趙亞男， 孟龍月，b， 金 彪，c

（延邊大學(xué)a.理學(xué)院化學(xué)系；b.地理與海洋科學(xué)院；c.分析測試中心，吉林延吉133002）

0 引 言

近年來，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）由于其軟電離、高通量、質(zhì)量檢測范圍寬、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、耐鹽度高、樣品需求量少、分析速度快等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽、多糖、寡核苷酸及氨基酸等生物分子檢測領(lǐng)域［1］。在MALDI-TOF-MS檢測過程中，基質(zhì)起著舉足輕重的作用，不僅可以提高待測分子的分散度，并且能吸收激光能量，轉(zhuǎn)化為待測分子的激發(fā)能，從而使待測分子在MALDI-TOF-MS中被電離及檢測。常見基質(zhì)主要分為有機基質(zhì)［2］與無機基質(zhì)，其中，金屬材料、沸石材料及半導(dǎo)體材料［3-4］等無機基質(zhì)由于離子化效率高、結(jié)晶均勻等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于生物分子物質(zhì)的檢測。然而，金屬材料價格昂貴，且制備過程復(fù)雜，半導(dǎo)體材料實用性差，沸石材料性能不穩(wěn)定等缺點使得MALDITOF-MS檢測生物分子存在一定的局限性。

近年來，碳材料因其優(yōu)良的電子轉(zhuǎn)移能力和較強的激光能量吸收能力，良好的化學(xué)穩(wěn)定性，不易與生物分子發(fā)生反應(yīng)等特性在MALDI-TOF-MS 檢測生物分子領(lǐng)域備受關(guān)注［5-7］。碳微球作為一種小尺寸碳材料，由于其低成本、良好的導(dǎo)電性及小尺寸效應(yīng)等優(yōu)點使得作為基質(zhì)在檢測生物分子領(lǐng)域得到進一步拓展［8］。然而，碳微球表面官能團類型雜亂，粒徑大小不均勻，致使其在溶劑中分散性較差、結(jié)晶困難［9］。為了提升碳微球性能，科研工作者們通常采用元素?fù)诫s、活化處理和等離子處理等方式對碳微球形貌、粒徑和表面官能團進行優(yōu)化［10］。其中，碳材料經(jīng)過等離子處理后，材料粒徑尺寸更加均勻，氧元素含量及表面粗糙度顯著增加，在催化、電容器、電池等領(lǐng)域具有顯著的影響［11-12］。本文通過對碳微球進行等離子改性，碳微球表面—COOH、—OH 及—C ＝O 等含氧官能團不僅增大碳微球在溶劑中的分散性，同時也增強碳微球與亮氨酸的結(jié)晶能力，可有效保護樣品分子不受損壞，從而提高作為MALDI-TOF-MS 基質(zhì)檢測生物分子的能力。本文將聚吡咯基碳微球（PPy-CMSs）與碳黑基碳微球（CB-CMSs）作為MALDI-TOF-MS 基質(zhì)對亮氨酸進行檢測，考察在不同等離子處理時間、溶劑及濃度下，碳微球作為基質(zhì)效果的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀（AXIMACFRTMplus 島津公司）；K1050X 等離子灰化儀（Emitech Ltd）；真空／氣氛管式電爐（天津市中環(huán)實驗電爐有限公司）；5700 型紅外光譜儀（美國尼高力）；掃描電子顯微鏡（SEM SU8000，日本日立高新技術(shù)公司）；乙腈（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；乙醇（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（分析純，北京化工廠）；去離子水（Millipore 純水系統(tǒng)）；亮氨酸（分析純，上?？颠_氨基酸廠）；六水三氯化鐵（分析純，天津市光夏科技發(fā)展有限公司）；吡咯，碳黑均購自Sigma。

1.2 碳微球的制備

配置0.5 mol／L六水三氯化鐵水溶液400 mL，將6.2 mL吡咯單體（Py）滴加進溶液，攪拌2 h使其完全反應(yīng)。經(jīng)過抽濾、去離子水洗滌至中性，烘干12 h 后研磨成粉末備用，命名為PPy-1，將PPy-1 采用真空／氣氛管式電爐中（程序升溫為5 ℃·min－1）碳化制備PPy-CMSs。

