龐兵武

（鐵道警察學(xué)院，河南 鄭州 450003）

豬苓（Polyporus umbellatus） 又名豬茯苓、豬靈芝、野豬糞、朱苓等，是多孔菌科（Polyporaceae）多孔菌屬（Polyporus） 真菌[1]。豬苓多為野生，寄生在樺樹(shù)、楓樹(shù)和橡樹(shù)等樹(shù)木的根部，前期生長(zhǎng)于地下土壤中，豬苓菌核拱出地面生長(zhǎng)，可人工栽培[2]。若子實(shí)體幼嫩時(shí)可以作為食用菌食用，營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美。豬苓也是一味常見(jiàn)的中藥，自古就被記載有利尿治水腫之功效[3]。《神農(nóng)本草經(jīng)》列為中品、中醫(yī)認(rèn)為其“性甘平，入腎、膀胱經(jīng)”，主治腎炎，小便不利，水腫等疾病[4]?，F(xiàn)在豬苓已經(jīng)成為一種常用的藥用真菌，“五苓散”“豬苓湯”等中藥方中均大量使用。

已有人在豬苓中提取到無(wú)晶形多糖、麥角甾醇等多種活性物質(zhì)和微量元素[5]。陳曉梅等[6]從豬苓中分離得到豬苓多糖、28個(gè)甾體類(lèi)化合物、三萜類(lèi)、蒽醌類(lèi)和腺嘌呤核苷等12種其它化合物；曾星等[7]研究了豬苓多糖對(duì)膀胱癌的治療；戴如琴等[8]研究了豬苓菌絲體的抗腫瘤功效，這些研究都表明，豬苓子實(shí)體和菌絲中均含有抗癌、抗腫瘤成分。

現(xiàn)代人重視健身運(yùn)動(dòng)，一些人在做完運(yùn)動(dòng)之后時(shí)常會(huì)出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，而且多是下肢水腫，嚴(yán)重的軀體也會(huì)浮腫[9]。主要是運(yùn)動(dòng)負(fù)荷過(guò)大或發(fā)力不對(duì)，對(duì)下肢造成壓力過(guò)大，局部乳酸堆積或細(xì)胞壁破損造成運(yùn)動(dòng)型水腫[10]。在排除自身器官問(wèn)題后，可以采用冷敷、熱療的方法，同時(shí)，也需要通過(guò)藥物和飲食調(diào)節(jié)來(lái)加快水腫的消退。

1 材料和試驗(yàn)方法

1.1 材料

1.1.1 豬苓菌株

豬苓菌株購(gòu)自標(biāo)準(zhǔn)品信息網(wǎng)，菌絲白色，生長(zhǎng)緩慢，20 d菌絲生長(zhǎng)約1 cm。

1.1.2 培養(yǎng)基

綜合PDA瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液1.0 L，葡萄糖 20.0 g；磷酸二氫鉀 3.0 g、七水硫酸鎂 2.0 g、VB10.5 g；瓊脂 15.0 g。

1.1.3 藥品與試劑

95%乙醇，無(wú)水乙醇，正丁醇，三氯乙酸，鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純；戊巴比妥鈉，紅霉素軟膏均為醫(yī)用。

1.1.4 試驗(yàn)儀器

JZ-BS恒溫培養(yǎng)箱，北京九州晟欣科技有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，泰安市宇成礦用設(shè)備有限公司；WACS-1045型全自動(dòng)微電腦高壓滅菌鍋，成都浩宇馳儀器儀表有限公司；YP102N精密電子天平秤，北京佳航博創(chuàng)科技有限公司；VD-650桌上式垂直送風(fēng)凈化工作臺(tái)，上海坤誠(chéng)科學(xué)儀器有限公司；YG600型恒溫水浴振蕩器，南通三思機(jī)電科技有限公司；GT10-2高速臺(tái)式離心機(jī)，北京金洋萬(wàn)達(dá)科技有限公司；XPM-120*3實(shí)驗(yàn)室三頭研磨機(jī)，江西龍中機(jī)械設(shè)備有限公司；DZF-6090D真空干燥箱，常州金壇良友儀器有限公司，SY-1000E型恒溫聚能式超聲波提取機(jī)，上海仙象儀器儀表有限公司；TJSM－2000-Ⅱ型高頻電刀，天津市賽盟醫(yī)療科技有限公司；faith-4060型全自動(dòng)生化分析儀，南京勞拉電子有限公司。

