梁瑞紅，董浩瀾，王學(xué)棟，王日思，賀小紅，陳 軍*，劉成梅

（1 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047 2 江西旅游商貿(mào)職業(yè)學(xué)院經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院 南昌330100）

蛋白質(zhì)和多糖是食品中的重要組成成分，蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、起泡性等重要功能常因多糖的參與而得到改善[1]。蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物具有改善食品乳液穩(wěn)定性[2]和凝膠穩(wěn)定性[3]，包埋活性成分[4]，提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和改善混合體系的黏度[5]等作用。在食品體系中多糖與蛋白質(zhì)自發(fā)的相互作用是影響食品結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的主要因素，目前蛋白質(zhì)與多糖間的相互作用類型主要是靜電作用、疏水作用、氫鍵作用、空間位阻效應(yīng)等[6]。有文獻(xiàn)[7]報(bào)道，多糖分子特性（分子質(zhì)量、分子柔性、電荷密度）會(huì)影響蛋白質(zhì)與多糖的相互作用。

果膠是存在于植物細(xì)胞的初生壁和中間層由D-半乳糖醛酸殘基通過α-1，4 糖苷鍵連接而成的一種陰離子多糖[8]，常被用作增稠劑、穩(wěn)定劑、膠凝劑、乳化劑、藥物遞送載體[9-10]。果膠分子鏈上半乳糖醛酸C-6 位的羧基可被甲酯化，根據(jù)甲酯化的程度可分為高酯果膠和低酯果膠，而低酯果膠半乳糖醛酸C-6 位的羧基還可被乙?；?。果膠甲酯化度、酰胺化度和分子質(zhì)量等結(jié)構(gòu)特征的不同使其功能性質(zhì)如溶解性、凝膠性存在差異[11]。

目前，關(guān)于果膠與蛋白的研究主要為果膠的單一結(jié)構(gòu)特征（主要為酯化度）、果膠與蛋白比例、pH 值等因素對果膠與蛋白相互作用及其復(fù)合體系理化性質(zhì)的影響。Schmidt 等[12]制備了不同酯化度的果膠與乳清蛋白復(fù)合物，表明復(fù)合物的乳化能力提高，果膠的酯化度不影響復(fù)合物的性能，但使用低甲基化柑橘果膠比高酯果膠得到的復(fù)合物產(chǎn)量更高。Li 等[13]研究pH 值與蛋白多糖比例對牛血清蛋白與果膠復(fù)合物形成以及復(fù)合體系乳化能力與乳液穩(wěn)定性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH 值和蛋白多糖比例達(dá)到可形成可溶性復(fù)合物狀態(tài)時(shí)，體系的乳化能力與乳液穩(wěn)定性明顯提升。Sadahira等[14]用蛋清蛋白與果膠制備靜電復(fù)合物并研究其起泡性，結(jié)果表明在pH 3.0，蛋白與果膠質(zhì)量比為55∶1 時(shí)，蛋白-果膠復(fù)合物帶凈正電荷，制備的泡沫能有效抵抗析水。Perez 等[15]研究了pH 7.0 條件下乳清蛋白分別與高酯和低酯果膠在氣-水界面的吸附過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同酯化度的果膠與蛋白具有不同的吸附機(jī)制。果膠的不同結(jié)構(gòu)特征（分子質(zhì)量、酰胺化度、酯化度、半乳糖醛酸含量等）如何共同影響果膠與蛋白相互作用的研究鮮有報(bào)道，且果膠的哪個(gè)結(jié)構(gòu)特征起主要影響作用，目前尚不清楚。

