柴晴晴 武 文 劉鵬飛 李子松 王愛(ài)月 崔 波
(1.齊魯工業(yè)大學(xué)生物基材料與綠色造紙國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250353;2.齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 濟(jì)南 250353;3.解放軍第960醫(yī)院,山東 濟(jì)南 250031;4.山東興泉油脂有限公司,山東 臨沂 276600)
丙烯酰胺是淀粉食品高溫加工過(guò)程中產(chǎn)生的一種食品污染物,是一種具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、免疫毒性和致癌性的有害物質(zhì)[1]。1994年,國(guó)際癌癥研究所將其評(píng)定為2A類致癌物,即“人類可能致癌物”[2]。如何將食品加工過(guò)程中丙烯酰胺含量控制在安全水平也是亟需解決的問(wèn)題。文章擬結(jié)合近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究,對(duì)食品中丙烯酰胺的形成機(jī)理、檢測(cè)方法和控制措施進(jìn)行詳細(xì)介紹,旨在為切斷或控制食品中丙烯酰胺形成有效措施的提出提供依據(jù)。
食品中丙烯酰胺的形成是一個(gè)復(fù)雜的多階段反應(yīng)過(guò)程,目前,公認(rèn)的理論是“食品熱處理過(guò)程中丙烯酰胺的形成與美拉德(Maillard)反應(yīng)有關(guān),其前體物質(zhì)主要是還原糖與天冬酰胺[3-4]。此外,高油脂食物熱加工過(guò)程中也可通過(guò)丙烯醛途徑產(chǎn)生少量丙烯酰胺[5]。美拉德反應(yīng)期間丙烯酰胺的形成也支持這一理論[3-4]。
Maillard反應(yīng)是發(fā)生在羰基化合物與氨基化合物之間的非酶促褐變反應(yīng),是食品加工過(guò)程中產(chǎn)生風(fēng)味的重要途徑之一,其反應(yīng)過(guò)程分為3個(gè)階段:初期、中期和末期[6]。初期階段主要是還原糖與氨基化合物發(fā)生羰氨縮合及Amadori或Heyns分子重排,而食品中丙烯酰胺的產(chǎn)生主要是在此階段。研究[3-4,7]發(fā)現(xiàn),將還原糖和天冬酰胺以相同比例混合,并于>100 ℃下加熱一段時(shí)間,反應(yīng)體系中能檢測(cè)到大量丙烯酰胺產(chǎn)生,而Zyzak等[8]的同位素(13C和15N)示蹤研究結(jié)果也證明丙烯酰胺分子中的碳原子和氮原子均來(lái)源于天冬酰胺。Maillard反應(yīng)初期,還原糖與天冬酰胺先高溫脫水縮合生成具有高反應(yīng)活性的Schiff堿,并且可通過(guò)以下兩種方式生成丙烯酰胺:① 經(jīng)過(guò)Amadori分子重排生成Amadori產(chǎn)物,然后進(jìn)一步發(fā)生脫水脫氨反應(yīng)生成二羰基化合物,天冬酰胺和羰基化合物通過(guò)Strecker降解機(jī)制脫羧并脫氨,進(jìn)而生成丙烯酰胺[7]。② Schiff堿先經(jīng)過(guò)分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)生成唑烷酮,然后脫羧形成脫羧Amadori產(chǎn)物,而在高溫作用下該產(chǎn)物的C-N鍵斷裂,生成丙烯酰胺[3]。
對(duì)于含有大量天冬酰胺的高碳水化合物食品,尤其是馬鈴薯塊莖中的天冬酰胺,甚至可以占到游離氨基酸含量的50%以上,因此高溫加工的馬鈴薯產(chǎn)品中丙烯酰胺含量相對(duì)較高[8]。通過(guò)降低食品原料中其前體物質(zhì)(還原糖和天冬酰胺)含量可以有效控制丙烯酰胺的形成。
