許雪兒，李 娟，陳正行*

（1 鹽城工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥品與健康學(xué)院 江蘇鹽城224005 2 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 江蘇無錫214122）

生育酚作為維生素E 的水解產(chǎn)物，是一類天然的、脂溶性抗氧化劑。近年來因其較強(qiáng)的抗氧化性，故被廣泛運(yùn)用在嬰兒食品、強(qiáng)化食品等產(chǎn)品中。然而，其水不溶性及對(duì)光、熱不穩(wěn)定等因素[1]往往影響其應(yīng)用。本文擬通過構(gòu)建復(fù)合阿拉伯膠的玉米醇溶蛋白納米顆粒運(yùn)載體系，對(duì)生育酚進(jìn)行高效負(fù)載以提高其生物利用率。玉米醇溶蛋白（zein）作為一類兩親性的生物大分子物質(zhì)，占據(jù)了玉米蛋白含量的60%[2]。玉米作為我國(guó)年產(chǎn)量較高的糧食作物，除了滿足日常飲食需要外，20%的玉米常用以制備玉米淀粉，因此在玉米淀粉的分離產(chǎn)物中，玉米蛋白的產(chǎn)量也相對(duì)較大，因蛋白質(zhì)組成和配比不符合人體必需氨基酸的需求而不被重視與利用[3]。zein 含有較多的疏水氨基酸，缺乏帶電的酸性氨基酸和堿性氨基酸。zein 獨(dú)特的氨基酸構(gòu)成也直接影響其溶解性，zein 不能溶解于水和無水乙醇中，只能溶于35%～90%乙醇[4]。其獨(dú)特的兩親性、成膜性以及凝膠性等性能使得zein 在納米顆粒等運(yùn)載體系中應(yīng)用廣泛，而其水不溶性和不穩(wěn)定性限制了在生物大分子運(yùn)載體系中的應(yīng)用[3]。阿拉伯膠（Arabic gum，AG）作為一類天然的陰離子多糖，分子鏈上的蛋白質(zhì)和鼠李糖使得AG具有良好的親水親油性，此外通過AG 與zein 的結(jié)合可提高zein 納米顆粒的水溶解性，還能保護(hù)生育酚不被胃部環(huán)境消化，在腸部得到有效降解[5]。王麗娟[6]通過制備果膠-zein 納米顆粒運(yùn)載體系負(fù)載姜黃素。尹業(yè)充[7]通過制備負(fù)載百里香酚的zein 納米顆粒以提高百里香酚負(fù)載率的同時(shí)，達(dá)到抑菌作用。

本文通過反溶劑法制備zein/AG-TOC 的納米顆粒，研究不同zein∶GA 比例，不同攪拌速度對(duì)zein-AG 納米顆粒穩(wěn)定性的影響；分析不同pH值，不同鹽離子濃度對(duì)負(fù)載TOC 的zein-AG 納米顆粒穩(wěn)定性的影響，以及對(duì)zein/AG-TOC 納米顆粒的抗氧化性和胃腸道緩釋能力進(jìn)行研究，為探究zein/AG 納米顆粒負(fù)載疏水性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白，河南華瑞生物科技有限公司；阿拉伯膠、α-生育酚，美國(guó)sigma 試劑公司；氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、石油醚等試劑均為分析純級(jí)，上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器，IKA 儀器公司；CR21G 型冷凍干燥機(jī)，日本日立公司；Zetasizer Nano 納米粒度及電位測(cè)定儀，英國(guó)馬爾文儀器公司；WFZ UV-2000 型紫外分光光度計(jì)，上海尤尼柯有限公司；LXJ-IIB 型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭儀器廠；DHG-9101o3SA 型恒溫干燥箱，上海三發(fā)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 納米顆粒制備 首先制備含zein 的乙醇溶液：稱量0.5 g zein 至10 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液中，并將含zein 的乙醇溶液置于磁力攪拌器上以200 r/min 的速度攪拌30 min 備用；其次，制備AG 的水溶液：稱量2 g AG 置于去離子水中并置于磁力攪拌器上以200 r/min 的速度攪拌1 h備用；最后開始制備納米顆粒：移取一定量的含zein 的乙醇溶液快速滴至體積為38.9 mL 的蒸餾水中得到zein 納米顆粒，然后按照不同zein∶AG比例移取不同體積的AG 水溶液至zein 納米顆粒中，分別置于磁力攪拌器上攪拌60 min 后，以4 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min 后，其上清液即為zein-AG 復(fù)合納米顆粒[8]。

