賀寶玉，董秀芳，奚 倩，白 穎，隋 悅，啟 航*

（1 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連116034 2 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連116034 3 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 新疆阿拉爾843300）

海參是世界海八珍之首，其營養(yǎng)價值極高，幾千年來在中國和西方國家均作為滋補性食品食用。中國2017年海參的產(chǎn)量已達到22 萬t[1]。海參在加工儲藏過程中通常會出現(xiàn)質(zhì)量品質(zhì)下降等問題，而氧化是導(dǎo)致該問題的重要原因。肌肉蛋白質(zhì)的氧化會引起蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集，使得其結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變，營養(yǎng)成分降低，進而對其制品的外觀特性、功能特性、營養(yǎng)和感官特性產(chǎn)生較大的影響。

活性氧（Reactive Oxygen species，ROS），具有較高的化學(xué)反應(yīng)活性，可使細胞結(jié)構(gòu)和功能受到損壞，導(dǎo)致海參發(fā)生氧化損傷[2-4]。它的氧化涉及很多過程，如過氧化物、金屬離子和肌紅蛋白的氧化過程，它是很多水產(chǎn)品及其制品蛋白質(zhì)氧化的主要引發(fā)劑。蛋白質(zhì)氧化指的是蛋白質(zhì)的共價修飾，引發(fā)蛋白質(zhì)氧化的途徑有很多種，如金屬催化氧化，肌紅蛋白引發(fā)的氧化，脂質(zhì)氧化體系引發(fā)的氧化[5]。另外，溫度、光照、輻照、水分活度等其它因素的存在也會對蛋白質(zhì)和氨基酸的氧化產(chǎn)生影響。根據(jù)其氧化途徑可將蛋白質(zhì)氧化分成2 種：一種是蛋白質(zhì)和活性氧（ROS）直接反應(yīng)，另一種是蛋白質(zhì)與氧化應(yīng)激的二級副產(chǎn)物反應(yīng)[6-8]。蛋白質(zhì)發(fā)生氧化時，其天然結(jié)構(gòu)和完整性都會發(fā)生變化，這些變化不僅會影響產(chǎn)品品質(zhì)，而且還會發(fā)生許多物理和化學(xué)變化，包括氨基酸的破壞，酶活性喪失，蛋白質(zhì)消化率降低等[9-11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，海參在加熱處理過程中產(chǎn)生的自由基類物質(zhì)對海參的品質(zhì)有一定的影響。董秀芳等[12]研究發(fā)現(xiàn)，甘草、迷迭香、竹葉和綠茶等天然提取物與VC 作用相似，在低濃度時對模型有促進氧化作用，高濃度時有抗氧化作用，且抗氧化的能力較為相近。馮丁丁等[13]研究發(fā)現(xiàn)海參在熱加工過程中會產(chǎn)生脂質(zhì)類自由基，且自由基生成量與加熱溫度、加熱時間呈正相關(guān)關(guān)系。本研究以海參肌原纖維蛋白（Myofibrillar protein，MFP）為研究對象，檢測氧化對其化學(xué)結(jié)構(gòu)指標(biāo)以及微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響，闡明海參蛋白質(zhì)在不同氧化體系中的生物化學(xué)及其微觀結(jié)構(gòu)變化，以期為控制海參加工過程中由氧化引起的品質(zhì)變化提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料 海參（120～160 g），購自大連市劉家橋市場。

1.1.2 主要試劑 2，4-二硝基苯肼（DNPH）、5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）、奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox，水溶性維生素）、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺，美國Sigma-aldrich 公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、溴酚藍，生工生物工程（上海）股份有限公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 主要儀器與設(shè)備

