于潔，徐勤茜，李子院，劉紅艷，郝再彬，李海云

(桂林理工大學 化學與生物工程學院，廣西高校食品安全與檢測重點實驗室，廣西 桂林，541004)

虎杖為多年生草本植物，是一種常用的中藥，主要活性成分是虎杖苷、白藜蘆醇和蒽醌類化合物[1]。白藜蘆醇是虎杖的次生代謝產(chǎn)物，具有抑制腫瘤、抗癌、保護心血管、抗氧化、抗炎癥、調節(jié)自身免疫力、保護肝臟等作用[2-6]。目前白藜蘆醇的制備方法主要有溶劑提取法、化學合成、生物合成以及微生物轉化法[7-9]。從植物中采用溶劑法直接提取分離白藜蘆醇，是目前天然白藜蘆醇最主要的生產(chǎn)方法，但植物中的白藜蘆醇含量低，限制了應用；化學合成方法步驟復雜、經(jīng)濟損耗高且存在污染等問題[10-11]；生物合成法環(huán)境污染小，資源破壞少，具有較大的應用價值，但是如何實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還是一個急需解決的問題[12]。相對而言，微生物轉化法具有操作簡單、反應條件溫和、成本低廉等優(yōu)點，可以克服其他方法的弊端?；⒄戎邪邹继J醇含量較低，但虎杖苷含量較高，質量分數(shù)可達2.55%。因而利用微生物轉化虎杖苷是制備白藜蘆醇的可行途徑之一。目前關于微生物轉化虎杖苷合成白藜蘆醇的研究報道已有不少[13-20]，但總體而言，高活性的菌株數(shù)量不夠多，尋找新的高效轉化微生物菌源仍是重點研究方向。植物內(nèi)生菌是一類生活在健康植物組織內(nèi)部的，不引起宿主植物出現(xiàn)明顯病害癥狀的一類微生物，近年來在生物轉化領域的應用受到重視[21-22]。例如，劉華金等[23]從虎杖根、莖中分離出6株內(nèi)生真菌，其中的草酸青霉具有轉化虎杖苷為白藜蘆醇的能力，最高轉化率為25.6%。本文擬從廣西產(chǎn)的新鮮虎杖中分離篩選高效轉化虎杖苷生成白藜蘆醇的內(nèi)生真菌，為微生物轉化制備白藜蘆醇的產(chǎn)業(yè)化提供潛在的微生物資源及技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物材料：2年生新鮮虎杖，2018年10月采摘于南寧藥用植物園。

初篩培養(yǎng)基(g/L)：NaNO32，K2HPO41，KCl 0.5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.01，虎杖苷10，瓊脂20，pH自然。

復篩培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth,PDB)。

虎杖苷，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；白藜蘆醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)，引物ITS2(TCCTCCGCTTATTGATATGC)，真菌DNA提取試劑盒，上海生工生物工程有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑，所用水均為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

振蕩培養(yǎng)箱(LRH-150-Z),珠江韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器(BXM-30R)，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；超凈工作臺(CJ-1SFS)，天津市泰斯特儀器有限公司；高效液相色譜儀(Aglient1260LC)，安捷倫科技有限公司；PCR擴增儀(2720-Thermal-Cycler)，美國應用生物系統(tǒng)公司；電泳儀(JY5000)，北京君意東方電泳器有限公司；全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-1600),上海天能科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的初篩

將采摘回來的新鮮虎杖，用自來水清洗干凈后，從中選取表面健康無病害的新鮮虎杖，用體積分數(shù)為75%的酒精浸泡1 min，再用25 g/L次氯酸鈉溶液浸泡20 min，最后用無菌水沖洗6次，以清洗去除附著在虎杖表面的消毒液。經(jīng)表面消毒的虎杖采用漂洗液檢驗法[24]和組織印跡法[25]進行表面滅菌效果的檢驗。在無菌條件下將經(jīng)表面消毒的虎杖進行粉碎后，置于培養(yǎng)皿中，加適量無菌水使其潤濕，然后置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，自然固態(tài)發(fā)酵7 d。取固態(tài)發(fā)酵粉末適量，用無菌水[1∶10(g∶mL)]制成懸浮液并靜置30 min后，取200 μL上清液涂布于以虎杖苷為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，挑取長勢良好的霉菌頂端菌絲，轉接至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)，待菌落長成后，不斷重復先前的步驟直至獲得純培養(yǎng)物。純化后的菌株編號后分別接種至PDA斜面培養(yǎng)基中，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株的復篩

1.3.2.1 搖瓶培養(yǎng)

用接種針從保存斜面中挑取少量菌絲點種于PDA培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌落長直徑達4～5 cm后，無菌條件下用φ= 6 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅4塊，接至含100 mL PDB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)4 d，用4層紗布過濾，分別收集菌體細胞和發(fā)酵液，4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 菌體細胞轉化虎杖苷實驗

