岳 娟，王培嬌，韓彥卿，高俊明

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西太谷030801）

谷子（Setaria italica（L.）P. Beauv.）是 1 年生草本植物，廣泛種植于歐亞大陸的溫帶和熱帶。我國黃河中上游為谷子的主要栽培區(qū)，其他地區(qū)也有少量栽種，其是我國重要的糧食作物之一。然而，一直以來谷子各種植區(qū)內(nèi)谷子白發(fā)病多有發(fā)生，嚴(yán)重影響和危害著谷子的產(chǎn)量與品質(zhì)。谷子白發(fā)?。⊿clerospora graminicola（Sacc.）Schroet）病原是谷子白發(fā)病菌，其屬于卵菌門霜霉科指梗霉屬禾生指梗霉（Sclerospora graminicola）。在我國谷子種植區(qū)域，一般白發(fā)病發(fā)病率為5%～10%，個別地塊發(fā)病率可達(dá)50%[1]。韓飛等[2]研究發(fā)現(xiàn)，陜西省榆林市府谷縣谷子白發(fā)病平均發(fā)病率在20%～40%。程富英等[3]研究報(bào)道，谷子白發(fā)病已經(jīng)成為谷子病害中具有毀滅性的嚴(yán)重病害之一。關(guān)于谷子白發(fā)病的防治，傳統(tǒng)的藥劑防治方法雖然有見效快的優(yōu)點(diǎn)，但同時也存在污染環(huán)境、造成農(nóng)藥殘留等問題，嚴(yán)重危害人類的健康。故通過生物防治來防治植物病害的優(yōu)勢更為明顯。

ZHU 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，多孢木霉是可以用于雜草防除的生防治劑。賀超等[5]研究發(fā)現(xiàn)，綠色木霉具有抑制病原菌、促進(jìn)植物生長的功能，可用于植物病原菌的生物防治。利用重寄生真菌防治植物病害是一種利用有益微生物殺滅或壓低病原生物數(shù)量以控制植物病害發(fā)生、發(fā)展的一類措施。西歐國家在很久以前就開始利用重寄生菌來防治植物病害。WHIPPS[6]研究發(fā)現(xiàn)，鐮孢菌對指梗霉屬等真菌的卵孢子具有重寄生作用。MULLER 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，重寄生非致病鐮孢菌可以防治列當(dāng)（Orobanche coerulescens Steph）導(dǎo)致的植物病害。

在我國，江浙地區(qū)曾利用木霉制劑防治茉莉花白絹病[8]。潘瀟涵等[9]研究了哈茨木霉VT9-3r 和枯草芽孢桿菌VT4-1x 對3 株馬鈴薯致病菌的抑制作用效果，結(jié)果顯示，哈茨木霉主要通過重寄生、枯草芽孢桿菌主要通過拮抗機(jī)制抑制馬鈴薯致病菌，2 種不同抑菌機(jī)制的菌劑復(fù)配施用能更有效防治馬鈴薯黑痣病。閻玉婷等[10]研究發(fā)現(xiàn)，谷子白發(fā)病卵孢子可以被3 種鐮孢菌寄生。申紅妙等[11]研究了葡萄生單軸霉上的重寄生真菌層生鐮刀菌，并研究了其對葡萄生單軸霉菌的防治效果，結(jié)果表明，層生鐮刀菌對葡萄生單軸霉具有重寄生作用，且對葡萄霜霉病具有較強(qiáng)的預(yù)防控制作用。因此，篩選出更多能抑制谷子白發(fā)病卵孢子生長的具有生防潛力的重寄生菌株，并將其用于白發(fā)病的防治，將對于谷子白發(fā)病菌的生物防治具有非常重要的意義。

本研究利用誘捕法對谷子白發(fā)病卵孢子進(jìn)行埋置誘捕處理，以分離篩選出具有潛在生防效果的重寄生真菌，同時對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，旨在為利用生防菌來防治谷子白發(fā)病奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試卵孢子于2019 年從山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站谷子病田白發(fā)發(fā)絲上面直接收集。