AE-6500 ATTO 垂直電泳槽、AE-8135 ATTO 電泳儀電源，日本ATTO 株式會社；MFCHEMIBIS 2.0 凝膠成像儀，以色列DNR 成像系統(tǒng)有限公司；A810-03 冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡、F-2700 型熒光分光光度計，日本日立高新技術(shù)公司；M20 型酶標(biāo)定量測定儀，瑞士Tecan Infinite公司；T25 數(shù)顯勻漿機，德國IKA 集團。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料處理 將新鮮海參宰殺去臟，并將剝離出的海參筋于-80 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取 稱取4 g 海參筋，按照1∶5 的料液比加入50 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），勻漿（8 000 r/min，2 min），離心（10 000×g，4 ℃，15 min），棄去上清液。將所得沉淀重復(fù)上述操作2 次。所得沉淀按照1∶4 的比例加入0.6 mol/L KCl，高速勻漿（8 000 r/min，1 min），離心（10 000×g，4 ℃，15 min），取沉淀后再按照1∶4 的料液比加入0.6 mol/L NaCl，高速勻漿 （8 000 r/min，1 min），所得溶液經(jīng)兩層紗布過濾，取上清液，離心（10 000×g，4 ℃，15 min），所得沉淀即為肌原纖維蛋白。將肌原纖維蛋白存放在管中，置于冰上,儲存在4 ℃的環(huán)境中。

1.3.3 雙縮脲法檢測蛋白質(zhì)含量 取肌原纖維蛋白沉淀0.04 g，加入0.96 mL 水，劇烈振蕩。按照1∶4 的料液比加入雙縮脲試劑，靜置30 min 后，檢測波長540 nm 處的吸光值。每組3 個平行。用牛血清蛋白制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 肌原纖維蛋白的氧化 將肌原纖維蛋白懸浮液 （20 mg/mL）在由0.01 mmol/L FeCl3，0.1 mmol/L 抗壞血酸與2 種濃度的H2O2（10 mmol/L和50 mmol/L）組成的氧化系統(tǒng)中于4 ℃分別氧化3，6，9，12 h，加入水溶性維生素（1 mmol/L）終止氧化反應(yīng)。對照組不進行氧化處理。

1.3.5 肌原纖維蛋白一級結(jié)構(gòu)的測定

1.3.5.1 羰基含量的測定 用2，4-二硝基苯肼（DNPH）比色法測定樣品中的羰基含量。取200 μL 肌原纖維蛋白樣品加入400 μL 的DNPH（10 mmol/L），對照組加入400 μL HCl（2 mol/L），遮光反應(yīng)1 h。在此期間每10 min 振蕩一次。加入500 μL 20% 三氯乙酸（TCA），振蕩30 s，在冰浴中靜置30 min，離心（12 000×g，4 ℃，15 min），棄去上清液。加入1 mL 乙醇和乙酸乙酯（體積比1:1）的混合物洗滌3 次，每次清洗后離心（12 000×g，4 ℃，15 min）。加入250 μL 的鹽酸胍（6 mol/L），混勻，37 ℃水浴15 min 后離心（12 000×g，15 min），取上清。檢測波長370 nm 處的吸光值。使用22 000 L·mol-1cm-1的摩爾吸光系數(shù)計算羰基含量。

1.3.5.2 游離巰基含量的測定 使用5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）方法測定各組肌原纖維蛋白樣品的游離巰基含量。將肌原纖維蛋白樣品溶解在三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸（Tris-Gly）-8 mol/L 尿素溶液中，并與DTNB 試劑在37 ℃下孵育30 min，檢測波長412 nm 處的吸光值。試劑空白和樣品空白同時測量。使用13 600 L·mol-1cm-1的摩爾吸光系數(shù)計算游離巰基含量。

1.3.5.3 游離氨基含量的測定 游離氨基含量的測定參考Habeeb[14]的方法。將50 μL 肌原纖維蛋白樣品溶解在500 μL 含有1%十二烷基硫酸鈉（SDS）的0.2 mol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 8.2）中，然后溶 解 于250 μL 0.01% 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）。避光條件下，50 ℃反應(yīng)30 min。用500 μL 0.1 mol/L 亞硫酸鈉終止反應(yīng)，室溫放置15 min。讀取波長420 nm 處的吸光度，用L-亮氨酸（1% SDS）制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于游離氨基含量計算。