1.3.2 不同zein∶AG 比例下納米顆粒粒徑、電位、多分散指數(shù)（Polydispersity index，PDI）測(cè)定 移取800 μL 含zein 的乙醇溶液快速滴至體積為38.9 mL 的蒸餾水中得到zein 納米顆粒，然后按照不同zein∶AG（20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶2.5，1∶5）比例移取不同體積的AG 水溶液至zein 納米顆粒中，置于磁力攪拌器上攪拌60 min 后，以4 000/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min 后，其上清液即為zein-AG 復(fù)合納米顆粒。將所得到的zein-AG 復(fù)合納米顆粒用去離子水稀釋10 倍，于渦旋振蕩器上渦旋1 min 待分散均勻后，移取1 mL 稀釋后的樣品放入納米粒度電位儀的樣品池中進(jìn)行測(cè)定[9]。

1.3.3 不同攪拌速度下納米顆粒粒徑、電位、PDI測(cè)定 在納米顆粒的制備過程中以不同的攪拌速度（300，400，500，600，700，800，900，1 000，1 100，1 200，1 300 r/min）制備納米顆粒，其它步驟同1.3.1 節(jié)（固定zein∶AG=1∶1.5）。

1.3.4 負(fù)載TOC 的納米顆粒制備 按照zein-AG∶TOC 為1∶5 在1.3.2 節(jié)中制備所得的含zein的乙醇溶液中移入TOC，得到負(fù)載TOC 的含zein的乙醇溶液；隨后移取800 μL 負(fù)載TOC 的含zein的乙醇溶液，按照1.3.2 節(jié)的后續(xù)步驟制備得到zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒。

1.3.5 pH 值對(duì)zein/AG-TOC 納米顆粒穩(wěn)定性的影響 用pH 值范圍在3～9 的磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)納米顆粒的pH 值為3～9，隨后分別取1 mL pH=3～9 的zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒并稀釋10倍，在渦旋振蕩器上分散均勻后移取1 mL 不同pH 值的納米顆粒放入樣品池后測(cè)定其粒徑、電位和PDI。

1.3.6 不同鹽離子濃度下納米顆粒粒徑、電位、PDI 測(cè)定 分別取10 mL zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒置于50 mL 的離心管，隨后，每管分別加入10 mL 濃度為0～100 mmol/L 的NaCl 溶液，使得鹽溶液能夠充分混合納米顆粒，并于室溫下靜置30 min。移取1 mL 不同鹽離子濃度破壞的zein/AGTOC 復(fù)合納米顆粒并將其稀釋至10 倍，振蕩均勻后移取1 mL 置于樣品池中待測(cè)。

1.3.7 zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒抗氧化性的測(cè)定 參照任曉鳴[10]的方法對(duì)zein-AG 納米顆粒和zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒的抗氧化性（對(duì)DPPH自由基清除能力、超氧陰離子清除能力以及ABTS清除能力）進(jìn)行測(cè)定，取1 mL zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒分別與相應(yīng)溶液混合后于分光光度計(jì)下進(jìn)行吸光值測(cè)定，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)計(jì)算。