本文選用β-酪蛋白（β-CN）為模型蛋白，它普遍存在于哺乳動(dòng)物（牛、山羊、馬、兔等）和人的乳汁中，是由乳腺腺泡上皮細(xì)胞合成的磷酸化蛋白質(zhì)[16]，具有降低過敏性，通過釋放生物活性肽達(dá)到抗高血壓的功能，促進(jìn)某些營養(yǎng)成分（如鈣、磷、必需氨基酸等）吸收等作用[17]。將6 種結(jié)構(gòu)特征（半乳糖醛酸含量、酯化度、酰胺化度、分子質(zhì)量）的果膠與β-酪蛋白復(fù)合，探討果膠-β-酪蛋白復(fù)合體系的理化性質(zhì)，并采用多元線性回歸分析果膠各個(gè)結(jié)構(gòu)特征性質(zhì)對復(fù)合體系性質(zhì)影響的貢獻(xiàn)程度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-酪蛋白 （分析純），Sigma-Aldrich 公司；柑橘果膠 （LM 104 AS，LM 102 AS，LM 101 AS，LM 13 CG，121 SHOW SET，YM 150H），CP kelco 公司；磷酸（分析純），西隴科學(xué)有限公司；氫氧化鈉（分析純），西隴科學(xué)有限公司；PBS 標(biāo)品0.01 mol/L pH 7.2～7.4，北京索萊寶有限公司；考馬斯亮藍(lán)法試劑盒，碧云天生物試劑公司；玉米油（一級），益海嘉里食品有限公司；十二烷基硫酸鈉（分析純），西隴科學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F-5000 熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi 公司；MOS-450 圓二色光譜儀，法國Bio-Logic SAS 公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省榮華有限公司；DELTA320 pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；QL-866 漩渦混合器，上海精密儀器儀表有限公司；Nano ZS 粒度電位儀，英國馬爾文儀器有限公司；電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RT-10 多聯(lián)磁力攪拌器，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；T18 數(shù)顯型分散機(jī)，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀，美國博騰有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系的制備 分別稱取6 種果膠與β-酪蛋白于100 mL PBS 緩沖液（pH=7.4，10 mmol/L）中，在磁力攪拌器上攪拌2 h至蛋白、果膠充分溶解，配置質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL 的果膠母液和β-酪蛋白母液，并在4 ℃下存放過夜使其充分水化。

將β-酪蛋白母液、果膠母液和按1∶1 質(zhì)量比例復(fù)合的β-酪蛋白-果膠混合溶液。用0.5 mol/L和0.1 mol/L 的磷酸酸化至pH=7.0，6.0，5.0，4.0，3.0 和2.0，并充分?jǐn)嚢杌靹騕18]。

1.3.2 果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系粒徑的測定取1.5 mL 樣品溶液于5 mL 比色皿中，采用Malvern Nano ZS 粒度電位儀測定上述溶液的粒徑，測定溫度25 ℃，溫度平衡時(shí)間120 s，每個(gè)樣品測量3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.3 果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系ζ 電位的測定取1 mL 樣品溶液于電位池中，采用Malvern Nano ZS 粒度電位儀測定上述溶液的ζ 電位，測定溫度25 ℃，溫度平衡時(shí)間120 s，每個(gè)樣品測量3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系熒光光譜的測定 取pH=7.0 的按1∶1 質(zhì)量比例復(fù)合的β-酪蛋白與6 種果膠混合溶液用于熒光光譜分析，每種樣品溶液取3 mL 于5 mL 比色皿中，熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長為290 nm，掃描發(fā)射光譜的范圍為300～450 nm；激發(fā)與發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm[16]，每個(gè)樣品測量3 次。

1.3.5 果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系圓二色譜的測定 取pH=7.0 的按1∶1 質(zhì)量比例復(fù)合的β-酪蛋白與6 種果膠混合溶液用于圓二色譜分析，取360 μL 樣品于比色皿中，使用MOS-450 圓二色光譜儀進(jìn)行遠(yuǎn)紫外圓二色譜分析。采用光路長為1 mm 的圓口石英比色皿，掃描范圍為190～250 nm，掃描步進(jìn)分辨率為1 nm；以100 nm/min 掃描速度，普帶寬度2.0 nm。每份樣品重復(fù)掃描3 次，采用DichroWeb 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測二級結(jié)構(gòu)含量[19]。

1.3.6 溶解性測定 根據(jù)Calligaris 等[16]測定蛋白質(zhì)溶解性的方法，分別取2 mL 樣品溶液，在15 000 r/min 下離心15 min，取上清液。用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測定上清液中β-酪蛋白含量，并以牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)蛋白，測定不同濃度蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸計(jì)算出上清液中蛋白的含量，同時(shí)測定不添加果膠的β-酪蛋白溶液的溶解性，每組樣品測3 次，結(jié)果取平均值，所有試驗(yàn)操作均在室溫下進(jìn)行。

