、300 g離心10 min，加入40 μl緩沖液重懸細(xì)胞，再加入10 μl生物素標(biāo)記的抗體雞尾酒，4 ℃孵育5 min，加入30 μl緩沖液和20 μl CD4+T細(xì)胞磁珠雞尾酒，4 ℃孵育10 min。用3 ml緩沖液浸潤(rùn)置于MACS分離架上的分離柱，加入標(biāo)記的細(xì)胞懸液，收集通過(guò)分離柱的細(xì)胞，即為CD4+T細(xì)胞。隨后將純化的CD4+T細(xì)胞使用抗CCR4-PE、抗CCR6-PE和抗CXCR3-PE進(jìn)行染色，室溫避光孵育30 min后使用PBS洗滌2次，使用FACS Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行陰性分選，收集CCR4-CCR6-CXCR3-細(xì)胞，即為CD4+CCR4-CCR6-CXCR3-Th9細(xì)胞。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)：①取32例肺癌組患者PBMCs中分離的105個(gè)CD8+T細(xì)胞，接種于96孔板中，設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，其中3個(gè)復(fù)孔加入200 μl 完全培養(yǎng)液，另外3個(gè)復(fù)孔加入含有重組人IL-9(5 μg/L)的完全培養(yǎng)液刺激培養(yǎng)，12 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。②建立CD8+T細(xì)胞與原代NSCLC細(xì)胞直接接觸培養(yǎng)和間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)[6]。對(duì)21例接受手術(shù)治療的NSCLC患者收集其PBMCs和BALF中純化的CD8+T細(xì)胞，加入重組人IL-9(5 μg/L)刺激培養(yǎng)12 h，洗滌細(xì)胞2次，去除IL-9，再將105個(gè)CD8+T細(xì)胞與5×105個(gè)自體分離的原代NSCLC細(xì)胞共培養(yǎng)。在直接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD8+T細(xì)胞與原代NSCLC細(xì)胞直接混合，并加入抗CD3/CD28抗體(1 μg/L)刺激培養(yǎng)。在間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD8+T細(xì)胞與原代NSCLC細(xì)胞分別接種于Transwell培養(yǎng)平板的上層小室和下層培養(yǎng)孔中，上層小室底部為孔徑直徑為0.4 μm的濾膜，僅可溶性細(xì)胞因子可以通過(guò)，細(xì)胞不能通過(guò)濾膜，向上層小室中加入抗CD3/CD28抗體。培養(yǎng)48 h后收集上清，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。③為評(píng)估Th9細(xì)胞對(duì)CD8+T細(xì)胞的調(diào)控作用，對(duì)21例接受手術(shù)治療的NSCLC患者，將外周血純化的Th9細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞與原代NSCLC細(xì)胞，建立以下培養(yǎng)體系：①5×104個(gè)Th9細(xì)胞與5×105個(gè)自體分離的原代NSCLC細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)；②105個(gè)CD8+T細(xì)胞與5×105個(gè)自體分離的原代NSCLC細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)；③5×104個(gè)Th9細(xì)胞、105個(gè)CD8+T細(xì)胞與5×105個(gè)自體分離的原代NSCLC細(xì)胞共培養(yǎng)；④5×104個(gè)Th9細(xì)胞、105個(gè)CD8+T細(xì)胞與5×105個(gè)自體分離的原代NSCLC細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)加入抗IL-9中和抗體(5 μg/ml)。培養(yǎng)液中加入抗CD3/CD28抗體(1 μg/L)刺激培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后收集上清，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th9細(xì)胞：取106個(gè)PBMCs或BALF中分離的細(xì)胞，加入佛波酯(50 ng/ml)和伊烏諾霉素(1 μg/ml)刺激培養(yǎng)，同時(shí)加入莫能霉素(10 μg/ml)抑制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。培養(yǎng)6 h后，PBS洗滌2次，加入抗CD3-PerCP和抗CD4-PE進(jìn)行表面染色，室溫避光孵育30 min。PBS洗滌2次，然后加入破膜固定液，4 ℃避光孵育15 min，PBS洗滌2次，加入抗IL-9-APC進(jìn)行胞內(nèi)染色，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次。加入多聚甲醛固定，使用FACS Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀獲取細(xì)胞，F(xiàn)lowJo V10軟件分析結(jié)果。