供試病田土壤從山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站谷子病田中直接采集。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑有 25%乳酸、20 μg/mL 青霉素、40 μg/mL 鏈霉素、葡萄糖、瓊脂、蒸餾水；主要儀器有電子天平（CP512）、立式自動壓力蒸汽滅菌鍋（G154DWS）、熱空氣消毒箱（GR-240）、凈化工作臺（SW-CJ-2FD）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GSP-9270MBE）、高速臺式冷凍離心機(jī)（Sorvall ST 16R Centrifuge）

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 谷子白發(fā)病卵孢子的誘捕收集 將收集的卵孢子稱取21 份，每份質(zhì)量為1 g。在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站病田，選取40 m×20 m 的地塊，將其分為21 塊5 m×5 m 的小區(qū)，在每個小區(qū)里面用小鐵鍬挖出長、寬、高均為20 cm 的土坑，取出500 g 距離地面大概5 cm 深度的土壤，與1 g 卵孢子充分混勻，用雙層紗布包裹后埋至之前挖好的土坑內(nèi)，填平土坑，同時寫好標(biāo)簽，注明填埋時間以及土壤與卵孢子的比例；之后每隔30 d 隨機(jī)挖取3 個埋置點(diǎn)的土樣，采用鹽水懸浮過篩法回收與土樣混埋后的卵孢子。連續(xù)回收、分離4 次。

先將誘捕埋置點(diǎn)挖取回的3 份500 g 土樣分別放入10 kg 桶內(nèi)，加500 mL 飽和鹽水，用玻璃棒充分?jǐn)嚢枞芙?，并用孔?30 μm 篩網(wǎng)撈取底部沙粒和懸浮的植物殘?bào)w，然后停止攪拌；靜置3 min 后，將渾濁液依次倒入孔徑為 120、75、41、23 μm 的四型網(wǎng)篩過濾；過濾完后棄篩網(wǎng)攔截物，用無菌水從網(wǎng)篩背面沖洗回收攔截物，并收集洗液至500 mL燒杯中，即為試驗(yàn)所需的卵孢子回收液。

1.3.2 卵孢子重寄生真菌的分離 在無菌操作臺中，直接在體視顯微鏡下從卵孢子回收液中用移液槍挑取單個卵孢子，按照圖1 的排列方式將單個的卵孢子接種至加有 20 μg/mL 青霉素、40 μg/mL 鏈霉素和25%乳酸[12-14]的PDA 平板上有記號筆標(biāo)定的位置，每個平板接10 個卵孢子，每次接10 個平板，以未誘捕埋置的卵孢子作為對照，進(jìn)行分離；最后將處理組和對照組接好單個卵孢子的平板置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，每天定時觀察、拍照并記錄每個PDA 平板圓圈標(biāo)記處是否有菌落長出。

1.3.3 谷子白發(fā)病卵孢子重寄生真菌的純化 若PDA 平板被標(biāo)記處有菌落長出，立即用挑針挑取菌落邊緣不同區(qū)域的菌絲并移接到新的PDA 平板上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7 d，并且每天定時觀察記錄菌落的大小、形態(tài)和顏色的變化。每個菌株做3 個重復(fù)，并做好標(biāo)記。若其菌落生長速度及菌落形態(tài)和顏色變化一致，說明該重寄生真菌已被純化，否則需要采用尖端菌絲分離法進(jìn)一步純化。后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 谷子白發(fā)病卵孢子重寄生真菌形態(tài)學(xué)鑒定先將1.3.3 低溫保存的菌株活化，再分別用直徑5 mm 打孔器打取菌餅并接種于PDA 培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7～14 d，觀察并記錄菌落大小和顏色，挑取菌絲制作臨時玻片，在顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)，并拍照記錄；之后參照《真菌鑒定手冊》[15]對谷子白發(fā)病卵孢子重寄生真菌進(jìn)行初步鑒定，從而篩選出具有潛在生防潛力的木霉菌株。