1.1.5 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)采用雌雄各半的白兔，體重 （2.4±0.4） kg，購(gòu)自天津裕達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（津） 2016-0001。

1.2 豬苓菌絲體培養(yǎng)

1.2.1 PDA 培養(yǎng)基制備方法

馬鈴薯提取液制備：采用去皮馬鈴薯200 g，切成2 cm左右的小塊，加純凈水1.0 L煮30 min，期間不停攪拌防止糊底；煮成糊狀后自然冷卻至室溫，用3層紗布包裹，用力擠壓過(guò)濾；取濾液，加入葡萄糖、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、維生素和瓊脂，攪拌均勻并加水定容至1.0 L即可，pH自然。

1.2.2 豬苓菌絲活化培養(yǎng)方法

購(gòu)買(mǎi)的豬苓菌種在冰箱2℃～4℃冷藏24 h后取出，在固體斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行接種；接種后放入恒溫培養(yǎng)箱中27℃避光培養(yǎng)7 d，之后再進(jìn)行1次篩選，選出適合生長(zhǎng)的培養(yǎng)基再進(jìn)行1次轉(zhuǎn)接；繼續(xù)觀察，當(dāng)斜面上菌絲體覆蓋滿(mǎn)時(shí)即可。好的豬苓菌絲呈白色、生長(zhǎng)均勻稠密。

在500 mL三角瓶中裝入200 mL的PDA培養(yǎng)基，滅菌處理后接入斜面培養(yǎng)的豬苓菌絲塊3片～5片，每片菌絲塊約5 mm，分散放置，調(diào)節(jié)pH至5.0。然后將三角瓶放入 恒溫水浴振蕩器，27℃、140 r·min-1發(fā)酵 7 d。

1.3 豬苓菌絲體化學(xué)成分提取

采用“乙醇+超聲波”聯(lián)合提取法提取豬苓菌絲體化學(xué)成分。將活化培養(yǎng)好的豬苓菌絲裝入試管，加等量的PDA培養(yǎng)基，置于恒溫水浴振蕩器中，27℃、140 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 d。得到的發(fā)酵液在5 000 r·min-1離心15 min，取下部的菌絲體，用純凈水洗滌后，放入真空干燥箱，60℃下烘干至恒重，研磨機(jī)200 r·min-1研磨10 min得到豬苓菌絲體粉末。

將豬苓菌絲體干粉末中按1∶40的料液比加純凈水進(jìn)行超聲波提取，超聲功率為120 W、60℃提取15 min，連續(xù)提取2次，合并2次提取液，得到豬苓菌浸提液。

將正丁醇與三氯乙酸按5∶1的比例混合配制成混合液，并按1∶1的比例加入豬苓浸提液混勻。置于恒溫水浴振蕩器中140 r·min-1、27℃振蕩20 min，取出后靜置30 min。再加入2倍體積的95%乙醇溶液洗滌后，放入4℃冰箱靜置48 h；取出后將下層沉淀物上離心機(jī)，5 000 r·min-1離心15 min，再將離心后的沉淀物用無(wú)水乙醇洗滌3次；最后放入真空干燥箱，60℃真空干燥至恒重即得豬苓菌絲體提取物。該提取物中含有多糖、蛋白質(zhì)、甾體類(lèi)和酮類(lèi)等多種化學(xué)成分，是豬苓藥效的主要來(lái)源。用該提取物按1∶1制備成豬苓菌絲體提取液供動(dòng)物試驗(yàn)使用。

1.4 運(yùn)動(dòng)水腫試驗(yàn)方法

將20只兔子單籠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分成高劑量組、中劑量組、低劑量組，1個(gè)對(duì)照組，每組5只，繼續(xù)單籠飼養(yǎng)。

用1.5%的戊巴比妥鈉，按3 mL·kg-1劑量在兔耳邊緣靜脈注射麻醉兔子，約5 min～10 min兔子安靜后固定在超凈工作臺(tái)上；從一側(cè)后肢小腿關(guān)節(jié)上3 cm位置，剔除上下3 cm的毛發(fā)后進(jìn)行皮下環(huán)切；切除約3 cm寬的皮膚、注意不要傷及肌肉和肌腱、神經(jīng)組織。用電刀灼燒裸露皮膚，再用紅霉素軟膏涂抹1層灼燒后的皮膚，防止感染。將切除皮膚的后肢環(huán)切區(qū)用銫137輻射，采用一次性輻射10 GY劑量的照射。1 d～3 d后觀察兔子環(huán)切處出現(xiàn)水腫并不斷增大，3 d左右水腫體積基本穩(wěn)定時(shí)即表明水腫模型建立成功。