1.2.9 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子水平：使用商品化ELISA試劑盒對(duì)血漿、BALF及培養(yǎng)上清中的IL-9、干擾素-γ和TNF-α水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.10 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量：取105個(gè)PBMCs或BALF中分離的細(xì)胞，使用Trizol試劑提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×緩沖液 2 μl、反轉(zhuǎn)錄酶混合物Ⅰ 0.5 μl、寡聚胸腺嘧啶引物 0.5 μl、隨機(jī)六核苷酸引物 0.5 μl、總RNA 1 μg，加入不含RNA酶的去離子水調(diào)整總體積至10 μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。TB Green實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：TB Green預(yù)混Taq酶 10 μl、上游引物(10 μmol/L) 0.4 μl、下游引物(10 μmol/L) 0.4 μl、ROX參考染料 0.4 μl、cDNA 2 μl、滅菌水 6.8 μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2-ΔΔCT法對(duì)目的片段的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。引物序列：①PU.1上游：5’ GAT CCG CCT GTA CCA GTT CC 3’，下游：5’ CTC CTT GTG CTT GGA CGA GA 3’；②β-肌動(dòng)蛋白上游：5’ TGG CAGC CAG CAC AAT GAA 3，下游：5’ CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A 3’。

1.2.11 細(xì)胞增殖試驗(yàn)：使用CCK-8試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作。在培養(yǎng)的最后4 h，向培養(yǎng)孔內(nèi)加入20 μl CCK-8反應(yīng)液，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液在450 nm處的吸光度，設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.12 ELISPOT檢測(cè)穿孔素和顆粒酶B的水平：使用預(yù)包被的穿孔素或顆粒酶B ELISPOT試劑盒檢測(cè)CD8+T細(xì)胞分泌穿孔素及顆粒酶B的水平。向PVDF預(yù)包被的平板中每孔加入100 μl PBS，室溫孵育10 min，吸干平板中的液體。向平板中每孔加入105個(gè)無(wú)IL-9刺激或經(jīng)IL-9刺激的CD8+T細(xì)胞，加入佛波酯(50 ng/ml)和伊烏諾霉素(1 μg/ml)，同時(shí)設(shè)立無(wú)刺激的陰性對(duì)照孔，總體積為100 μl，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)16 h，吸干平板中的液體，加入100 μl PBS-T，4 ℃孵育10 min，使用PBS-T洗板3次。向平板中每孔加入100 μl 1∶100稀釋的檢測(cè)抗體，室溫孵育90 min，使用PBS-T洗板3次。向平板中每孔加入100 μl 1∶5000稀釋的鏈霉親和素堿性磷酸酶，室溫孵育60 min，使用PBS-T洗板3次，使用流動(dòng)水沖洗PVDF膜的兩面，吸干液體后加入100 μl BCIP/NBT堿性磷酸酶底物顯色液，室溫孵育15 min。流動(dòng)水沖洗，吸干液體后使用ELISPOT讀板儀對(duì)斑點(diǎn)形成細(xì)胞(Spot forming cells，SFC)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.13 靶細(xì)胞死亡比例檢測(cè)：通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)上清中LDH計(jì)算原代NSCLC細(xì)胞的死亡比例。使用LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中LDH水平，以原代NSCLC細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH水平作為“低水平LDH對(duì)照”，以Triton X-100處理的原代NSCLC細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH水平作為“高水平LDH對(duì)照”，按以下公式計(jì)算靶細(xì)胞死亡比例：(樣本LDH水平-低水平LDH對(duì)照)/(高水平LDH對(duì)照-低水平LDH對(duì)照)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 肺癌組和對(duì)照組外周血及BALF中Th9細(xì)胞比例、IL-9水平及PU.1相對(duì)表達(dá)量比較 肺癌組及對(duì)照組外周血CD3+CD4+IL-9的Th9細(xì)胞典型流式散點(diǎn)圖見(jiàn)圖1。肺癌組外周血Th9占CD4+T細(xì)胞的比例顯著低于對(duì)照組，但外周血Th9細(xì)胞比例在肺鱗癌和肺腺癌中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤部位收集的BALF中Th9細(xì)胞比例顯著低于非腫瘤部位，但腫瘤部位收集的BALF中Th9細(xì)胞比例在肺鱗癌和肺腺癌中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺癌組外周血IL-9水平顯著低于對(duì)照組，但外周血IL-9水平在肺鱗癌和肺腺癌中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤部位收集的BALF中IL-9水平顯著低于非腫瘤部位，但腫瘤部位收集的BALF中IL-9水平在肺鱗癌和肺腺癌中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺癌組PBMCs中PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，但PBMCs中PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量在肺鱗癌和肺腺癌中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤部位收集BALF分離的細(xì)胞中PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于非腫瘤部位，但腫瘤部位BALF分離的細(xì)胞中PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)量在肺鱗癌和肺腺癌中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

圖1 對(duì)照組和肺癌組外周血Th9細(xì)胞典型流式分析散點(diǎn)圖

2.2 IL-9刺激對(duì)肺癌組患者外周血CD8+T細(xì)胞增殖及分泌穿孔素、顆粒酶B的影響 經(jīng)IL-9刺激的CD8+T細(xì)胞增殖顯著高于無(wú)IL-9刺激的CD8+T細(xì)胞，經(jīng)IL-9刺激的CD8+T細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶B的水平顯著高于無(wú)IL-9刺激的CD8+T細(xì)胞。見(jiàn)表2。

