李 紅，王 萍，黃晨曦，劉 靈，李根霞

子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠20周后出現(xiàn)的特發(fā)性高血壓綜合征[1]。PE的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究[2]發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過(guò)多可引起胎盤(pán)淺著床，螺旋動(dòng)脈重鑄失敗，進(jìn)而導(dǎo)致PE等妊娠疾病的發(fā)生。微小RNAs(miRNAs)是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，可通過(guò)對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)功能[3-4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是III類(lèi)組蛋白去乙?；?，具有抗氧化應(yīng)激、抗凋亡和延長(zhǎng)壽命等作用[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)SIRT1與滋養(yǎng)細(xì)胞分化以及胎盤(pán)形成相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中miR-34a可靶向調(diào)控SIRT1影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡[7]。然而miR-34a通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1影響滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和凋亡尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究旨在通過(guò)探討miR-34a對(duì)SIRT1表達(dá)的調(diào)控作用及對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖和凋亡的影響, 為PE發(fā)病機(jī)制的研究和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1組織收集 收集2018年5月—2019年 6 月于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院行剖宮產(chǎn)手術(shù)的30例PE患者，和同期在我院行剖宮產(chǎn)的30例正常足月孕婦的胎盤(pán)組織。PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》。排除標(biāo)準(zhǔn)為孕婦患有慢性高血壓、妊娠糖尿病、心血管疾病、肝炎、胎兒染色體異?；蚱渌焉锊l(fā)癥。2組孕婦孕周、收縮壓、舒張壓、蛋白尿、胎兒出生體質(zhì)量比較, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組孕婦年齡、體質(zhì)量指數(shù), 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.1.2細(xì)胞株 人孕早期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVeno購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.3主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本東洋紡公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；兔抗人SIRT1單克隆抗體和兔抗人GAPDH單克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam生物技術(shù)有限公司；miR-34a模擬物、miR-34a抑制物及模擬物陰性對(duì)照、抑制物陰性對(duì)照均由中國(guó)上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成；SIRT1 siRNA和NC siRNA由廣州銳博生物公司設(shè)計(jì)并合成。miR-34a模擬物: sense：5′-UGGC AGUGUCUUAGCUGGUUGU-3′；antisense: 5′-AACC AGCUAAGACACUGCCAUU-3′; 模擬物陰性對(duì)照：sense: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；antisense：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；miR-34a抑制物：5′-ACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3′；抑制物陰性對(duì)照：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACA-3′；SIRT1 siRNA作用于SIRT1 mRNA 的靶序列為CCTTAAAACTAGAGATCAA。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)本采集及處理 胎盤(pán)分娩后30 min內(nèi)，于胎盤(pán)母體面剪取1 cm×1 cm×1 cm的組織塊若干，用生理鹽水沖洗后將其分為2份，一份放入含RNA儲(chǔ)存液的凍存管中，一份直接放入凍存管，并立即放入液氮冷凍10 min，隨后置于-80 ℃保存，以供qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) HTR-8/SVneo細(xì)胞置于含10%胎牛血清不含雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時(shí), 進(jìn)行消化傳代。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 ① 觀察miR-34a對(duì)SIRT1表達(dá)及細(xì)胞增殖和凋亡的影響時(shí)，HTR-8/SVneo細(xì)胞共分為4組：模擬物組、模擬物對(duì)照組、抑制物組、抑制物對(duì)照組；② 觀察SIRT1對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖和凋亡的影響時(shí)，細(xì)胞共分為2組： si-SIRT1組和si-NC組。

1.2.4qRT-PCR TRIzol法提取胎盤(pán)組織和轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞的總RNA。利用紫外分光光度計(jì)的方法測(cè)定其濃度和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作流程進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。qPCR Mix 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min; 95 ℃，15 s;60 ℃，60 s，40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。miR-34a和SIRT1分別采用U6和GAPDH作為內(nèi)參，采用 2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5Western blot 用預(yù)冷PBS將轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞洗滌3次，使用RIPA裂解液冰上裂解30 min，提取總蛋白，BCA定量法測(cè)定蛋白濃度。5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)300 mA 1 h進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，SIRT1一抗(1 ∶2 500)和GAPDH一抗(1 ∶5 000)4 ℃孵育過(guò)夜; 二抗室溫孵1 h。ECL發(fā)光法和AI600 images成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行掃描，采用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.6MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HTR-8/SVneo細(xì)胞按照8×103細(xì)胞/孔，接種于96孔板, 每組6個(gè)復(fù)孔，每孔含100 μl完全培養(yǎng)基, 細(xì)胞密度達(dá)到40%～50%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后更換含有0.5 mg/ml MTS的無(wú)血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育1 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平 收集6孔板中轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞, 預(yù)冷1×Binding Buffer洗滌細(xì)胞3次，用100 μl 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染色，室溫避光孵育15 min，上機(jī)前加入400 μl 1×Binding Buffer, 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 胎盤(pán)組織中miR-34a和SIRT1 mRNA的表達(dá)及相關(guān)性PE組胎盤(pán)組織miR-34a表達(dá)水平高于對(duì)照組，SIRT1 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.787、-8.731，P<0.001)，見(jiàn)圖1A。Pearson相關(guān)性分析顯示miR-34a和SIRT1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.707 4,P<0.05)，見(jiàn)圖1B。

