丁香玉 王鵬偉 儲(chǔ)昭輝 趙翔宇 丁新華 李洋

摘要：羥基肉桂酰輔酶A：奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶Iydroxycinnamoyl-COA：quinate hydroxycinnamoyltransferase，HQn）是催化茄科植物咖啡?？崴嵘锖铣勺詈笠徊降年P(guān)鍵酶。為培育富含多酚物質(zhì)的煙草，提高煙草品質(zhì)，通過(guò)克隆番茄FQT基因，構(gòu)建P35：SHOT超量表達(dá)載體，在野生型三生煙草（SS）中異源表達(dá)，利用高效液相色譜技術(shù)（HPLC）及液質(zhì)聯(lián)用（ILC-MSMS）技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片中一咖啡酰奎尼酸及黃酮醇含量進(jìn)行檢測(cè)，探究SHQT基因?qū)θ鸁煵菀豢Х弱？崴峒包S酮醇物質(zhì)合成的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)SQT煙草葉片中一咖啡?？崴峥偤孔罡呖商岣?4.98倍，蘆丁和山奈酚蕓香糖苷含量最高可分別提高1.47和9.32倍，且生長(zhǎng)表型與野生型煙草沒(méi)有明顯差異;轉(zhuǎn)SIHOR基因煙草葉片中有4種（1-CQA，3-CQA，4-CQA，5-CQA）一咖啡?？崴?，野生型煙草葉片中只檢測(cè)到3種（3-CQA，4-CQA，5-CQA）SIHOT基因在煙草中的異源表達(dá)促進(jìn)了1-CQA的生物合成且提高了一咖啡?？崴峥偤?，同時(shí)增加了黃酮醇的生物合成。

關(guān)鍵詞：煙草;番茄OT基因;一咖啡?？崴?1-CQA;黃酮醇

酚類物質(zhì)是煙草次生代謝的主要產(chǎn)物，與煙草品質(zhì)緊密相關(guān)，對(duì)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性、色澤、香氣質(zhì)等方面有重要影響。其中，一咖啡酰奎尼酸和黃酮醇是煙草中重要的多酚物質(zhì)，二者含量可達(dá)總酚量的80%以上。

一咖啡?？崴崾菬煵荨⒎?、馬鈴薯、蘋果等植物中重要的苯丙酸，能夠幫助植物細(xì)胞抵御低溫、紫外線等各種非生物脅迫以及病原、害蟲侵害5。根據(jù)咖啡?；诳崴嵘系慕Y(jié)合位置不同可分為4種異構(gòu)體：1CQA、3-CQA、4-CQA和5-CQA（CGA，綠原酸）。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，CGA能夠通過(guò)增強(qiáng)植物清除活性氧的能力，幫助植物抵御逆境。黃酮醇作為植物重要的苯丙烷類物質(zhì)，廣泛存在于煙草、番茄、馬鈴薯等茄科作物中，黃酮醇類物質(zhì)參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多方面，如植物與微生物互作、紫外線防護(hù)、花粉生長(zhǎng)和抵御害蟲侵害等。

羥基肉桂酰輔酶A：奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶HQT，是多種作物咖啡?？崴岷铣傻淖詈笠徊疥P(guān)鍵酶，將咖啡酰輔酶A和奎寧酸催化形成綠原酸。在蒲公英中超量表達(dá)Tahor可使葉片CGA水平升高82.49%，而RNA干擾使葉片CGA水平降低51.48%;超量表達(dá)LMHOT使忍冬中CGA含量提高2-3倍川;RAJA在馬鈴薯中通過(guò)RNAi對(duì)HOT的抑制導(dǎo)致CGA下降909%以上;RICARDAL剛將HOT在番茄中超量表達(dá)使CGA含量提高10%，RNAi沉默HQT后番茄葉片中CGA含量降低98%;結(jié)果均表明HOT基因是CGA合成的關(guān)鍵基因且正向調(diào)控綠原酸的生物合成。SHOT基因在番茄中調(diào)控綠原酸的合成，但對(duì)蘆丁和山奈酚蕓香糖苷的合成調(diào)控功能尚不清晰。因此，本研究以番茄中CGA合成的關(guān)鍵酶SOT為對(duì)象，分析番茄SIHOT基因在煙草中異源表達(dá)對(duì)煙草咖啡?？崴岷忘S酮醇生物合成的影響，為增加煙草中次生代謝物質(zhì)含量，提高煙草品質(zhì)及抗逆能力提供參考。