1.3.6 色氨酸的測定 將肌原纖維蛋白樣品用含0.6 mol/L NaCl 的PBS （pH 6.25）稀釋到10 mg/mL，在激發(fā)波長283 nm 處記錄在300～400 nm 的發(fā)射光譜，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度設(shè)定為5 nm，并以500 nm/min 的速率收集數(shù)據(jù)。為消除干擾，在相同條件下，將溶劑發(fā)射光譜從光譜中扣除。光譜測量數(shù)據(jù)在3 次試驗中取平均值。

1.3.7 肌原纖維蛋白交聯(lián)聚集情況的測定 通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDSPAGE）方法，使用5%濃縮膠和10%分離膠對蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集情況進行分析。將肌原纖維蛋白樣品進行離心（4 ℃，12 000×g，15 min）。取上清液與上樣緩沖液（含有或不含有5% β-巰基乙醇）按照體積比1∶1 的比例混合并煮沸5 min。上樣量為40 μg。取出膠后，用含有0.05%的考馬斯亮藍R-250 染色。采用脫色液（含50%無水乙醇，9%冰醋酸）脫色，最后用凝膠成像儀的可見光成像系統(tǒng)成像。

1.3.8 肌原纖維蛋白微觀結(jié)構(gòu)的測定 將肌原纖維蛋白溶液（40 mg/mL）注射至樣品臺，液氮冷凍后，轉(zhuǎn)移到冷場電鏡冷凍隧道的真空室內(nèi)于-90℃升華5 min。用氬氣噴涂90 s，將噴涂后的樣品放回掃描電鏡冷臺，在15 kV 下掃描，并于放大1 500 倍下，觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 試驗數(shù)據(jù)以3 個平行組數(shù)據(jù)的平均值表示，并且計算標(biāo)準(zhǔn)差；用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 海參肌原纖維蛋白在不同羥自由基氧化體系中羰基含量的變化

如圖1所示，未氧化的肌原纖維蛋白的羰基含量為（3.15±0.17）nmol/mg 蛋白。當(dāng)H2O2濃度為10 mmol/L 時，羰基含量在3 h 時顯著升高，達到最高值（4.31±0.32）nmol/mg 蛋白，與對照組相比增加了37%，隨著氧化時間的增加，羰基含量開始減少，12 h 時下降至 （2.93±0.06）nmol/mg 蛋白；當(dāng)H2O2濃度為50 mmol/L 時，羰基含量在3 h時出現(xiàn)了減小的趨勢，與對照組相比下降了22%，在6，9 h 時保持在較為穩(wěn)定的狀態(tài)，直至12 h 羰基含量顯著增加，與對照組相比增加了25%。當(dāng)氧化時間為3，6，9 h 時，H2O2濃度為10 mmol/L 與濃度為50 mmol/L 相比生成的羰基含量較多，到達12 h 時恰好相反。在劇烈氧化的條件下，生成的羰基加速了親和物質(zhì)的反應(yīng)，從而使羰基含量減少[15]。肌原纖維蛋白樣品的氧化將降低羰基含量，同時氨基酸側(cè)鏈殘基的氧化和外源氨基的引入將增加羰基含量。Li 等[16]發(fā)現(xiàn)將鯉魚肌原纖維蛋白暴露在羥自由基氧化體系中時，隨著H2O2濃度的增加，羰基含量逐漸增加，與本試驗結(jié)果一致。