1.3.7 乳化性測定 根據(jù)涂越等[20]測定乳化性的方法，分別取9 mL 樣品溶液，邊攪拌邊緩慢加入3 mL 一級玉米油，于10 000 r/min 高速均質(zhì)1 min制成乳狀液，從底部吸取乳狀液50 μL，立即與5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的十二烷基硫酸鈉混合，然后用分光光度計(jì)于500 nm 處測吸光度，試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值，乳化性用吸光度大小表示。

1.3.8 起泡性測定 根據(jù)劉成梅等[21]測定起泡性的方法，分別取10 mL 樣品溶液，在室溫下于分散機(jī)分散1 min，轉(zhuǎn)速為5 000 r/min，然后快速移至50 mL 的量筒內(nèi)，記錄泡沫的體積，試驗(yàn)重復(fù)3次。起泡性為：

1.3.9 多元線性回歸及數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，ANOVA 用于單因素方差分析，并比較不同組平均值的差異性（P≤0.05）；以果膠的半乳糖醛酸含量（GA）、酯化度（DM）、酰胺化度（DA）和分子質(zhì)量（Mw）作為自變量，果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系的粒徑電位、溶解性、乳化性和起泡性（在pH=7 時(shí)）作為因變量，代入SPSS 19.0，選擇相應(yīng)的回歸參數(shù)，建立它們之間的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系，評價(jià)各自變量對因變量的貢獻(xiàn)大?。徊捎肙rigin 2017 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠的結(jié)構(gòu)參數(shù)

根據(jù)本團(tuán)隊(duì)前期成果選用的6 種果膠[22]，其結(jié)構(gòu)參數(shù)如表1所示。L101、L102、L104 為低酯酰胺化果膠，L13 為低酯果膠，H121 和H150 為高酯果膠。分子質(zhì)量在527～1 273 ku 之間，具有較好的代表性。

表1 果膠的結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Structural parameters of pectin

2.2 不同結(jié)構(gòu)特征的果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系的粒徑

如表2所示，所有體系在酸化過程中粒徑均先減小后增大，并都在pH=5 時(shí)達(dá)到最小值。單一的β-酪蛋白溶液在pH=4.0，3.0，2.0 時(shí)出現(xiàn)少許沉淀，無法測量其粒徑，可能是因?yàn)殪o電排斥力不足以維持蛋白的穩(wěn)定，蛋白分子間的疏水作用也會(huì)引起聚集而沉淀。相比于β-酪蛋白，β-酪蛋白/果膠復(fù)合體系在pH 為3.0 和4.0 條件下更能呈現(xiàn)較均一的顆粒，這說明果膠的添加改善了β-酪蛋白在酸性體系下的穩(wěn)定性。在pH=2 時(shí)，只有添加H150 和H121 果膠的復(fù)合體系呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性，表明在強(qiáng)酸性條件下高酯果膠比低酯果膠對β-酪蛋白具有更強(qiáng)的穩(wěn)定作用。這與Lam 等[23]發(fā)現(xiàn)在pH 3.8 時(shí)高甲氧基果膠穩(wěn)定大豆分離蛋白優(yōu)于低甲氧基果膠的結(jié)果一致。這可能是因?yàn)轷セ仍降停z分子中的羧基含量越高，從而存在與β-酪蛋白更多的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致果膠與β-酪蛋白之間的結(jié)合過于緊密，反而破壞了維持體系穩(wěn)定的靜電相互作用，使體系的穩(wěn)定性降低[24]。

2.3 不同結(jié)構(gòu)特征的果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系的ζ 電位

如表3所示，隨著pH 值的降低，ζ 電位都呈升高的趨勢。pH≥4 時(shí)，β-酪蛋白和果膠都帶負(fù)電，兩者之間發(fā)生相互排斥作用，但由于兩者的濃度都很低，果膠和β-酪蛋白可以均勻混合成一相，形成共溶體系；pH≤4 時(shí)，β-酪蛋白帶正電，果膠帶負(fù)電，兩者可以發(fā)生靜電吸附，此時(shí)復(fù)合體系的電位值發(fā)生顯著變化，表明復(fù)合物的形成。當(dāng)pH 低于果膠的電離常數(shù)時(shí)，果膠的電離受到抑制，從而導(dǎo)致果膠近乎呈電中性，兩者之間已形成的復(fù)合物的結(jié)合程度會(huì)漸漸降低至完全解離，此時(shí)β-酪蛋白和果膠又恢復(fù)到共溶體系。Li 等[25]也發(fā)現(xiàn)pH 影響體系的狀態(tài)，形成靜電復(fù)合物體系、共溶體系和不溶體系。