1.3 等離子處理碳微球

K1050X等離子灰化儀：腔室壓力0.1 kPa，真空度1 mPa，工作功率70 W，13.56 MHz，氮氣（N2）為保護氣，氬（Ar）氣流量為20 cm3／min 狀態(tài)下，分別將PPy-CMSs、CB-CMSs進行不同時間等離子處理（0，1，3，5，7，10 min），樣品分別編號為PPy-CMSs-0，PPy-CMSs-1，PPy-CMSs-3，PPy-CMSs-5，PPy-CMSs-7，PPy-CMSs-10；CB-CMSs-0，CB-CMSs-1，CB-CMSs-3，CBCMSs-5，CB-CMSs-7，CB-CMSs-10。

1.4 分析條件

MALDI-TOF-MS：采用AXIMA-CFRTMplus N2激光源，發(fā)射波長為337 nm。負(fù)離子反射模式，加速電壓20 kV，掃描范圍為m／z 100 ～2 000，每張質(zhì)譜圖由總激光發(fā)射脈沖次數(shù)為50 的質(zhì)譜圖平均累計產(chǎn)生。數(shù)據(jù)采集前，用馬心肌肌紅蛋白的胰蛋白酶酶解肽段作為標(biāo)準(zhǔn)物，校正儀器的絕對準(zhǔn)確度至0.1 Da。將碳微球溶液超聲20 min，亮基酸溶液與碳微球溶液按照體積比V亮氨酸∶V基質(zhì)＝1∶2，以基質(zhì)覆蓋待測物方式在靶板點樣，自然干燥，通過MALDI-TOF-MS 負(fù)離子模式進行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM分析

碳微球SEM分析見圖1。由圖可看出，碳微球未經(jīng)等離子處理前粒子形貌分布不規(guī)則，形狀無規(guī)律，且團聚程度高（圖1（a），（c））。碳微球經(jīng)過等離子改性后，顆粒外形呈規(guī)則球狀，分散性明顯增加（圖1（b），（d））。等離子處理后，兩種碳微球（0.1 mg／mL）均勻分散在溶劑中，呈墨汁狀，無分層現(xiàn)象，溶劑中分散性明顯提高，增大了基質(zhì)與檢測樣品的共結(jié)晶性能。

圖1 碳微球掃描電鏡圖

2.2 紅外光譜分析

碳微球紅外光譜分析見圖2，由圖可以看出，碳微球存在—OH彎曲伸縮振動峰（PPy-CMSs 與CB-CMSs紅外吸收峰分別為3 445、3 441 cm－1），—C ＝O 羰基伸縮振動峰（PPy-CMSs 與CB-CMSs 紅外吸收峰分別為1 645、1 639 cm－1），—C ＝O羧基伸縮振動峰（PPy-CMSs與CB-CMSs 紅外吸收峰分別為1 715、1 719 cm－1）。結(jié)果表明，碳微球表面含有羥基、羧基、羰基等含氧官能團，含氧官能團的存在可以顯著提高碳微球在溶劑中的分散性，增大了與氨基酸的共結(jié)晶能力。

圖2 PPy-CMSs-5和CB-CMSs-3紅外吸收光譜圖

2.3 碳微球作為MALDI-TOF-MS基質(zhì)條件

2.3.1 碳微球空白對照實驗

PPy-CMSs-5、CB-CMSs-3 基質(zhì)背景檢測結(jié)果見圖3 中a、k。由圖可以看出，在m／z 100 ～600 Da 區(qū)沒有出現(xiàn)大量基質(zhì)相關(guān)裂解峰和雜質(zhì)峰，大大減少了基質(zhì)對該區(qū)域分析物的干擾，符合小分子質(zhì)譜檢測要求。

圖3 在不同等離子處理時間和不同溶劑中，PPy-CMSs與CBCMSs基質(zhì)對亮氨酸的檢測

2.3.2 等離子處理時間對亮氨酸檢測的影響

基質(zhì)與亮氨酸濃度均為0.1 mg／mL，去離子水為溶劑，PPy-CMSs 經(jīng)過不同等離子時間改性作為MALDI-TOF-MS基質(zhì)對亮氨酸檢測，結(jié)果見圖3 中b～f。圖中離子信號離子峰顯示，當(dāng)?shù)入x子處理時間為1、3、5、7 和10 min時，［Leu-H］－特征峰強度隨著等離子處理時間變化呈正態(tài)分布，處理5 min 時，［Leu-H］－特征峰強度最大，且背景峰最少。CB-CMSs 經(jīng)過不同等離子時間改性作為MALDI-TOF-MS 基質(zhì)對亮氨酸檢測，結(jié)果見圖3 中l(wèi) ～p，當(dāng)CB-CMSs 經(jīng)等離子處理3 min 時，［Leu-H］－特征峰強度大，且背景峰最少。