1.3.8 zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒模擬胃腸道消化反應(yīng) 對(duì)zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒根據(jù)王濤[11]的方法進(jìn)行模擬胃腸道消化的反應(yīng)。先進(jìn)行模擬胃部消化環(huán)境，移取50 mL 新鮮制備所得的zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒置于離心管中，并用1 mol/L 的HCl 溶液調(diào)節(jié)待消化樣品的pH 值至2.0，隨后添加胃蛋白酶（20 mL，18 mg/L）并置于水浴搖床中在37 ℃的條件下進(jìn)行胃部模擬消化反應(yīng)，消化時(shí)間共計(jì)120 min。同時(shí)，先后在10，20，30，45，60，75，90，105，120 min 的時(shí)間節(jié)點(diǎn)移取一定量體積的胃部消化液對(duì)其TOC 含量進(jìn)行測(cè)定。胃部模擬消化結(jié)束后，用1 mol/L 的NaOH 溶液將經(jīng)過120 min 胃部消化后的消化液的pH 值調(diào)節(jié)至7.0，并加入0.06 g 胰蛋白酶以模擬腸道消化環(huán)境，腸部消化時(shí)間為120 min。先后在腸部模擬消化時(shí)間為10，20，30，45，60，75，90，105，120 min時(shí)移取一定量的腸部消化液測(cè)定其TOC 含量。消化液中的TOC 的具體測(cè)定步驟為：移取定量體積的待測(cè)胃、腸部消化液與2 mL 的乙酸乙酯于渦旋振蕩器中分散均勻，以充分提取待測(cè)樣液中的TOC，隨后取上清液的有機(jī)相置于276 nm 波長(zhǎng)下的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度的測(cè)定，將測(cè)定所得吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)消化液中釋放的生育酚的濃度。按照以下公式對(duì)模擬胃腸道消化所得的待測(cè)液中生育酚的釋放速率進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行生育酚的胃腸部釋放動(dòng)力學(xué)的線性擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 zein∶AG 比例對(duì)zein-AG 復(fù)合納米顆 粒的粒徑、PDI、電位值的影響

從圖1a 中可以看出，當(dāng)AG 含量增大時(shí)，zein-AG 復(fù)合納米顆粒的粒徑隨之呈現(xiàn)先變小后逐漸于穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)AG 添加量為zein∶AG=20∶1 時(shí)，納米顆粒不穩(wěn)定，粒徑為微米級(jí)，PDI 為1，表明此時(shí)體系中的橋狀絮凝較嚴(yán)重，未有納米顆粒形成；當(dāng)AG 添加量為zein∶AG=10∶1 時(shí)，橋狀絮凝現(xiàn)象減弱，且體系中逐漸形成納米顆粒，但體系仍不穩(wěn)定；因此，這兩個(gè)比例下納米顆粒的粒徑等數(shù)據(jù)均未顯示在圖1中。當(dāng)AG 添加量達(dá)到zein∶AG=5∶1 時(shí)，體系中納米顆粒出現(xiàn)，并呈現(xiàn)乳光特性，粒徑達(dá)到納米級(jí)，PDI 也小于0.5。直到體系中AG 的添加量達(dá)到zein∶AG=1∶1.5 時(shí)，納米顆粒粒徑體系穩(wěn)定，粒徑、PDI 無顯著變化，此時(shí)，再增大AG 的量對(duì)于體系穩(wěn)定性均無顯著影響。因此，從節(jié)約成本及體系穩(wěn)定的角度來看，zein∶AG比例在1∶1.5 時(shí)為最優(yōu)的復(fù)合納米顆粒配比。這可能是由于AG 的量不足以穩(wěn)定zein 納米顆粒時(shí)，AG 分子的加入破壞了zein 分子間的穩(wěn)定，并在分子間形成絮凝結(jié)構(gòu)，當(dāng)AG 分子足夠穩(wěn)定zein分子時(shí)，兩者通過分子間相互作用形成復(fù)合納米顆粒，既穩(wěn)定了zein 分子，也有利于體系的穩(wěn)定性。該試驗(yàn)結(jié)果與黃曉霞[12]研究zein 復(fù)合果膠形成的納米顆粒所形成的結(jié)果相一致。

圖1 不同zein∶AG 比例下zein-AG 納米顆粒粒徑、PDI（a）、電位（b）圖Fig.1 The effect of the different ratios of zein∶AG in the particle size，PDI （a），zeta-potential （b）of the zein-AG nanoparticles