2.2 海參肌原纖維蛋白在不同羥自由基氧化體系中巰基含量的變化

肌原纖維蛋白樣品暴露于羥自由基氧化系統(tǒng)時，游離巰基含量降低。如圖2所示，未氧化的肌原纖維蛋白樣品的游離巰基含量為（12.17±0.54）μmol/g 蛋白。肌原纖維蛋白樣品的游離巰基含量隨著氧化時間的延長，整體都呈下降趨勢，且在3 h 和6 h 時下降程度劇烈，隨后呈現(xiàn)略微下降的趨勢。氧化12 h 后，游離巰基含量分別下降40.25%和45.44%（P＜0.05）。任意氧化時間中，置于50 mmol/L H2O2的肌原纖維蛋白樣品的游離巰基含量與置于10 mmol/L H2O2的樣品的巰基含量相比較高。肌原纖維蛋白富含巰基基團，氧化會破壞肌原纖維蛋白的空間結(jié)構(gòu)，暴露更多的巰基，并被氧化成二硫鍵，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)聚合[17]，或者巰基進一步被氧化成磺酸或其它氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致巰基含量降低。Wang 等[18]研究了鯉魚凍藏和加熱后的肌原纖維蛋白巰基的變化情況，結(jié)果顯示，加熱后的肌原纖維蛋白樣品更易受到氧化，而且隨著加熱溫度的提高，巰基含量逐漸減少。該結(jié)果與本研究得到的結(jié)果一致。

2.3 海參肌原纖維蛋白在不同羥自由基氧化體系中游離氨基含量的變化

如圖3所示，未氧化的肌原纖維蛋白樣品游離氨基的含量為（2.53±0.17）μmol/g 蛋白。當(dāng)H2O2的濃度為10 mmol/L 時，游離氨基的降低程度無顯著性差異。氧化時間為12 h 時，與未氧化的樣品相比，氧化的肌原纖維蛋白的游離氨基含量僅下降6.36%。當(dāng)H2O2濃度增加到50 mmol/L 時，游離氨基含量隨著氧化時間的增加呈現(xiàn)顯著下降的趨勢。與未氧化的肌原纖維蛋白樣品相比，6 h 時游離氨基含量下降程度最為劇烈，為（0.54±0.13）μmol/g 蛋白，與對照組相比下降了79%。隨著氧化時間的增加，游離氨基的含量顯示出略微增加的趨勢，但與對照組相比，氧化時間為12 h 時，樣品的游離氨含量降低了65.25%。氧化過程中生成的羰基可與氨基共價結(jié)合以進行羰基化反應(yīng)，進一步降低游離氨基的含量[19]。Chen 等[20]研究了豬肉肌原纖維蛋白在氧化前、后的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示，游離氨基的含量隨著氧化劑濃度的增加發(fā)生顯著的下降，這與本研究得到的結(jié)果一致。

圖1 海參肌原纖維蛋白在不同羥自由基氧化體系中羰基含量的變化Fig.1 Changes of carbonyl contents of sea cucumber myofibrillar protein in different hydroxyl radical oxidation systems

圖2 海參肌原纖維蛋白在不同羥自由基氧化體系中游離巰基含量的變化Fig.2 Changes of free sulfhydryl contents of sea cucumber myofibrillar proteins in different hydroxyl radical oxidation systems

圖3 海參肌原纖維蛋白在不同羥自由基氧化體系中游離氨基含量的變化Fig.3 Changes of free amino contents of sea cucumber myofibrillar protein in different hydroxyl radical oxidation systems

2.4 海參肌原纖維蛋白在不同羥自由基氧化體系中內(nèi)源色氨酸的變化

從圖4中可以看出，在兩種羥自由基氧化體系中，隨著氧化時間的增加，肌原纖維蛋白樣品色氨酸的熒光強度均發(fā)生了顯著降低。當(dāng)肌原纖維蛋白樣品暴露于H2O2濃度為10 mmol/L 和50 mmol/L 的羥自由基基氧化系統(tǒng)時，與對照樣品相比，氧化時間為12 h 的色氨酸熒光強度分別降低了39%和40%。Cao 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)氧化的豬肌原纖維蛋白與經(jīng)過氧化的樣品相比，色氨酸熒光強度顯著降低。說明當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于折疊狀態(tài)時，色氨酸殘基主要位于蛋白質(zhì)內(nèi)核的疏水環(huán)境中，此時被激發(fā)的色氨酸具有較高的熒光強度；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)部分或者完全展開時，色氨酸暴露于溶劑的極性環(huán)境中，使蛋白質(zhì)的熒光強度降低。