表2 不同結(jié)構(gòu)特征的果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系隨pH 變化的粒徑大?。╪m）Table 2 Particle size of different structures of pectin and β-casein complexes as a function of pH （nm）

表3 不同結(jié)構(gòu)特征的果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系隨pH 變化的電位大?。╩V）Table 3 The potential of different structures of pectin and β-casein complexes as a function of pH （mV）

2.4 不同結(jié)構(gòu)特征的果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系光譜分析

2.4.1 熒光光譜 蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來源于色氨酸（Trp）殘基，β-酪蛋白因含有一個(gè)色氨酸殘基為內(nèi)源熒光蛋白質(zhì)，所以可通過熒光光譜法來研究不同結(jié)構(gòu)特征的果膠與β-酪蛋白之間的相互作用及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。如圖1所示，添加不同結(jié)構(gòu)特征的果膠使得β-酪蛋白均發(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象，熒光猝滅包括激發(fā)態(tài)反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)移、復(fù)合物形成和碰撞淬滅[26]。果膠與β-酪蛋白之間形成了靜電復(fù)合物，故可導(dǎo)致猝滅現(xiàn)象的發(fā)生。不同結(jié)構(gòu)特征的果膠對β-酪蛋白的猝滅程度不一樣，H150 果膠的猝滅作用最大，H121、L101、L102和L13 果膠的猝滅作用次之，L104 果膠的猝滅作用最小。

圖1 不同結(jié)構(gòu)特征的果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系熒光圖譜Fig.1 Fluorescence spectra of different structures of pectin and β-casein complexes

2.4.2 圓二色譜 表4為添加不同結(jié)構(gòu)特征果膠后β-酪蛋白二級結(jié)構(gòu)的含量，β-酪蛋白的二級結(jié)構(gòu)為：26.35% α-螺旋，15.2% β-折疊，28.6% β-轉(zhuǎn)角和29.85%無規(guī)卷曲。果膠的加入導(dǎo)致β-酪蛋白α-螺旋含量減少，β-折疊含量增加，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量沒有顯著變化，這說明果膠與β-酪蛋白發(fā)生相互作用后β-酪蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了展開，部分α-螺旋發(fā)生了解體，排列重組后形成了β-折疊。不同結(jié)構(gòu)特征的果膠和β-酪蛋白復(fù)合體系的二級結(jié)構(gòu)含量之間沒有很顯著的差異。

表4 不同結(jié)構(gòu)特征的果膠對β-酪蛋白二級結(jié)構(gòu)含量的影響（%）Table 4 The secondary structure content of different structures of pectin and β-casein complexes （%）

2.5 不同結(jié)構(gòu)特征的果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系的性質(zhì)

2.5.1 β-酪蛋白的溶解性 如圖2所示，相比單一的β-酪蛋白而言，添加H150、L104 和L13 果膠的復(fù)合體系中β-酪蛋白具有更低的溶解性，而添加L102、L101 和H121 果膠的復(fù)合體系中蛋白具有更高的溶解性。這可能是因?yàn)樘砑硬煌Y(jié)構(gòu)特征的果膠，引入了不同的基團(tuán)（羧基、酯基和酰胺基），有些基團(tuán)與β-酪蛋白分子發(fā)生作用，導(dǎo)致其分子柔性增加，表面疏水性降低，從而溶解性增大；而有些基團(tuán)使β-酪蛋白分子展開，暴露出內(nèi)部的疏水基團(tuán)，疏水相互作用增強(qiáng)，使β-酪蛋白趨于聚集或沉淀，從而溶解性降低[27]。

2.5.2 乳化性 如圖3所示，相比單一的β-酪蛋白而言，所有果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系具有更高的乳化能力，L102 和L104 果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系乳化能力最強(qiáng)，L13、L101 和H121 果膠蛋白復(fù)合體系次之，H150 果膠蛋白復(fù)合體系較弱，表明低酯果膠比高酯果膠具有更強(qiáng)改善β-酪蛋白乳化性的能力。在乳化的過程中，果膠可通過靜電作用與β-酪蛋白發(fā)生復(fù)合，從而改變β-酪蛋白在油-水界面的吸附行為和界面薄膜的流變特性，提高其乳化性[28]。低酯果膠比高酯果膠帶有更多的負(fù)電荷，可能更容易與β-酪蛋白發(fā)生靜電作用。