2.2 攪拌速度對(duì)zein-AG 納米顆粒的粒徑、PDI、電位值的影響

如圖2所示，攪拌速度小于400 r/min 時(shí)，體系較穩(wěn)定，但形成的納米顆粒粒徑較大，且PDI 值較大，表明攪拌速度不足以形成足夠穩(wěn)定的納米顆粒體系；當(dāng)攪拌速度達(dá)到800 r/min 時(shí)，體系納米顆粒粒徑最低，PDI 值最小，電位也最穩(wěn)定；當(dāng)攪拌速度提高至1 300 r/min 時(shí)，體系再次趨于不穩(wěn)定，且zein 出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，原因可能是較快的攪拌速度來不及形成穩(wěn)定的復(fù)合納米顆粒，而剪切力直接破壞了zein 納米顆粒的穩(wěn)定性，使得分子之間嚴(yán)重絮凝結(jié)塊，無法生成穩(wěn)定的納米體系。因此，在制備復(fù)合納米顆粒時(shí)，選擇攪拌速度800 r/min 為最適納米顆粒的形成速度。Gagliardi 等[13]在研究zein 基納米顆粒的形成時(shí)也表明，攪拌速度對(duì)體系造成的剪切力會(huì)直接影響納米顆粒的形成狀態(tài)，故應(yīng)合理設(shè)置攪拌速度以保證體系納米顆粒的完全形成。

圖2 不同攪拌速度對(duì)zein-AG 復(fù)合納米顆粒的粒徑的影響Fig.2 The effect of the strring speed in the particle size of the zein-AG nanoparticles

2.3 pH 值對(duì)zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒粒徑、PDI、電位值的影響

通過圖3a 的粒徑圖可以看出，zein/AG-TOC復(fù)合納米顆粒在不同pH 值的影響下粒徑和PDI值無顯著變化，表明復(fù)合納米顆粒對(duì)pH 值在3～9的耐受性較好，原因推測(cè)為AG 復(fù)合了zein 納米顆粒，保護(hù)了單純的zein 納米顆粒不被過酸或過堿環(huán)境破壞，進(jìn)而影響納米顆粒體系的穩(wěn)定。從圖3b 的電位圖可得，zein-AG 復(fù)合納米顆粒在pH=3的條件下其電位較低，體系不穩(wěn)定，這可能是由于體系的pH 值接近AG 的pKa 值2.3，此時(shí)，AG 的帶電量較少，破壞體系穩(wěn)定性；而pH=4～9 的范圍內(nèi)復(fù)合納米顆粒的電位均較為穩(wěn)定。該試驗(yàn)結(jié)果說明，AG 與zein 的結(jié)合改善了zein 在等電點(diǎn)附近的聚集情況。劉貴金、牛付閣等[14-15]在研究zein基納米顆粒的制備時(shí)均有相同結(jié)論。

圖3 pH 值對(duì)zein/AG-TOC 納米顆粒粒徑、PDI、電位的影響Fig.3 The effects of pH in the particle size，PDI and zeta-potential of the zein/AG-TOC nanoparticles

2.4 不同鹽離子濃度對(duì)zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒粒徑、PDI、電位值的影響

鹽離子濃度對(duì)zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒的粒徑、PDI、電位的影響如表1所示，當(dāng)鹽離子濃度小于20 mmol/L 時(shí)，體系的粒徑為納米級(jí)，PDI 也較為穩(wěn)定，而當(dāng)鹽離子濃度提高至30～50 mmol/L時(shí)，納米顆粒的粒徑增大至微米級(jí)，體系出現(xiàn)明顯絮凝物，且PDI 為1；電位也接近于-5 mV；同時(shí)，納米顆粒的粒徑、PDI、電位也均隨著鹽離子濃度的增大而增大，即表明體系變得不穩(wěn)定。該結(jié)果表明，zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒能夠承受的鹽離子濃度為20 mmol/L，原因可能是由于AG 與zein之間以分子間相互作用力結(jié)合成穩(wěn)定的復(fù)合物[17]，而20 mmol/L 濃度的鹽離子不足以破壞zein與AG 之間的相互作用力，當(dāng)鹽離子濃度大于20 mmol/L 時(shí)，體系發(fā)生電荷屏蔽作用，顆粒發(fā)生絮凝而顯示為粒徑變大、電位變大。該試驗(yàn)結(jié)果與Dai 等[16]在研究鹽離子對(duì)納米顆粒的干擾作用時(shí)的結(jié)果相同。

表1 鹽離子濃度對(duì)納米顆粒粒徑、PDI、電位的影響Table 1 The effects of the concentrations of salt in the particlesize，PDI，zeta-potential of the zein/AG-TOC nanoparticles