1.3.5 重寄生木霉的分子生物學(xué)鑒定 參考Ezup柱式真菌基因組DNA 提取試劑盒的提取方法提取菌株的DNA；采用真菌16S rDNA ITS 的通用引物 ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對木霉真菌基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。其中，2 種引物均由上海生物工程有限公司合成；其擴(kuò)增體系為2×PCR Mix 10 μL，上下游引物各 2 μL，DNA模板 1～2 μL，最后用雙蒸水定容到50 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性 3～5 min；94 ℃變性 30 s，55～60 ℃退火 25～30 s，72 ℃延伸 30～50 s，共 35 個循環(huán)；最后 72 ℃修復(fù)延伸5～8 min。然后取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（條件為150 V、100 mA、20 min）；待電泳結(jié)束后取出凝膠，在成像系統(tǒng)Image Lab 中進(jìn)行拍照觀察，后將具有特異性條帶的產(chǎn)物送至上海生工科技有限公司進(jìn)行測序。最后將ITS 測序結(jié)果提交至NCBI 中GenBank 的Blast 程序，與相似度高的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析各分支序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵孢子被寄生現(xiàn)象顯微觀察結(jié)果

將谷子白發(fā)病卵孢子接種到PDA 培養(yǎng)基25 ℃進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，24 h 后在光學(xué)顯微鏡下連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組卵孢子無任何變化（圖2-A）；而處理組卵孢子周圍均有菌絲長出（圖2-B、C、D），說明處理組卵孢子均被寄生。

2.2 卵孢子重寄生真菌的分離結(jié)果

從圖3 可以看出，在PDA 平板上圓圈標(biāo)記處卵孢子表面長出了數(shù)量不等而且形態(tài)、顏色均不同的菌落，由于谷子白發(fā)病菌是專性寄生菌，因此，這些菌落即為卵孢子重寄生真菌。

2.3 卵孢子重寄生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

對分離得到的81 株重寄生真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，根據(jù)其顯微形態(tài)特征將菌株大致分為4 個屬，依次是木霉屬（Trichoderma）21 株、鏈格孢屬（Alternaria）7 株、青霉屬（Penicillium）10 株和鐮孢菌屬（Fusarium）43 株。

2.3.1 木霉屬（Trichoderma） 其形態(tài)學(xué)特征如圖4所示。

木霉屬菌株生長迅速，在PDA 上培養(yǎng)至第4 天時菌落長滿了整個培養(yǎng)皿，蛛絲狀菌落，初始顏色為純白色，有少量氣生菌絲，后在菌落正面產(chǎn)生暗綠色產(chǎn)孢體鋪滿整個白色菌落（圖4-A），菌落背面白色至淺黃綠色。在電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲透明，有分枝且為有隔菌絲（圖4-B）；分生孢子梗呈樹狀分枝，瓶狀小梗產(chǎn)孢，瓶?；可允湛s，中部略寬，向上漸變窄呈瓶狀（圖4-C）；分生孢子橢圓形或近圓形（圖 4-D），大小為（2.8～3.6）μm×（2.5～3.2）μm。據(jù)其形態(tài)特征初步鑒定為木霉屬。

2.3.2 鏈格孢屬（Alternaria） 該屬菌株生長速度中等，菌落絨狀或絮狀，菌落顏色初期暗白色，后期變?yōu)楹志G色，菌落背面顏色為褐色（圖5-A）；該屬菌株典型形態(tài)特征是分生孢子倒棒形，具橫隔和縱隔，橫隔較粗，如壁磚狀（圖5-B）；分生孢子梗及菌絲有橫隔（圖5-C）。據(jù)其形態(tài)特征初步鑒定為鏈格孢屬。

2.3.3 青霉屬（Penicillium） 該屬菌株生長迅速，菌落密氈狀，菌落顏色灰綠色或綠色至深綠色，上有粉狀物，邊緣整齊，背面顏色多為白色（圖6-A）；該屬菌株典型形態(tài)特征是其菌絲產(chǎn)生較長的分生孢子梗，分生孢子梗頂端有?；?，梗基多次分枝形成瓶狀小梗，小梗上生橢圓形或球形的分生孢子，由于分枝形狀形似掃帚，故常稱其為帚狀體（圖6-B）。據(jù)其形態(tài)特征初步鑒定為青霉屬。