取10 mg/mL虎杖苷甲醇溶液0.2 mL、菌體細胞2 g(濕重)依次加入到含有19.8 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)的100 mL三角瓶中，在30 ℃，180 r/min的條件下，轉化48 h后，取樣進行HPLC檢測。每個菌株進行3次平行試驗。

上述體系中，不加菌體細胞同法操作作為底物對照，用0.2 mL甲醇代替虎杖苷溶液同法操作作為菌體對照。

1.3.2.3 發(fā)酵液轉化虎杖實驗

取10 mg/mL虎杖苷甲醇溶液0.2 mL、發(fā)酵液1 mL依次加入到含有19 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)的100 mL三角瓶中，在30 ℃，180 r/min的條件下，轉化48 h后，取樣進行HPLC檢測。每個菌株進行3次平行試驗。

上述體系中，用1 mL液體培養(yǎng)基代替發(fā)酵液同法操作作為底物對照，用0.2 mL甲醇代替虎杖苷溶液同法操作作為菌體對照。

1.3.3 菌株鑒定

菌株總DNA的提取參照WEILAND[26]所述方法進行。

DNA的PCR擴增使用PCR擴增試劑盒進行。按照試劑盒說明書加樣，其中，引物分別為ITS1和ITS4。PCR擴增程序為:95 ℃預變性2 min，95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min[27]。

用10 g/L的瓊脂糖凝膠、0.5×TBE為電泳緩沖液、80 V電壓進行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。將電泳合格的PCR擴增產(chǎn)物，委托上海生工生物工程有限公司進行序列分析，測序分析數(shù)據(jù)在美國NCBI網(wǎng)站上進行DNABlast比對分析，獲取比對指標靠前的相似序列，在MEGA5.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的歸屬。

1.3.4 HPLC分析

1.3.4.1 色譜條件

采用HPLC方法測定轉化液中的虎杖苷和白藜蘆醇[28]。測定在安捷倫Agilent 1260色譜儀上進行，色譜柱為Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測器為DAD二極陣列管，檢測波長305 nm，柱溫為30 ℃，流動相流速1 mL/min，進樣量10 μL，流動相的組成為乙腈和甲酸水溶液(體積比35∶65)。在該色譜條件下，虎杖苷和白藜蘆醇的保留時間分別為3.22、6.06 min。

1.3.4.2 標準曲線繪制

分別稱取虎杖苷和白藜蘆醇標準品各 0.5 g，用甲醇溶解定容，配制成 1 mg/mL虎杖苷、白藜蘆醇儲備液，備用。并將其稀釋成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL。以樣品質量濃度作為x軸，峰面積作為y軸繪制標準曲線。其中虎杖苷標準曲線方程為y=22 965x-13.224(相關系數(shù)r=0.999 6)，白藜蘆醇的標準曲線方程y=74 886x-0.998 3(相關系數(shù)r=0.998 1)。

1.3.4.3 虎杖內(nèi)生真菌轉化虎杖苷的HPLC分析

將樣品稀釋適當倍數(shù)后，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，按上述方法進行HPLC分析，按公式(1)計算產(chǎn)物白藜蘆醇的摩爾轉化產(chǎn)率：

(1)

2 結果與分析

2.1 菌株初篩結果

按1.3.1小節(jié)的方法，以虎杖苷為唯一碳源進行選擇性培養(yǎng)，共分離純化獲得4株長勢良好的虎杖內(nèi)生真菌，將其分別編號為HZ001、HZ002、HZ003和HZ004。

在馬鈴薯葡萄糖平板培養(yǎng)基上，HZ001菌落疏松、干燥、不透明，呈絨毛狀，為紅褐色。HZ002菌落生長快，表面成黑色粉末狀。HZ003最初為黃色，后變?yōu)辄S綠色至顏色變暗、平坦、反面無色。HZ004為灰色隆起，邊緣整齊，表面光滑、突起。顯微鏡檢結果表明，HZ001菌株基部沒有假根，也沒有足細胞，頂部形成了球狀的頂囊，菌絲有無隔膜，孢子連著一條分枝形成類似蝌蚪狀的形態(tài),孢子的形狀呈球狀。HZ002分生孢子有橫隔，光滑,頂端不形成膨大的頂囊,菌絲有橫隔，基部無足細胞。HZ003有球形或近球形的分生孢子，黃綠色，孢子直徑大，分生孢子梗上再生長出膨大的頂囊，近球形。HZ004菌絲呈分隔狀，分生孢子頭呈連珠狀，且可見孢子梗上有孢子囊，梗上有分生孢子，分生孢子梗粗糙無色，頂囊呈球形。