兔子水腫模型建立后，每天固定給高劑量組、中劑量組、低劑量組兔子分別灌胃90 mL、60 mL和30 mL配制好的豬苓菌絲體提取液，對(duì)照組灌胃同等劑量的生理鹽水，連續(xù)30 d。

采用排水法測(cè)量水腫情況，將兔子水腫的后肢浸入裝滿(mǎn)生理鹽水量杯中，浸水深度與大腿關(guān)節(jié)齊平。拿出后計(jì)算排出的生理鹽水的排出量即為水腫腿體積；同樣測(cè)量出另外一側(cè)未環(huán)切后肢的體積，每3天測(cè)量1次，每次3個(gè)重復(fù)，連續(xù)30 d。

收集灌胃后2 h內(nèi)的兔子尿液，用量筒測(cè)量比較各組的總尿量。并采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組混合尿液中的銨根陽(yáng)離子和鈉離子含量。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 水腫體積變化

由于受到了輻射，在術(shù)后兔子均很快產(chǎn)生了水腫，3 d左右基本穩(wěn)定。各組兔子水腫包直徑的變化情況如圖1所示。

由圖1可知，術(shù)后1周內(nèi)各試驗(yàn)組和對(duì)照組的水腫程度基本相同，從第5天起出現(xiàn)變化，與對(duì)照組相比，中劑量組、高劑量組水腫體積顯著減?。≒<0.05）；后續(xù)2周內(nèi)，低劑量組的水腫體積無(wú)明顯變化，中劑量組、高劑量組顯著減?。≒<0.05）；最后1周，低劑量組的水腫程度下降較大，但差異不明顯，中劑量組、高劑量組水腫體積持續(xù)減少，具有顯著差異（P<0.05）。

2.2 尿量和尿液中電解質(zhì)水平

尿量和尿液中電解質(zhì)水平檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 兔子尿量和尿液中電解質(zhì)水平Tab.1 Comparison of urine volume and electrolyte levels in rabbit urine

由表1可知，與對(duì)照組相比，高劑量組的4 h尿量顯著增加（P<0.05）；高劑量組、中劑量組的鈉離子排出量顯著增加（P<0.05）；3個(gè)試驗(yàn)組的銨根陽(yáng)離子的排出量均顯著增加（P<0.05）。

3 討論

用電刀灼燒會(huì)造成兔子皮膚細(xì)胞嚴(yán)重受損，產(chǎn)生水腫，這與運(yùn)動(dòng)受傷產(chǎn)生水腫的機(jī)理一致[11]。用排水法測(cè)量對(duì)比水腫的體積試驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃高、中劑量豬苓菌絲體提取液的兔子，其水腫體積在術(shù)后1周即出現(xiàn)明顯縮小，后續(xù)試驗(yàn)中也持續(xù)變小，說(shuō)明豬苓菌絲體中的有效化學(xué)成分起到了很好的作用。機(jī)理可能是豬苓中的多糖、麥角甾醇、甘露聚糖等均具有較強(qiáng)抗菌性和抗氧化性，能夠抑制水腫液中的細(xì)菌滋生，修復(fù)機(jī)體受損細(xì)胞，從而減輕水腫癥狀。

對(duì)參與運(yùn)動(dòng)的機(jī)體來(lái)說(shuō)，尿液是排出毒素和身體廢棄物的重要途徑，通過(guò)尿液來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的酸堿平衡和組織內(nèi)外壓，是減輕水腫癥狀的重要方式[12]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，灌胃了中劑量、高劑量的豬苓菌絲體提取液，可以提高尿液中鈉離子和銨離子的含量。表明豬苓具有加速體內(nèi)鈉離子和銨離子排出的功效，間接降低了血壓，調(diào)節(jié)了組織液的電解質(zhì)平衡，改善了因組織液壓力差而產(chǎn)生的水腫現(xiàn)象。但這種利尿的功效需要灌胃高劑量的豬苓菌絲體提取液。

4 總結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量的豬苓菌絲體提取液消腫、利尿的效果更好。豬苓菌絲體中的化學(xué)成分，對(duì)運(yùn)動(dòng)水腫有較好的治療作用，能夠緩解運(yùn)動(dòng)造成的水腫，減少運(yùn)動(dòng)乳酸及代謝廢物的產(chǎn)生，緩解水腫癥狀。