2.5 zein/AG-TOC 納米顆粒的抗氧化性

如圖4所示，是zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒的抗氧化性，包括對(duì)于DPPH、ABTS、超氧陰離子的清除能力。圖中可以看出，zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒中的TOC 能夠被釋放游離出來，并對(duì)于這3 種物質(zhì)均呈現(xiàn)出一定的抗氧化性。黃旭琳等[17]在研究負(fù)載姜黃素的zein 基納米顆粒時(shí)也發(fā)現(xiàn)制備得到的復(fù)合納米顆粒具備一定對(duì)DPPH 的清除能力；同樣黎亢抗[18]在制備負(fù)載百里香酚的納米顆粒時(shí)，對(duì)大腸桿菌也具有一定的抑菌性能。該結(jié)論能夠證明，TOC 能夠較好地被負(fù)載在zein/AG 的復(fù)合納米顆粒中，并達(dá)到一定的抗氧化性能。

2.6 zein/AG-TOC 納米顆粒的模擬胃腸道消化情況

圖4 zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒的抗氧化性圖Fig.4 The antioxidant properties of zein/AG-TOC composite nanoparticles

圖5 zein/GA-TOC 納米顆粒中生育酚的模擬胃腸道釋放動(dòng)力學(xué)曲線圖Fig.5 Simulated gastrointestinal tract release kinetics of tocopherol in zein/GA-TOC nanoparticles

從圖5可以看出，zein/AG-TOC 納米顆粒在模擬胃腸道環(huán)境中的消化情況。其中，模擬胃部環(huán)境時(shí)，前30 min 內(nèi)TOC 的釋放率明顯較大即發(fā)生了突釋現(xiàn)象，表明此時(shí)納米顆粒運(yùn)載體系破裂，TOC 快速游離出來，增大了釋放率；而隨著時(shí)間的推移，在胃部消化的后90 min 內(nèi)，TOC 的釋放率顯著減小并趨于平緩，且當(dāng)胃部消化結(jié)束后，釋放率為46.8%。采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)胃部消化環(huán)境進(jìn)行模擬和線性擬合，試驗(yàn)結(jié)果顯示TOC 的釋放趨勢(shì)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)，且R2為0.915。此外，該結(jié)果還可以推測(cè)出AG 的結(jié)合能夠有效阻止zein被胃部環(huán)境的破壞，使得納米顆粒具備胃蛋白酶消化抗性，同時(shí)也說明復(fù)合納米顆粒的機(jī)械強(qiáng)度和致密度較高[19-20]。在模擬腸部消化環(huán)境中，隨著腸部消化時(shí)間的推移，TOC 從納米顆粒中的釋放速率逐漸增大，直到胃腸道消化達(dá)到240 min 時(shí)，TOC 的釋放率接近100%，該結(jié)果推測(cè)是因?yàn)槟c部模擬環(huán)境的pH 值為7，在該條件下復(fù)合納米顆粒易被胰蛋白酶消化而釋放出TOC，實(shí)現(xiàn)人體結(jié)腸部位的靶向釋放[11]。綜上所述，zein/AG-TOC 納米顆粒能夠較好地保護(hù)TOC，并在人體胃腸部實(shí)現(xiàn)緩釋。

3 結(jié)論

本文通過對(duì)zein 與AG 的比例、攪拌速度等zein-AG 納米顆粒制備過程的工藝條件進(jìn)行研究；同時(shí)，探討負(fù)載TOC 的復(fù)合納米顆粒在不同pH 值和鹽離子濃度下的穩(wěn)定性情況，表明zein/AG-TOC 復(fù)合納米顆粒具備一定的抗酸堿性和鹽離子耐受性，能夠較好地運(yùn)載TOC，且具有較高的抗氧化性；此外，胃腸道緩釋結(jié)果也表明AG 的結(jié)合能夠較好地保護(hù)zein 基納米顆粒達(dá)到胃腸道緩釋的作用，在提高了TOC 生物利用率的同時(shí)，拓展了zein 的應(yīng)用。因此，本試驗(yàn)可說明zein-AG 復(fù)合納米顆粒可作為運(yùn)載體系對(duì)TOC 進(jìn)行運(yùn)載，并可考慮作為更多疏水性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)載壁材，以拓寬zein 的生物利用范圍。