2.2 菌株復篩結果

按照1.3.2小節(jié)的方法對初篩的4株虎杖內(nèi)生真菌轉化虎杖苷生成白藜蘆醇的性能進行復篩，菌體細胞轉化體系和發(fā)酵液轉化體系的HPLC分析結果分別見圖1和圖2。

由圖1可知，與標準對照(虎杖苷和白藜蘆醇質量濃度均為1 mg/mL甲醇溶液)相比較，HZ001(圖1，C)和HZ004(圖1，I)的菌體細胞轉化中底物虎杖苷的色譜峰消失，在6.06 min處出現(xiàn)產(chǎn)物白藜蘆醇色譜峰，表明HZ001和HZ004菌體細胞具有較好的轉化虎杖苷生成白藜蘆醇的活性。HZ002(圖1，E)和HZ003(圖1，G)的菌體細胞轉化體系中底物虎杖苷的色譜峰消失，但未出現(xiàn)新色譜峰，表明HZ002和HZ003能夠利用或吸附虎杖苷，但未轉化生成胞外新產(chǎn)物。

圖1 虎杖內(nèi)生真菌菌體細胞轉化虎杖苷的HPLC圖Fig.1 HPLC diagrams of transformation of polydatin by the cells of endophytic fungi from Polygonum cuspidatum

圖2 虎杖內(nèi)生真菌發(fā)酵液轉化虎杖苷的HPLC圖Fig.2 HPLC diagrams of transformation of polydatin by the fermentation broths of endophytic fungi from P.cuspidatum

由圖2可知，HZ001(圖2，C)、HZ003(圖2，G)和HZ004(圖2，I)的發(fā)酵液轉化體系中均出現(xiàn)了白藜蘆醇色譜峰，表明該3菌株發(fā)酵液中均有一定的胞外酶活性。

按1.3.4.3小節(jié)的方法分別計算各菌株菌體細胞和發(fā)酵液轉化虎杖苷生成白藜蘆醇的摩爾轉化產(chǎn)率，結果如表1所示。

表1 虎杖內(nèi)生真菌轉化虎杖苷生成白藜蘆醇的轉化產(chǎn)率Table 1 Conversion yields of polydatin to resveratrol by endophytic fungi from P.cuspidatum

由表1可知，HZ001和HZ004菌株細胞轉化虎杖苷生成白藜蘆醇的轉化產(chǎn)率均可達100%。3菌株HZ001、HZ003、HZ004的發(fā)酵液轉化虎杖苷生成白藜蘆醇的轉化產(chǎn)率分別為51%、40%和38%。綜上可知，從虎杖中分離獲得的4株內(nèi)生真菌中，HZ001和HZ004轉化虎杖苷生成白藜蘆醇的活性最好，其主要靠胞內(nèi)酶發(fā)揮作用，而HZ003具有一定的轉化效果，其以胞外酶起作用。

2.3 菌株鑒定結果

按1.3.3小節(jié)的方法對菌株的DNA進行提取和PCR擴增后，進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示。結果表明，4株虎杖內(nèi)生真菌DNA的分子量均為650 bp左右。對菌株序列進行分析，將分析結果在NCBI網(wǎng)站上進行Blast比對，然后挑選同源性較高的菌株序列，采用MEGA5.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。結果表明，HZ001和HZ002分別歸屬為Aspergillusaculeatus和Penicilliumgeorgiense，HZ003和HZ004則均歸屬為Aspergillusflavus。

圖3 虎杖內(nèi)生真菌DNA提取物PCR擴增產(chǎn)物 瓊脂糖凝膠電泳譜圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis photograph of PCR products from DNA extracts of the endophytic fungi from P.cuspidatum

圖4 虎杖內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the endophytic fungi from P.cuspidatum

3 結論

虎杖作為我國常用中藥，臨床用途非常廣泛，其有效成分白藜蘆醇在醫(yī)藥、食品、化妝品中的應用也越來越廣泛。本文以虎杖苷為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基從廣西產(chǎn)新鮮虎杖中分離出4株內(nèi)生真菌HZ001、HZ002、HZ003和HZ004。菌體細胞生物轉化和發(fā)酵液生物轉化試驗結果表明， HZ001和HZ004轉化虎杖苷生成白藜蘆醇的性能最強，在本實驗的條件下白藜蘆醇的轉化產(chǎn)率可達100%，其主要靠胞內(nèi)酶發(fā)揮作用。而HZ003具有一定的轉化效果，其以胞外酶起作用，白藜蘆醇的轉化產(chǎn)率約為40%。菌株鑒定結果表明，HZ001和HZ002分別歸屬為Aspergillusaculeatus和Penicilliumgeorgiense，HZ003和HZ004則均歸屬為Aspergillusflavus。