1材料與方法

1.1材料

番茄植株于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室大棚種植（2019年5-8月），生長(zhǎng)條件為：白天25～28℃，夜晚15～18℃，土壤相對(duì)濕度為（7010）%。生長(zhǎng)至果實(shí)成熟期，摘取果實(shí)，取果皮液氮急速冷凍，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

三生煙草（SS）于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物培養(yǎng)室種植（T0代轉(zhuǎn)基因株系及野生型種植于2019年10-12月，T1代轉(zhuǎn)基因株系及野生型種植于2020年2-4月），生長(zhǎng)條件為：25℃，16h8h光暗周期，相對(duì)濕度為（70：10）%。番茄品種Micro om種子，三生煙草（SS）種子，大腸桿菌EscherichiacoliDH5a，農(nóng)桿菌LBA4404和真核表達(dá)載體PCXSN均由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2方法

1.2.1SOT基因克隆和表達(dá)載體構(gòu)建采用

Plant RNA Kit（OMEGA，美國(guó)）提取番茄果皮總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO，日本），以番茄果皮總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄獲得CDNA，置于20℃保存。

以上述反應(yīng)得到的cDNA為模板，根據(jù)番茄HOT基因序列（Genebank AJ582652），設(shè)計(jì)引物，序列為SOTF：5-ATGGGAAGTGAAAAAATGA-3，SIHOT-R：5-AATTTGTGTTGTACATTCTTGAT-3'。以cDNA為模板，利用高保真KOD酶（TOYOBO，日本）進(jìn)行片段擴(kuò)增，擴(kuò)增到目的條帶后切膠回收。回收純化后SHOT基因片段和實(shí)驗(yàn)室保存的表達(dá)載體PCXSN，用XcmI（NEB，美國(guó)）分別進(jìn)行酶切，純化后將載體和目的基因片段用T4DNA連接酶（ThermoFisherScientific，美國(guó)）進(jìn)行連接，構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化載體P35S：SHQ7。重組載體熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌DHSa，以35s啟動(dòng)子內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的引物35Ss-F：5-ACGCACAAICCCACTATCCTT-3'和基因內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的引物SIHOT-R5-AATGTGTGTACATCTGA-3，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，選擇陽(yáng)性克隆過(guò)夜擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒送至華大基因股份有限公司（深圳）測(cè)序。經(jīng)測(cè)序無(wú)誤后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。

1.2.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性檢測(cè)選取煙草葉片作為外植體，采用農(nóng)杄菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法叫，將重組載體P35S：ST轉(zhuǎn)化三生煙草受體材料。采用CTABI]法提取轉(zhuǎn)基因植株葉片基因組DNA，進(jìn)行PCR陽(yáng)性檢測(cè)。待生根培養(yǎng)基中煙草根系發(fā)育良好時(shí)，移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中于培養(yǎng)室生長(zhǎng)。在T0代陽(yáng)性植株中隨機(jī)選擇3個(gè)株系，編號(hào)為SOT-1，SHQT-2和SHOT-3，收取種子后進(jìn)行T1代種植。每個(gè)株系取3棵生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行半定量檢測(cè)，驗(yàn)證遺傳穩(wěn)定性。