研究[9]發(fā)現(xiàn),在高脂肪食品的熱處理過(guò)程中,丙烯醛也會(huì)產(chǎn)生丙烯酰胺。食品中的甘油三油酸酯在高溫下熱解生成丙烯醛,丙烯醛及其氧化產(chǎn)物丙烯酸均可與氨反應(yīng)生成丙烯酰胺[9],因此可通過(guò)選擇不同種類的油脂來(lái)控制丙烯酰胺的形成[10]。同時(shí),丙烯酰胺也可在室溫下通過(guò)丙烯醛途徑形成,故一些低溫加工的食品同樣存在丙烯酰胺的污染問(wèn)題。
熱處理過(guò)程中,Maillard反應(yīng)賦予了食品獨(dú)特的風(fēng)味,同時(shí)也是高碳水化合物中丙烯酰胺形成的重要途徑。隨著丙烯酰胺形成機(jī)理和毒理學(xué)性質(zhì)研究的不斷深入,目前其在食品中檢測(cè)方法的研究已成為食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。由于食品系統(tǒng)的復(fù)雜性和食品中形成的丙烯酰胺含量低,色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)被廣泛使用并成為檢測(cè)丙烯酰胺的成熟方法。但隨著分析技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,其檢測(cè)方法也向多元化方向發(fā)展,如光譜法、生物傳感器法、酶聯(lián)免疫法等。
2.1.1 液相色譜及其聯(lián)用技術(shù) 液相色譜法(LC)的樣品前處理不需要進(jìn)行衍生化,是痕量分析物檢測(cè)中應(yīng)用較普遍的方法,其常用的有紫外(UV)和質(zhì)譜(MS)兩種檢測(cè)器。丙烯酰胺是一種不含強(qiáng)生色基團(tuán)的強(qiáng)極性分子,故在傳統(tǒng)反相吸附劑中保留值低而與其他共萃取成分的分離效果差,且LC-UV檢測(cè)的靈敏度和選擇性均不高,所以LC-UV通常僅被用于干淀粉含量制品中較高含量的丙烯酰胺檢測(cè)。而鑒于質(zhì)譜檢測(cè)器具有靈敏度高和選擇性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),LC-MS通常被用于食品體系中低含量丙烯酰胺的檢測(cè)[11-13]。中國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法 (LC-MS/MS) 是以13C3標(biāo)記的丙烯酰胺為內(nèi)標(biāo)溶液,水溶劑提取凈化處理后用LC-MS/MS測(cè)定食品中丙烯酰胺含量[14]。Karasek等[15]以水作溶劑提取樣品中的丙烯酰胺,通過(guò)兩步固相萃取去除萃取液中干擾成分,使用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)對(duì)烤栗子和栗子制品中丙烯酰胺含量進(jìn)行測(cè)定,其結(jié)果分別為8~1 278,4~159 μg/kg。Bortolomeazzi等[16]提出了一種利用C18、SCX和SAX 3種吸收劑的混合物制備的固相萃取(SPE)小柱對(duì)水提萃取液進(jìn)行快速純化處理,采用HPLC-MS/MS測(cè)定烘焙咖啡中丙烯酰胺含量的方法,結(jié)果顯示丙烯酰胺的回收率為92%~95%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)<5%,檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)分別為5,16 μg/kg。該方法的樣品前處理簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、重復(fù)性好,能滿足食品中低含量丙烯酰胺檢測(cè)的需求,適用檢測(cè)范圍廣,但自制固相萃取柱較麻煩,且成本相對(duì)較高。