2.3.4 鐮孢菌屬（Fusarium） 該屬菌株生長速度中等，菌落多為蛛網(wǎng)狀、羊絨狀或棉絮狀，菌落顏色大多呈白色（圖7-A）或淡粉色，背面顏色多為淡紫色；該屬菌株典型形態(tài)特征是其分生孢子有大型分生孢子和小型分生孢子2 種類型，其中，大型分生孢子鐮刀形，有較多隔（圖7-B），小型分生孢子多呈卵形或紡錘形，無隔，串生（圖7-C），有的在孢子鏈頂端形成假頭狀著生（圖7-D）。據(jù)其形態(tài)特征初步鑒定為鐮孢菌屬。

2.4 木霉屬（Trichoderma）的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

由形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果可知，得到的4 種屬中除木霉屬外，其他3 種屬的菌株均是植物的致病菌，不可用作生防菌株，因此，將木霉菌屬篩選為具有潛在生防效果的菌株，并對其進(jìn)行進(jìn)一步的分子生物學(xué)鑒定。

2.4.1 PCR 結(jié)果 由圖 8 可知，DNA 條帶亮度較高，無降解，說明提取的DNA 滿足PCR 擴(kuò)增要求；通過分光光度計(jì)檢測濃度和純度可知，OD260/280在1.7～2.0，說明DNA 質(zhì)量較好；電泳時使用的Marker為3 000 bp，該菌株的PCR 結(jié)果在500～600 bp。

2.4.2 分子鑒定結(jié)果 在GenBank 中，Blastn 比對的結(jié)果為供試菌株ITS 序列與Trichoderma harzianum的同源性最高，達(dá)到了100%；在GenBank 中搜索相似度高的序列，再選取Trichoderma viride 和Trichoderma longibrachiatum 作為外群，通過MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖9），可以看出，目的菌株TG502與哈茨木霉（Trichoderma harzianum）聚在同一個分支，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)，該菌株被鑒定為木霉屬（Trichoderma sp.）哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。

3 結(jié)論與討論

本研究利用誘捕法分離了谷子白發(fā)病卵孢子上面的重寄生真菌，并對分離到的81 株重寄生真菌進(jìn)行了初步的形態(tài)學(xué)鑒定，將得到的卵孢子重寄生真菌劃分為4 個屬，分別為鐮孢菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、木霉屬（Trichoderma）、鏈格孢屬（Alternaria），篩選出具有潛在生防潛力的重寄生木霉，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)將其鑒定為哈茨木霉。

馬平等[16]研究發(fā)現(xiàn)，非致病鐮孢菌可用于棉花黃萎病的防治。李舒展[17]研究發(fā)現(xiàn)，青霉菌可抑制黃瓜枯萎病菌生長，并可促進(jìn)黃瓜生長。叢韞喆等[18]研究發(fā)現(xiàn)，黑根霉和擬康氏木霉混合發(fā)酵液對蘋果鏈格孢菌具有顯著的抑制作用，可用于蘋果半點(diǎn)落葉病等的防治。陳勇等[19]研究發(fā)現(xiàn)，青霉菌滅活菌絲體可防治水稻病害，并可促進(jìn)其生長。此外，非致病的鏈格孢和腐霉菌同樣具有生防作用，如寡雄腐霉可抑制多種植物病原菌生長，并能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性[20]。

這些研究結(jié)果均表明，生防菌株在植物病害防治中具有顯著的成效，說明本研究通過篩選的生防菌株來防治植物病害是一種可行有效的植物病害防治手段。閻玉婷等[10]研究證明，對谷子白發(fā)病卵孢子的重寄生真菌具有重寄生作用的真菌有3 種鐮孢菌，這與本研究結(jié)果一致，但不同之處在于其篩選的鐮孢菌雖然能作為生防菌株抑制卵孢子的萌發(fā)，但對植物有害；而本研究中篩選出的哈茨木霉既可作為抑制卵孢子萌發(fā)的生防菌株，同時又對植物無害，符合生防菌株的篩選要求。在本試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，可以通過研究接種白發(fā)病卵孢子后的谷種萌發(fā)、植株生長情況來進(jìn)一步驗(yàn)證木霉菌株對卵孢子生長萌發(fā)的抑制作用，將為谷子白發(fā)病的生物防治提供一定的理論依據(jù)。