1.2.3一咖啡?？崴岷忘S酮醇物質(zhì)提取和含量測(cè)定待煙草葉片生長(zhǎng)至8葉期，取中部3片真葉進(jìn)行檢測(cè)。參照文獻(xiàn)[1-18]，對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草葉片進(jìn)行含量檢測(cè)和質(zhì)譜分析，取10L過(guò)濾液用于HPLC檢測(cè)，5uL用于LC-MSMS分析標(biāo)準(zhǔn)品為蘆丁（Sigma），一咖啡酰奎尼酸（Sigma），山奈酚蕓香糖苷（Extrasynthese）。T0代煙草每株重復(fù)檢測(cè)3次;T1代煙草每個(gè)株系3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2結(jié)果

2.1ST基因克隆和基因表達(dá)載體構(gòu)建

按照番茄中SOT的已知序列設(shè)計(jì)引物，以番茄果皮cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1293bp的清晰目標(biāo)序列（圖1A）;構(gòu)建P35：SHOT，挑取單克隆利用35-F、SIHOT-R引物進(jìn)行PCR陽(yáng)性驗(yàn)證（圖1B），選取3個(gè)陽(yáng)性克隆過(guò)夜擴(kuò)繁后提質(zhì)粒測(cè)序。

將測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列Sihor（GenebankAJ582652）比對(duì)，二者序列比對(duì)一致，確認(rèn)成功克隆SHOT的完整基因序列，并成功構(gòu)建P3S：SHOT載體。

2.2SQT基因遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)（圖2），在獲得的9株轉(zhuǎn)基因材料中，有7株擴(kuò)增到了目標(biāo)基因序列，確認(rèn)為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為77.7%。

2.3煙草葉片一咖啡酰奎尼酸和黃酮醇物質(zhì)含量

HIPLC檢測(cè)結(jié)果顯示（表1、圖3），轉(zhuǎn)SIHT基因的煙草葉片中一咖啡?？崴帷⑻J丁、山奈酚蕓香糖苷的含量都有不同程度的提高。其中，一咖啡酰奎尼酸的含量提高了797～14.98倍，最高含量達(dá)4598.17ugg。蘆丁和山奈酚蕓香糖苷含量最高分別可達(dá)265.08和175ugg，分別是相同條件下野生型三生煙草（SS）葉片中含量的9.58倍和8.71倍。

對(duì)T1代植株進(jìn)行半定量檢測(cè)，結(jié)果表明（圖4）轉(zhuǎn)基因煙草中SFQT基因表達(dá)量較高，而野生型中沒(méi)有基因表達(dá)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的真實(shí)性和遺傳穩(wěn)定性。并且轉(zhuǎn)基因煙草T1代植株3種物質(zhì)含量都有不同程度的提高，說(shuō)明轉(zhuǎn)SHOT基因煙草富含一咖啡跣奎尼酸及黃酮醇的優(yōu)勢(shì)可以穩(wěn)定遺傳（圖5、表2）。

2.4煙草葉片中一咖啡?？崴豳|(zhì)譜分析

質(zhì)譜分析結(jié)果顯示（圖6，表3），在野生型煙草葉片中，檢測(cè)到3-CQA，4-CQA，5-CQA三種咖啡?？崴?，而在轉(zhuǎn)SIHOT基因煙草葉片中檢測(cè)到1-CQA，3-CQA，4CQA，5-CQA四種一咖啡?？崴幔▓D7，表4）。

3討論

本研究將番茄中的QT基因連接35s啟動(dòng)子構(gòu)建真核表達(dá)載體，在野生煙草中異源表達(dá)，煙草葉片中一咖啡?？崴岷棵黠@提高，說(shuō)明番茄中的HT基因能在煙草中正向調(diào)控一咖啡酰奎尼酸的生物合成，提高一咖啡?？崴岷?，這與RICARDA1、ANDREA等的研究結(jié)果基本一致。番茄SHQT與煙草MHT編碼的蛋白質(zhì)序列相似性分別高達(dá)91%，在植物體內(nèi)行使相同的功能，都是將咖啡酰輔嗨A和奎寧酸催化形成綠原酸，正向調(diào)控綠原酸的生物合成。