Tolgyesi等[17]建立的親水作用色譜法—串聯(lián)質(zhì)譜(HILIC-MS/MS)法以乙腈—水—甲酸(V乙腈∶V水∶V甲酸為69∶30∶1)為萃取劑提取樣品中的丙烯酰胺,離心后取上清液進(jìn)行稀釋過(guò)濾后即可進(jìn)行定量檢測(cè)(咖啡樣品除外),該法利用高度有機(jī)洗脫液增加丙酰胺在液相中保留時(shí)間的同時(shí)可以排除雜質(zhì)成分的干擾,大大增強(qiáng)了其檢測(cè)靈敏度,而d3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)物的添加可以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響,結(jié)果顯示丙烯酰胺的回收率為101%~105%,RSD(n=6)<7.6%,LOD和LOQ分別為8,20 μg/kg。與上述其他方法不同,該方法中的提取液無(wú)需復(fù)雜的純化處理過(guò)程,操作簡(jiǎn)單,能滿足食品中丙烯酰胺的快速、高效檢測(cè)的需求。
2.1.2 氣相色譜及其聯(lián)用技術(shù) 與液相色譜不同,氣相色譜法需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理以增強(qiáng)丙烯酰胺的穩(wěn)定性和揮發(fā)性,提高檢測(cè)靈敏度。GB/T 5009.204—2014采用穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)檢測(cè)食品中丙烯酰胺含量,在樣品中加入13C3標(biāo)記的丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)液,其水提取液利用基質(zhì)固相分散萃取凈化、溴試劑衍生,然后用GC-MS/MS的多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)或GC-MS的選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式進(jìn)行檢測(cè),該方法的LOQ為10 μg/kg。Luo等[18]建立了一種以二甲基亞砜為提取劑、9-羥基呫噸為衍生劑、同位素標(biāo)記的d3-丙烯酰胺為內(nèi)標(biāo)物,采用GC-MS法測(cè)定烘焙、煎炸食品中丙烯酰胺含量的方法。結(jié)果表明樣品的加標(biāo)回收率為90.1%~112.0%,RSD為2.3%~6.1%,LOD為0.7 μg/kg,該方法具有操作簡(jiǎn)單、高靈敏度和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),可用于各種加工食品中丙烯酰胺含量的測(cè)定。
生物傳感器是一種新的微量分析技術(shù)。其工作原理是分子識(shí)別元件與待測(cè)物體特異性結(jié)合并發(fā)生生化反應(yīng)。產(chǎn)生的生物信息通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成定量處理的光、電等信號(hào),并由儀器放大輸出,達(dá)到分析檢測(cè)的目的[19]。目前常利用血紅蛋白(Hb)和DNA將電化學(xué)分析與生物傳感器進(jìn)行結(jié)合,因其具有操作簡(jiǎn)單、選擇性強(qiáng)、靈敏度高、響應(yīng)迅速、重現(xiàn)性好和基本不受食品體系中其他成分干擾等優(yōu)點(diǎn),常被用于測(cè)定復(fù)雜食品體系中的丙烯酰胺含量[20]。如Li等[21]構(gòu)建了一種修飾的Hb離子液體碳糊電極(Hb/CILPE)的電化學(xué)生物傳感器,利用丙烯酰胺與Hb間的相互作用,檢測(cè)食品中丙烯酰胺含量,其檢測(cè)限可低至5.0×10-12mol/L(S/N=3)。Huang等[22]構(gòu)建了單鏈DNA修飾金電極(ssDNA/GE)的電化學(xué)生物傳感器用于丙烯酰胺測(cè)定,其檢測(cè)限為8.1 nmol/L,線性范圍為0.4~200.0 μmol/L。