2.3 IL-9刺激對(duì)肺癌組患者外周血和BALF中CD8+T細(xì)胞功能的影響 經(jīng)IL-9刺激后，無(wú)論外周血分離的CD8+T細(xì)胞還是BALF中分離的CD8+T細(xì)胞，其細(xì)胞殺傷功能均顯著高于無(wú)IL-9刺激的CD8+T細(xì)胞，表現(xiàn)為在直接接觸和間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)原代NSCLC細(xì)胞死亡比率在經(jīng)IL-9刺激的CD8+T細(xì)胞中均顯著高于無(wú)IL-9刺激的CD8+T細(xì)胞。無(wú)論外周血分離的CD8+T細(xì)胞還是BALF中分離的CD8+T細(xì)胞，在直接接觸和間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)中，經(jīng)IL-9刺激后分泌干擾素-γ和TNF-α的水平均顯著高于無(wú)IL-9刺激的CD8+T細(xì)胞。見(jiàn)表3。

2.4 Th9細(xì)胞對(duì)肺癌組患者外周血CD8+T細(xì)胞功能的影響 Th9細(xì)胞誘導(dǎo)原代NSCLC細(xì)胞死亡比率極小，培養(yǎng)上清中檢測(cè)不到干擾素-γ和TNF-α。Th9細(xì)胞可增強(qiáng)肺癌組患者外周血CD8+T細(xì)胞的殺傷功能，表現(xiàn)為原代NSCLC細(xì)胞死亡比率升高，培養(yǎng)上清中干擾素-γ和TNF-α水平亦升高。而加入抗IL-9中和抗體則可抑制Th9細(xì)胞對(duì)CD8+T細(xì)胞殺傷功能的增強(qiáng)作用，表現(xiàn)為原代NSCLC細(xì)胞死亡比率降低，培養(yǎng)上清中干擾素-γ和TNF-α水平亦降低，見(jiàn)表4。

表1 對(duì)照組和肺癌組外周血BALF中Th9細(xì)胞比例、IL-9水平和PU.1相對(duì)表達(dá)量比較

表2 IL-9刺激對(duì)肺癌組患者外周血CD8+T細(xì)胞增殖及分泌穿孔素、顆粒酶B 的影響

表3 IL-9刺激對(duì)肺癌組患者外周血和BALF中CD8+T細(xì)胞功能的影響

表4 Th9細(xì)胞對(duì)肺癌組患者外周血CD8+T細(xì)胞功能的影響

3 討 論

Th9細(xì)胞在多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的Th9細(xì)胞可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散[7]，Th9細(xì)胞分泌的IL-9也可通過(guò)誘導(dǎo)血管生成促進(jìn)NSCLC腫瘤形成[8]。相反，miR-208b-5p可通過(guò)IL-9介導(dǎo)的STAT3信號(hào)通路抑制NSCLC細(xì)胞的侵襲和遷移[9]。IL-9還可直接通過(guò)刺激抗腫瘤M1型巨噬細(xì)胞的活化抑制黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移[10]。在黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移小鼠模型中，抑制IL-9可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤特異性Th9細(xì)胞可通過(guò)促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞向腫瘤組織的募集增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞抗腫瘤活性[11]。因此，Th9細(xì)胞及其分泌的IL-9在肺癌的發(fā)生發(fā)展中存在雙重功能，可能與不同腫瘤組織類型及不同疾病的免疫狀態(tài)有關(guān)[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Th9細(xì)胞、IL-9和PU.1在NSCLC患者外周血和腫瘤局部的水平降低，這與既往在結(jié)腸癌組織中的發(fā)現(xiàn)的IL-9水平降低結(jié)果一致，但卻與宮頸癌患者腫瘤浸潤(rùn)組織中所發(fā)現(xiàn)的IL-9 PU.1+T細(xì)胞水平升高的結(jié)果不盡相同[13]，這是可能是由于不同的腫瘤細(xì)胞系對(duì)Th9細(xì)胞和IL-9刺激的應(yīng)答存在差異造成的[14]，NSCLC患者中Th9細(xì)胞和IL-9水平降低可能與機(jī)體免疫應(yīng)答抑制有關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者分離的Th9細(xì)胞與自體原代NSCLC細(xì)胞共培養(yǎng)后，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的水平很低，提示NSCLC患者的Th9細(xì)胞的直接殺傷功能極低。這可能與兩個(gè)方面的因素有關(guān)：一方面，CD4+T細(xì)胞的直接細(xì)胞殺傷功能較弱，特別是CD4+CCR4-CCR6-CXCR3-Th9細(xì)胞主要分泌IL-9和IL-21[15]，不能發(fā)揮有效的細(xì)胞毒性作用。另一方面，NSCLC患者自身存在免疫功能不全甚至衰竭[16]，Th9細(xì)胞分泌的IL-9不但存在數(shù)量減低，還可能出現(xiàn)功能障礙，從而不能有效發(fā)揮免疫調(diào)控作用。