綜上所述，等離子改性時間不同造成碳微球表面官能團含量差異，造成碳微球分散性及與亮氨酸結(jié)晶解吸效果改變，極大影響碳微球作為MALDI-TOF-MS基質(zhì)對亮氨酸檢測能力［13-14］。因此，本實驗最佳等離子改性時間為5 min（PPy-CMSs）和3 min（CB-CMSs）。

2.3.3 不同溶劑對亮氨酸檢測的影響

基質(zhì)與亮氨酸濃度均為0.1 mg／mL，當(dāng)PPy-CMSs等離子改性時間為5 min，PPy-CMSs在不同溶劑（水、乙醇、甲醇、乙腈）中對亮氨酸檢測結(jié)果見圖3 中g(shù) ～j。乙醇作為PPy-CMSs溶劑時，［Leu-H］－特征峰強度最大，明顯高于其他3 種溶劑時的特征峰強度。當(dāng)CB-CMSs等離子改性時間為3 min，CB-CMSs 在不同溶劑（水、乙醇、甲醇、乙腈）中對亮氨酸檢測結(jié)果見圖3 中q ～t。去離子水為CB-CMSs溶劑時，［Leu-H］－特征峰強度明顯高于乙醇、乙腈及甲醇作為溶劑時的特征峰，且背景干擾最小。

結(jié)果表明，碳微球由于表面—COOH、—OH 等官能團的影響，在不同極性溶劑中分散性不同，與氨基酸共結(jié)晶能力差異較大［15］。綜上所述，實驗確定最佳溶劑為乙醇（PPy-CMSs）和去離子水（CB-CMSs）。

2.3.4 不同基質(zhì)濃度及亮氨酸濃度對檢測的影響

去離子水為溶劑，亮氨酸濃度為0.1 mg／mL，等離子改性時間為5 min（PPy-CMSs）和3 min（CB-CMSs），不同碳微球濃度對亮氨酸檢測結(jié)果見圖4 中a ～i（PPy-CMSs）和m ～u（CB-CMSs）。當(dāng)碳微球濃度為0.02 ～0.10 mg／mL時，如圖4 中a ～e（PPy-CMSs）和m ～q（CB-CMSs）所示，［Leu-H］－特征峰強度隨碳微球濃度的增大而增大。當(dāng)碳微球濃度為0.20 ～0.50 mg／mL 時，如圖4 中f ～i（PPy-CMSs）和r ～u（CBCMSs）所示，基質(zhì)背景離子峰明顯增多，未知來源的碎片）峰以及基質(zhì)加合分子離子峰嚴(yán)重影響亮氨酸特征峰強度，無法對質(zhì)譜進行準(zhǔn)確解析。

圖4 PPy-CMSs與CB-CMSs對亮氨酸檢測

碳微球?qū)Σ煌瑵舛攘涟彼幔?0，0.1，0.01 mg／mL）檢測結(jié)果見圖4 中j ～l（PPy-CMSs）和v ～x（CBCMSs）。圖中離子信號離子峰顯示，兩種基質(zhì)均順利檢測出［Leu-H］－特征峰。初步確定了亮氨酸的檢測限度為0.76 nmol／mL。

結(jié)果表明，碳微球濃度過低導(dǎo)致檢測信號偏弱；濃度過大，溶劑分散性降低，發(fā)生團聚現(xiàn)象［16-17］。綜上所述，PPy-CMSs、CB-CMSs最佳濃度為0.1 mg／mL。

3 結(jié) 語

通過等離子表面處理法改變了PPy-CMSs 及CBCMSs的表面化學(xué)結(jié)構(gòu)，兩種碳微球作為飛行質(zhì)譜的新基質(zhì)成功對亮氨酸進行檢測與分析。該檢測方法簡便，材料廉價易得，實驗過程污染小，可控性及重現(xiàn)性良好。該研究拓寬了MALDI-TOF-MS 檢測中基質(zhì)種類范圍，有望推廣到其他生物小分子檢測之中。