酶聯(lián)免疫法是一種利用抗原和抗體之間的高度特異性結(jié)合,通過(guò)檢測(cè)酶催化底物產(chǎn)生的顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)分析物的方法,具有特異性高、操作簡(jiǎn)單、效率高等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)領(lǐng)域。作為小分子,丙烯酰胺本身沒(méi)有抗原決定簇和免疫原性[23],不能與相應(yīng)的單克隆抗體結(jié)合,因此丙烯酰胺經(jīng)常與具有免疫反應(yīng)的載體蛋白連接形成耦聯(lián),制備完整的抗原,然后通過(guò)免疫反應(yīng)刺激抗原產(chǎn)生抗體。Preston等[24]利用丙烯酰胺的3-巰基苯甲酸(3-MBA)衍生物作為半抗原與牛甲狀腺球蛋白耦合以制備抗原,并在免疫的大白兔上純化制備多克隆抗體,建立了通過(guò)檢測(cè)丙烯酰胺的3-MBA衍生物實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中丙烯酰胺進(jìn)行定量的免疫分析法。Wu等[25]針對(duì)4-巰基苯乙酸(4-MPA)衍生的丙烯酰胺制備了多克隆抗體,制備的抗體對(duì)該衍生物具有高度的結(jié)合親和力,而丙烯酰胺易與4-MPA發(fā)生高衍生化反應(yīng),基于此建立了丙烯酰胺分析前衍生化競(jìng)爭(zhēng)性間接酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)食品中丙烯酰胺含量的方法。與HPLC-MS/MS相比,該方法具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性,適用于食品中丙烯酰胺的低成本、快速篩查。
目前丙烯酰胺檢測(cè)常用的光譜法有比色法、紫外可見(jiàn)分光光度法和紅外光譜法等。如胡沁沁等[26]利用丙烯酰胺與谷胱甘肽之間的加成反應(yīng)及金納米顆粒的光學(xué)性質(zhì),建立了比色法用于丙烯酰胺的快速檢測(cè)。郝亞楠等[27]利用紫外分光光度法與HPLC法測(cè)定同一種樣品中丙烯酰胺含量,其結(jié)果分別為0.705,0.711 mg/kg,證明了紫外分光光度法具有較高的準(zhǔn)確度?;诟咛禺愋灾?近紅外信號(hào)剖面與監(jiān)控模式識(shí)別技術(shù),Wen[28]將便攜式紅外光譜儀用于薯片中丙烯酰胺的快速篩查和含量測(cè)定,同時(shí)驗(yàn)證了該方法的可行性,且模型預(yù)測(cè)的丙烯酰胺含量與采用LC-MS/MS實(shí)際測(cè)定的丙烯酰胺含量之間具有良好的線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)>0.92,預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤差為200~260 μg/kg。
此外,近紅外光譜與視覺(jué)反射成像的結(jié)合可用于丙烯酰胺的在線監(jiān)測(cè),實(shí)現(xiàn)丙烯酰胺高、低含量樣品的實(shí)時(shí)分離[29]。與目前常用的色譜法相比,雖然光譜法的靈敏度和精密度相對(duì)較低,但該方法具有操作簡(jiǎn)便、測(cè)量范圍廣和對(duì)儀器要求小等優(yōu)點(diǎn),適合丙烯酰胺的快速檢測(cè),便于在食品企業(yè)中推廣應(yīng)用。