2.2 轉(zhuǎn)染 miR-34a模擬物和抑制物后，HTR-8/SVeno細(xì)胞中miR-34a和SIRT1的表達(dá)水平① qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示miR-34a在miR-34a模擬物組細(xì)胞中表達(dá)水平高于模擬物對(duì)照組, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(t=14.947，P<0.001)，在 miR-34a抑制物組中表達(dá)水平低于抑制物對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.662，P<0.01)，見(jiàn)圖2A。SIRT1 mRNA 在 miR-34a 模擬物組細(xì)胞中的表達(dá)水平低于模擬物對(duì)照組，在miR-34a 抑制物組中的表達(dá)水平高于抑制物對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.942、4.214，P<0.05)，見(jiàn)圖2B。② Western blot印跡法結(jié)果顯示, 與模擬物對(duì)照組相比，miR-34a模擬物組SIRT1蛋白表達(dá)水平降低，與抑制物對(duì)照組相比，miR-34a抑制物組中SIRT1蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.126、6.571，P<0.01)，見(jiàn)圖2C。

2.3 miR-34a對(duì)HTR-8/Sveno細(xì)胞增殖和凋亡的影響MTS結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，miR-34a模擬物組細(xì)胞的增殖受到抑制。miR-34a抑制物組細(xì)胞的增殖水平增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-10.964、15.670，P<0.001)，見(jiàn)圖3A。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，miR-34a模擬物組細(xì)胞凋亡增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.868，P<0.01)。miR-34a抑制物組細(xì)胞凋亡減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-16.711，P<0.001)見(jiàn)圖3B、C。

2.4 沉默SIRT1對(duì)HTR-8/SVeno細(xì)胞SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響與si-NC組相比，si-SIRT1組中SIRT1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-7.077、-12.111，P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.5 沉默SIRT1對(duì)HTR-8/SVeno細(xì)胞增殖和凋亡的影響MTS結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，SIRT1 siRNA組HTR-8/SVeno細(xì)胞的增殖受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-19.709，P<0.05)，見(jiàn)圖5A。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，SIRT1 siRNA組HTR-8/SVeno細(xì)胞的凋亡水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.951，P<0.05)，見(jiàn)圖5B、C。

2.6 miR-34a結(jié)合SIRT1 mRNA靶點(diǎn)位置預(yù)測(cè)通過(guò)在線靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站mircroRNA(http://www.mircrorna.org/)預(yù)測(cè)到miR-34a與SIRT1 mRNA具有靶向結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖6。

圖1 胎盤(pán)組織中miR-34a和SIRT1 mRNA的表達(dá)及相關(guān)性

圖2 miR-34a對(duì)HTR-8/SVeno細(xì)胞中SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

圖3 miR-34a對(duì)HTR-8/SVeno細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討論

miR-34a是一種腫瘤抑制基因，位于染色體1p36，與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等多種生物學(xué)功能有關(guān)。研究[8-10]發(fā)現(xiàn)miR-34a可通過(guò)調(diào)控Notch信號(hào)通路和靶向作用MYC、Smad4等下游基因抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲，也可通過(guò)靶向Bcl-2促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而參與PE的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示，與健康孕婦胎盤(pán)組織相比，miR-34a 在 PE 胎盤(pán)組織中升高，這與既往報(bào)道相一致。胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖能力降低，凋亡增加可引起胎盤(pán)淺著床，螺旋動(dòng)脈重鑄不足，導(dǎo)致胎盤(pán)形成不良，是PE發(fā)生的一個(gè)重要因素。HTR-8/SVeno細(xì)胞中過(guò)表達(dá) miR-34a可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。相反，抑制miR-34a的表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，并抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了miR-34a在PE的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。

圖4 沉默SIRT1對(duì)HTR-8/SVeno細(xì)胞SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

圖5 沉默SIRT1對(duì)HTR-8/SVeno細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖6 miR-34a結(jié)合SIRT1 mRNA的靶向位點(diǎn)預(yù)測(cè)

SIRT1可去乙?；湎掠位騪53，調(diào)控p53依賴(lài)的細(xì)胞凋亡途徑，也可通過(guò)去乙酰化Nrf2、PCG-1α等抗氧化基因緩解氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡，還可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬相關(guān)基因來(lái)抑制細(xì)胞凋亡[11-12]。SIRT1主要位于人類(lèi)胎盤(pán)合體滋養(yǎng)細(xì)胞層和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、羊膜上皮、絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞層和蛻膜細(xì)胞，對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的分化和胎盤(pán)形成具有重要的調(diào)控作用。NDRG1與SIRT1/p53信號(hào)相互作用可減輕人滋養(yǎng)細(xì)胞缺氧損傷[13]。本研究顯示，PE組胎盤(pán)組織中SIRT1 mRNA表達(dá)降低。體外實(shí)驗(yàn)表明抑制SIRT1表達(dá)后，HTR-8/SVeno細(xì)胞的增殖能力下將，凋亡水平增加。提示SIRT1可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡水平參與PE的發(fā)病機(jī)制。

有研究[7]表明SIRT1是miR-34a的一個(gè)靶標(biāo), 生物信息學(xué)網(wǎng)站也表明二者存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，理想的mirSVR score應(yīng)該小于等于-0.1，圖6結(jié)果顯示二者結(jié)合不夠穩(wěn)固(mirSVR score為-0.274 7)。但是使用miR-34a模擬物，可抑制SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)；使用miR-34a抑制物，SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)；組織實(shí)驗(yàn)也顯示SIRT1與miR-34a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明miR-34a可能通過(guò)調(diào)控SIRT1的表達(dá)參與PE的發(fā)生發(fā)展。但miR-34a是否能夠直接靶向作用于SIRT1進(jìn)而影響HTR-8/SVeno細(xì)胞的增殖和凋亡能力，參與PE的發(fā)生發(fā)展，還需深入研究。

miR-34a和SIRT1 可能參與了PE的發(fā)病過(guò)程，其分子機(jī)制可能是miR-34a 通過(guò)抑制SIRT1 mRNA 和蛋白表達(dá)，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)PE的發(fā)生發(fā)展，這為PE的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路和方法，為PE的預(yù)防和治療提供了新的視角。