2.5 海參在不同羥自由基氧化體系中的蛋白質(zhì)氧化情況

從圖5中可以清楚地看出4 個主要的條帶：分別是上樣孔位置條帶 （Ⅰ）、肌球蛋白重鏈（MHC）、副肌球蛋白 （Paramyosin）、肌動蛋白（Actin）。由非還原條件下（未加入β-巰基乙醇）的電泳圖譜可知，隨著氧化時間的延長，蛋白質(zhì)聚集的程度增加，12 h 時，蛋白質(zhì)在上樣孔附近聚集量最大；在還原條件下（加入β-巰基乙醇）的樣品，蛋白質(zhì)的聚合程度較非還原條件下的樣品減少，MHC 條帶加深，說明肌原纖維蛋白的聚集是由于二硫鍵的形成而引起的，該結(jié)果與孫悅等[22]報道的巰基容易受到羥自由基攻擊而轉(zhuǎn)化成分子內(nèi)或者分子間二硫鍵，使蛋白發(fā)生交聯(lián)聚合的結(jié)果相一致。

圖4 海參肌原纖維蛋白在不同羥自由基氧化體系中內(nèi)源色氨酸的變化Fig.4 Changes of tryptophan in different hydroxyl radical oxidation systems of sea cucumber myofibrillar protein

圖5 海參肌原纖維蛋白在不同羥自由基氧化體系中蛋白質(zhì)的聚集情況Fig.5 Protein aggregation of sea cucumber myofibrillar protein in different hydroxyl radical oxidation systems

2.6 海參在不同羥自由基氧化體系中微觀結(jié)構(gòu)的變化

從圖6中可以看出，未經(jīng)過氧化處理的肌原纖維蛋白樣品的結(jié)構(gòu)較為疏松，具有較粗的網(wǎng)絡(luò)和較大的空隙或空腔。隨著氧化時間的增加，暴露于10 mmol/L 和50 mmol/L 的羥自由基氧化體系中的肌原纖維蛋白樣品隨著氧化時間的增加結(jié)構(gòu)均變得致密，氧化12 h 時，結(jié)構(gòu)最致密，說明氧化時間越長，氧化程度越劇烈，蛋白質(zhì)的鉸鏈程度越高，整體結(jié)構(gòu)越致密。從圖5的蛋白質(zhì)條帶中也可以看出，氧化可能促進了蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集，從而使其微觀結(jié)構(gòu)變得緊密。Sun 等[23]通過觀察添加不同水平的氧化劑處理后的豬肉肌原纖維微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)氧化劑可導(dǎo)致絲狀卷曲結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，氧化肌原纖維表面結(jié)構(gòu)的形成歸因于氨基酸側(cè)鏈的修飾，使蛋白質(zhì)在分子內(nèi)和分子間產(chǎn)生交聯(lián)和聚集。

圖6 海參肌原纖維蛋白在不同羥自由基氧化體系中微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig.6 Microstructural changes of sea cucumber myofibrillar proteins in different hydroxyl radical oxidation systems

3 結(jié)論

當(dāng)海參肌原纖維蛋白于2 種不同濃度的羥自由基氧化體系（0.01 mol/L FeCl3/0.1 mol/L VC/10 mmol/L H2O2和0.01 mol/L FeCl3/0.1 mol/L VC/50 mmol/L H2O2）中氧化不同時間（3，6，9，12 h）時，其生物化學(xué)和微觀結(jié)構(gòu)均會發(fā)生改變，進而導(dǎo)致海參品質(zhì)發(fā)生變化。海參肌原纖維蛋白發(fā)生了以二硫鍵形成為主要因素的蛋白質(zhì)聚集，該結(jié)果對控制加工過程中海參體內(nèi)發(fā)生的氧化反應(yīng)，從而控制產(chǎn)品質(zhì)量提供一定的參考依據(jù)。