Yang等[30]研究發(fā)現(xiàn),薯?xiàng)l中丙烯酰胺生成量與還原糖濃度呈顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.652,P≤0.01),與天冬酰胺濃度呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.432,P≤0.05),故降低天冬酰胺和還原糖含量可以減少丙烯酰胺的形成。Muttucumaru等[31-32]分析了馬鈴薯品種、貯藏時(shí)間和不同加工方式對(duì)還原糖、游離天冬酰胺和丙烯酰胺生成量的影響,同時(shí)比較了相同加工條件(160 ℃,20 min)下丙烯酰胺生成量和馬鈴薯中天冬酰胺及還原糖濃度的關(guān)系,結(jié)果表明不同品種的馬鈴薯中的還原糖和天冬酰胺含量均不同,且天冬酰胺和還原糖含量高的馬鈴薯經(jīng)過(guò)高溫加熱處理后生成的丙烯酰胺含量較高。這進(jìn)一步為通過(guò)選擇不同的馬鈴薯,即控制還原糖和天冬酰胺含量來(lái)控制丙烯酰胺的生成提供了理論依據(jù)。
3.2.1 原料預(yù)處理 對(duì)原料進(jìn)行浸泡處理,可以有效降低原料表面和內(nèi)部的還原糖及天冬酰胺含量,從而控制丙烯酰胺的形成。天冬酰胺酶的添加可以分解其前體物質(zhì)天冬酰胺,從而有效降低高溫處理過(guò)程中丙烯酰胺生成量[33-35]。Ismial等[36]研究也表明利用鹽溶液、L-半胱氨酸溶液及酸溶液對(duì)薯片進(jìn)行熱浸泡處理,炸薯片中丙烯酰胺的形成量可降低90%以上。Torang等[37]用蒸餾水清洗去除土豆切片表面淀粉后,通過(guò)熱水熱燙、天冬酰胺酶(市售天冬酰胺酶和/或產(chǎn)朊假絲酵母天冬酰胺酶)溶液浸泡、熱水熱燙—天冬酰胺酶溶液浸泡、氯化鈉和氯化鈣溶液浸泡、檸檬酸溶液浸泡等方式在油炸前對(duì)薯片進(jìn)行處理,再采用相同的條件進(jìn)行油炸,分析不同前處理方式對(duì)炸薯片中丙烯酰胺生成量的影響,結(jié)果表明天冬酰胺酶浸泡和熱燙處理均能有效降低丙烯酰胺生成量,且兩種酶復(fù)合使用或熱燙—天冬酰胺酶浸泡復(fù)合處理對(duì)丙烯酰胺形成的抑制效果顯著,其中熱燙—市售天冬酰胺酶復(fù)合處理可以將丙烯酰胺形成量降低95%。此外,檸檬酸、NaCl和CaCl2溶液浸泡處理也能減少丙烯酰胺的形成,其中檸檬酸的抑制效果最佳,說(shuō)明降低pH也是減少丙烯酰胺形成的有效途徑[37]。Genovese等[38]研究表明與熱燙處理相比,脈沖電場(chǎng)處理能更有效地抑制丙烯酰胺的形成。
3.2.2 溫度和時(shí)間的控制及煎炸用油的選擇 溫度是影響美拉德反應(yīng)的關(guān)鍵因素,也是影響丙烯酰胺形成的重要因素。Martinez等[39]用部分因子設(shè)計(jì)方法研究了溫度、油炸時(shí)間、熱燙處理和馬鈴薯片厚度對(duì)薯片中丙烯酰胺含量的影響,并采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)薯片的加工工藝參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果表明溫度和油炸時(shí)間對(duì)丙烯酰胺含量的貢獻(xiàn)較大。Torang等[37]研究了不同油炸條件對(duì)土豆片中丙烯酰胺形成的影響,結(jié)果顯示在150,165,180 ℃下,丙烯酰胺的生成量均因油炸時(shí)間的延長(zhǎng)而急劇增加,且其形成速率在t=1 min時(shí)達(dá)到最大,而隨著油炸溫度的升高,丙烯酰胺的生成速率也明顯加快。Bertuzzi等[40]研究發(fā)現(xiàn),咖啡焙烤過(guò)程中焙烤溫度隨時(shí)間(0~20 min)的延長(zhǎng)而升高,而丙烯酰胺濃度呈先升高后降低的趨勢(shì),并在10 min(175 ℃左右)時(shí)達(dá)到最高值,進(jìn)一步說(shuō)明了在咖啡焙烤過(guò)程中存在丙烯酰胺的形成和部分降解,同時(shí)也為通過(guò)控制加熱時(shí)間和溫度來(lái)降低食品中丙烯酰胺的含量提供了理論依據(jù)。