另外，轉(zhuǎn)SIOT基因煙草與野生型相比，多檢測(cè)到一種一咖啡?？崴幔?CQA），在番茄中存在4種一咖啡?？崴幔谝吧蜔煵葜袃H檢測(cè)到3種，可能與SHQT和MHOT編碼的蛋白序列差異有關(guān)，后者在225-229位置缺少蘇氨酸（T）、絲氨酸（S）、脯氨酸（P）、賴氨酸（K）、脯氨酸（P）5個(gè)氨基酸，導(dǎo)致咖啡酰基在奎尼酸的1號(hào)位不能結(jié)合，不能形成1-CQA;也可能是因?yàn)橐吧蜔煵萑~片中1-CQA含量極低，未達(dá)到檢測(cè)線，而轉(zhuǎn)基因煙草葉片中，SIHOT基因的異源表達(dá)促進(jìn)一咖啡?？崴岬拇罅亢铣?，1-CQA含量升高，達(dá)到檢測(cè)線。而本研究中高效液相色譜技術(shù)未分離出4種咖啡?？崴岬膯畏?，可能與流動(dòng)相配比和酸濃度有關(guān)。

SHHOT基因在番茄中調(diào)控綠原酸的合成，并且隨著果實(shí)成熟，表達(dá)量提高，但對(duì)蘆丁和山奈酚蕓香糖苷的合成調(diào)控功能還未有明確報(bào)道。此次試驗(yàn)將番茄中HOT基因在三生煙草上表達(dá)分析，對(duì)T0代和T1代轉(zhuǎn)基因煙草葉片進(jìn)行一咖啡?？崴岷忘S酮醇含量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草代謝物質(zhì)含量增多的表型能夠穩(wěn)定遺傳，但是含量差異較大，猜測(cè)煙草的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)次生代謝物質(zhì)積累具有較大影響。除一咖啡?？崴嵬猓瑹煵葜刑J丁和山奈酚蕓香糖苷含量也有明顯提高。這幾種多酚物質(zhì)合成路徑共享多種中間酶和前期次生代謝物，都是以苯丙氨酸為合成底物，經(jīng)過(guò)PAIL（L-苯丙氨酸解氨酶）C4H（肉桂酸羥化酶）、4CL（p-香豆酰CoA合成酶）催化合成p-香豆酸輔酶A。然后以p-香豆酰輔酶A為底物，通過(guò)多種酶分別催化合成一咖啡?？崴?，蘆丁和山奈酚蕓香糖苷等。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)HT基因的超量表達(dá)可能激活一咖啡?？崴岷铣陕窂街猩嫌蔚腜AL、C4H、4CL酶，增加前期代謝物質(zhì)萃丙氨酸和p-香豆酸輔酶A的積累，這些合成相關(guān)酶及代謝物質(zhì)的增多，同時(shí)促進(jìn)下游多種黃酮醇合成酶的反應(yīng)，從而更強(qiáng)地激活蘆丁和山奈酚蕓香糖苷合成路徑，而這些黃酮醇合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)變化情況有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

將SOT在煙草中異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)，HQT基因正向調(diào)控?zé)煵葜幸豢Х弱？崴岬暮铣?，也促進(jìn)煙草中蘆丁和山奈酚蕓香糖苷的積累。轉(zhuǎn)SHOT基因煙草葉片中一咖啡酰奎尼酸種類比野生型煙草葉片中多一種（1-CQA），且總含量最高可提高14.98倍，達(dá)4598.17ugg，蘆丁和山奈酚蕓香糖苷含量最高可分別提高11.47和9.32倍。轉(zhuǎn)SHQT基因沒(méi)有影響植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育。這幾種多酚物質(zhì)含量提高有助于提高煙草抵抗脅迫能力，增加香氣量，提高煙草品質(zhì)，為煙草品質(zhì)育種和多用途開(kāi)發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

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