圖2 不同結(jié)構(gòu)特征的果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系的溶解性Fig.2 Solubility of different structures of pectin and β-casein complexes

2.5.3 起泡性 從圖4中可以看出，相比單一的β-酪蛋白而言，所有果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系具有更高的起泡能力，H150、L102 和L101 果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系的起泡能力較低，而添加L104、L13 和H121 果膠蛋白復(fù)合體系的起泡能力較強(qiáng)。關(guān)于蛋白質(zhì)與多糖復(fù)合體系的研究表明：蛋白質(zhì)的起泡能力會(huì)因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與多糖形成配位體而得到提高。形成配位體一般有2 種形式：①蛋白質(zhì)與多糖由于靜電相互作用形成配位體；②蛋白質(zhì)與多糖通過共價(jià)鍵形成牢固的復(fù)合物[29]。β-酪蛋白與果膠之間形成了靜電復(fù)合物，降低了β-酪蛋白的疏水相互作用，導(dǎo)致蛋白分子在空氣-水界面擴(kuò)散速率加快，從而包住氣泡，加快和加強(qiáng)氣泡的產(chǎn)生。不同結(jié)構(gòu)特征的果膠與β-酪蛋白發(fā)生靜電相互作用的程度不同，所以也導(dǎo)致最終起泡能力的不同。

2.6 多元線性回歸分析

多元線性回歸分析是研究一個(gè)因變量和多個(gè)自變量間的線性關(guān)系方法，可用于分析各個(gè)自變量和因變量的相關(guān)性，并評價(jià)各個(gè)自變量對因變量的貢獻(xiàn)程度，本文采用多元線性回歸分析各果膠結(jié)構(gòu)特征與果膠-β-酪蛋白復(fù)合體系性質(zhì)間的相關(guān)性，并探討各結(jié)構(gòu)特征的貢獻(xiàn)程度。如表5所示，除了溶解性回歸方程的擬合相關(guān)系數(shù)R2只有0.776 以外，其它性質(zhì)回歸方程都表現(xiàn)出較好的擬合度。

圖4 不同結(jié)構(gòu)特征的果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系的起泡性Fig.4 Foaming ability of different structures of pectin and β-casein complexes

表5 多元線性回歸方程系數(shù)與R2Table 5 Coefficient of multiple linear regression equation and R2

如表6所示，標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)表示果膠結(jié)構(gòu)特征和果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系性質(zhì)間的相關(guān)性。K 值的絕對值越大，表示該果膠結(jié)構(gòu)特征對果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系性質(zhì)的影響越大。果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系的粒徑與GA 和Mw 呈正相關(guān)，與DM 和DA 呈負(fù)相關(guān)，Mw 對粒徑的影響最大，而DA 對粒徑幾乎沒有影響；ζ 電位與GA、DM 和DA 呈正相關(guān)，與Mw 呈負(fù)相關(guān)，DM 對其影響最大，Mw 對其影響最小；溶解性和乳化性都與GA、DM 和DA 呈正相關(guān)，與Mw 呈負(fù)相關(guān)，DA 對兩者的影響最大，Mw 對兩者的影響最??；起泡性與GA 和DM 呈正相關(guān)，與DA 和Mw 呈負(fù)相關(guān)，DA 對其影響最大，Mw 對其影響最小。

表6 多元線性回歸方程標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)Table 6 Standard coefficient of multiple linear regression equation

3 結(jié)論

研究表明不同結(jié)構(gòu)特征的果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系有著不同的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)，并具有顯著性差異。在果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系中，兩者之間發(fā)生了靜電相互作用，高酯果膠比低酯果膠穩(wěn)定體系的能力更強(qiáng)；果膠的添加改變了β-酪蛋白的分子結(jié)構(gòu)。相比單一的β-酪蛋白而言，所有果膠與β-酪蛋白復(fù)合體系具有更高的乳化能力和起泡能力。溶解性和乳化性與GA、DM 和DA 呈正相關(guān)，與Mw 呈負(fù)相關(guān)，DA 對兩者的影響最大，Mw 對兩者的影響最小。起泡性與GA 和DM呈正相關(guān)，與DA 和Mw 呈負(fù)相關(guān)，DA 對其影響最大，Mw 對其影響最小。