Lim等[41]研究了煎炸所用的4種植物油對(duì)甜薯薯片中丙烯酰胺含量的影響,結(jié)果表明在不飽和程度較低的油中油炸的甜薯薯片丙烯酰胺含量較低(1 443 μg/kg),而在不飽和程度較高的油中油炸的甜薯薯片丙烯酰胺含量較高(2 019 μg/kg)。而Zhang等[42]研究發(fā)現(xiàn),不飽和脂肪酸含量高的煎炸油不會(huì)引起丙烯酰胺生成量的增加,丙烯酰胺的形成與煎炸油的傳熱系數(shù)有關(guān),傳熱系數(shù)高的煎炸油會(huì)增加丙烯酰胺的形成量。因此,選擇合適的煎炸用油也是控制丙烯酰胺形成的有效途徑。
G?kmen等[43]在果糖—天冬酰胺模型體系中,研究了150,180 ℃下,陽(yáng)離子對(duì)丙烯酰胺形成的影響,結(jié)果表明:二價(jià)陽(yáng)離子幾乎可完全阻止丙烯酰胺的形成,而一價(jià)陽(yáng)離子僅可減少50%丙烯酰胺生成量。這可能與陽(yáng)離子能阻止丙烯酰胺中間產(chǎn)物Schiff堿的形成有關(guān)。A?ar等[44]的研究進(jìn)一步表明添加陽(yáng)離子可以有效控制熱加工過(guò)程中丙烯酰胺的形成,如添加1.0%乳酸鈣可將曲奇餅干中丙烯酰胺含量從(128±10) μg/kg降至(24±4) μg/kg。
Constantinou等[45]考察了天冬酰胺—糯玉米淀粉美拉德反應(yīng)模型體系中抗氧化劑(10種酚類物質(zhì))對(duì)丙烯酰胺生成的影響,結(jié)果顯示有9種酚類物質(zhì)對(duì)丙烯酰胺的形成有抑制作用,且酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和濃度會(huì)影響其對(duì)丙烯酰胺形成的抑制效果。其作用機(jī)理可能是抗氧化劑可以抑制油脂氧化,減少羧基化合物的形成,從而抑制丙烯酰胺的形成。作為一種天然抗氧化劑,花青素對(duì)丙烯酰胺的形成具有一定的抑制作用[46-47],這對(duì)于開(kāi)發(fā)一種安全的新型丙烯酰胺抑制劑,提高熱加工食品的使用安全性,具有十分重要的指導(dǎo)作用。而Qi等[48]的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),具有不同組成單元或鏈長(zhǎng)的原花青素對(duì)丙烯酰胺的形成具有相似的抑制活性,其抑制效果很大程度上取決于原花青素的添加量而非其結(jié)構(gòu)。
此外,在反應(yīng)原料中加入一定量的蛋白質(zhì)和氨基酸也會(huì)降低食品中的丙烯酰胺含量。Kim等[49]研究表明,游離氨基酸可以有效降低薯片中丙烯酰胺含量,其中以賴氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的降低效果最顯著,如添加0.5%的甘氨酸可使丙烯酰胺含量減少70%以上。然而,在配方中加入2%鷹嘴豆蛋也會(huì)減少油炸薯片中丙烯酰胺含量[50]。這可能是由于游離氨基酸與天冬酰胺競(jìng)爭(zhēng)以防止丙烯酰胺的形成,而蛋白質(zhì)可以與丙烯酰胺共價(jià)結(jié)合以降低其含量。因此,可以在不影響食品品質(zhì)的前提下,添加一定量的抑制劑以降低食品中丙烯酰胺含量。
丙烯酰胺廣泛存在于高碳水化合物的油炸和焙烤產(chǎn)品中,丙烯酰胺引起的食品安全問(wèn)題受到世界各界的廣泛關(guān)注。目前,研究的難點(diǎn)主要是如何在不影響產(chǎn)品質(zhì)量的情況下,切斷或控制食品加工過(guò)程中丙烯酰胺的形成。所以,深入研究丙烯酰胺的檢測(cè)方法和形成機(jī)理,提出降低食品中丙烯酰胺含量、消除食品安全隱患、保護(hù)消費(fèi)者健康的有效措施,將是未來(lái)研究的主要內(nèi)容之一。