Th9細(xì)胞通過(guò)分泌IL-9顯著增強(qiáng)黑色素瘤小鼠模型的免疫應(yīng)答，抑制腫瘤生長(zhǎng)[17]。IL-9還可直接調(diào)控T細(xì)胞和漿細(xì)胞的增殖和功能，通過(guò)多種途徑發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用[18]。相反，IL-9還可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的分泌抑制單核細(xì)胞的功能，使機(jī)體免受過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答的影響[19-20]。因此，Th9細(xì)胞和IL-9在腫瘤免疫調(diào)控中亦存在雙重功能。CD8+T細(xì)胞是重要的抗腫瘤免疫細(xì)胞，而CD8+T細(xì)胞在腫瘤患者中存在功能不全甚至功能衰竭，無(wú)法有效清除腫瘤細(xì)胞，造成腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。肺癌患者中亦存在CD8+T細(xì)胞功能衰竭[21]，采用多種方式(如：免疫佐劑、直接刺激、基因編輯等)恢復(fù)CD8+T細(xì)胞功能已成為肺癌治療的研究熱點(diǎn)之一。在結(jié)腸癌中，Th9細(xì)胞可通過(guò)抑制CD8+T細(xì)胞中的PD-1/PD-L1信號(hào)通路促進(jìn)CD8+T細(xì)胞克隆性增殖[5]。在乳腺癌中，Th9細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-9和IL-21促進(jìn)CD8+T細(xì)胞抗腫瘤活性[15]。但尚未見(jiàn)到有關(guān)Th9細(xì)胞及其分泌的IL-9對(duì)NSCLC患者CD8+T細(xì)胞功能調(diào)控作用的相關(guān)報(bào)告。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然Th9細(xì)胞的毒性作用較弱，但Th9細(xì)胞可顯著增強(qiáng)NSCLC患者CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)的靶細(xì)胞死亡，抗IL-9中和抗體可抑制Th9細(xì)胞對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的增強(qiáng)效應(yīng)，提示Th9細(xì)胞主要通過(guò)分泌IL-9發(fā)揮調(diào)控NSCLC患者CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤活性，這與在乳腺癌中的研究結(jié)果一致[15]。進(jìn)一步對(duì)IL-9調(diào)控CD8+T細(xì)胞功能的機(jī)制進(jìn)行研究。第一，IL-9可促進(jìn)NSCLC患者CD8+T細(xì)胞的增殖，提示IL-9可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增加CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。第二，利用直接接觸和間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)，觀察CD8+T細(xì)胞的直接殺傷和非直接殺傷的功能在抗NSCLC中的作用。直接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD8+T細(xì)胞可通過(guò)依賴細(xì)胞間接觸的直接殺傷和分泌細(xì)胞因子介導(dǎo)的非直接殺傷之雙重功能發(fā)揮誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡的作用，在間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD8+T細(xì)胞僅通過(guò)細(xì)胞因子介導(dǎo)的非直接殺傷功能誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡[22]。IL-9刺激后，無(wú)論在直接接觸還是間接接觸培養(yǎng)中，NSCLC患者外周血和BALF中CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡的比例均增加，同時(shí)伴有干擾素-γ和TNF-α分泌水平增加，提示IL-9可直接促進(jìn)NSCLC患者的CD8+T細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子介導(dǎo)的非直接殺傷活性。第三，IL-9可直接促進(jìn)CD8+T細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶B，穿孔素和顆粒酶B均為CD8+T細(xì)胞發(fā)揮直接殺傷功能活性的重要介質(zhì)分子[23]，提示IL-9還可增強(qiáng)NSCLC患者CD8+T細(xì)胞的直接殺傷功能。因此，Th9細(xì)胞分泌的IL-9可能通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮促進(jìn)NSCLC患者CD8+T細(xì)胞活性的作用。但本研究?jī)H進(jìn)行了體外試驗(yàn)，且入組樣本數(shù)量相對(duì)較少，還需進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)并擴(kuò)大樣本量對(duì)結(jié)論進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，NSCLC患者中低表達(dá)的Th9細(xì)胞可能與NSCLC患者CD8+T細(xì)胞抗腫瘤活性降低有關(guān)，Th9細(xì)胞可能主要通過(guò)分泌IL-9增強(qiáng)NSCLC患者CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。