萬茵，余新金，馮思麟，王家槐，肖輝，雷宇，皮瀟文，李文輝，付桂明*

1(食品科學與技術國家重點實驗(南昌大學)，江西 南昌，330047)2(南昌大學 食品學院，江西 南昌，330047) 3(北京二商(江西大觀樓)食品有限公司，江西 高安，330802)

嘌呤(purine)，又稱普林，是一類帶堿性的2個相鄰碳氮環(huán)的含氮有機化合物，分子式C5H4N4[1]，在食品中主要以核酸、嘌呤核苷酸的形式存在[2]，在人體內(nèi)代謝成終產(chǎn)物尿酸(2,6,8-三氧嘌呤)[3]。若嘌呤代謝出現(xiàn)障礙，會導致機體尿酸生成增加或尿酸排泄減少，出現(xiàn)高尿酸血癥[4]，超飽和的尿酸易以尿酸鈉晶體形式在各個組織和器官等處沉積(如關節(jié)、軟組織及腎器官)，導致關節(jié)發(fā)炎、尿路結石及其他并發(fā)癥[1,5]。男性體內(nèi)血清尿酸鈉濃度超過420 μmol/L，女性超過357 μmol/L的患者易得痛風和尿酸性結石[6]。

腐竹是大豆植物蛋白制品，其結構為蛋白質-脂類薄膜，由豆?jié){中的蛋白質受熱變性與脂類物質在液-氣界面吸熱聚合，同時蒸發(fā)脫水凝結而成[7]，又名腐皮，起源于唐朝，距今已有一千多年的歷史，是中國人很喜愛的傳統(tǒng)大豆制品[8]。腐竹含有豐富的營養(yǎng)成分，每100 g腐竹含有14 g脂肪、25.2 g蛋白質、48.5 g糖類及其他維生素和礦物元素[9]，素有“豆制品中的營養(yǎng)冠軍”之稱[10]。據(jù)檢測豆制品中嘌呤含量在84.4～1 674.9 μg/g，平均為823.0 μg/g[11]，歸屬為痛風患者宜限量食用的中等嘌呤含量食物[12]，而腐竹總嘌呤含量在1 528.1～1 669.3 μg/g，遠高于豆制品的平均值，因此痛風病人更需限量食用腐竹。

為降低豆?jié){中的核酸、核苷酸和嘌呤(統(tǒng)稱嘌呤類物質)，本文將樹脂吸附和核酸酶酶解核酸2種方法相結合，通過正交實驗確定去除嘌呤類物質的最佳技術條件，開發(fā)出適宜高尿酸血癥等特殊人群的低嘌呤腐竹產(chǎn)品，擴大腐竹消費人群，同時可為其他豆制品的嘌呤去除提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：大豆，北京二商(江西大觀樓)食品有限公司提供；離子交換樹脂NUF01、NUF110、NUF10和NUF20，為向樹脂生產(chǎn)企業(yè)訂制實驗室改良產(chǎn)品；腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤，色譜純，美國Sigma公司；四丁基氫氧化銨(含體積分數(shù)10%的甲醇溶液)，國產(chǎn)色譜純；食品級核酸酶(4萬U/g，5′-磷酸二酯酶)、鳥嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸為國產(chǎn)生化試劑，KH2PO4、K2HPO4、冰乙酸、KOH、高氯酸、氯仿、正丁醇、無水乙醇、NaCl、檸檬酸三鈉、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、NaOH、氯仿、異戊醇、高氯酸鈉均為國產(chǎn)分析純。

Waters高效液相色譜系統(tǒng)，美國Waters公司；PHS-3C精密pH計、FA1604上皿分析天平、UV-7504單光束紫外-可見分光光度計、FA-1604電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司；5810R離心機，Eppendorf 股份有限公司；JJ-2高速組織搗碎機，金壇區(qū)西城新瑞儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜法測定嘌呤含量

Waters高效液相色譜系統(tǒng)，e2695泵，2998檢測器，Phenomenex luna 5 μm C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)，集成自動進樣器，Empower Pro工作站；柱溫25 ℃，進樣量10 μL；紫外檢測器波長254 nm；流速0.8 mL/min。流動相，超純水、冰乙酸、四丁基氫氧化銨體積比為997∶1.5∶1.5的混合液[13](流動相A)與無水甲醇(流動相B)按97∶3的體積比混合。參照毛玉濤等[14]方法繪制嘌呤標準曲線，計算樣品中嘌呤含量。

1.2.2 豆?jié){中嘌呤含量的測定

1.2.2.1 原料預處理

取85 g干大豆，洗凈，加入300 g蒸餾水浸泡10 h，用高速組織搗碎機打成豆?jié){，再加入900 g蒸餾水混勻，100目紗布過濾除豆渣，得到豆?jié){樣液，分裝凍藏待用。

1.2.2.2 豆?jié){總嘌呤含量檢測

參照文獻[15]的方法。量取2 mL豆?jié){樣液于50 mL燒杯中，加入10 mL 體積分數(shù)70% HClO4溶液，沸水浴水解0.5 h，冰浴冷卻，用8 mol/L KOH溶液調(diào)pH至7.0，濾去沉淀，再用0.2 mol/L的冰乙酸調(diào)pH至3.0，離心，取上層清液加水定容至50 mL，取1 mL上清液過0.22 μm濾膜濾，進行高效液相色譜分析。

1.2.3 根據(jù)嘌呤核苷酸吸附率選擇樹脂

準確稱量50 mg鳥嘌呤核苷酸標準品、50 mg腺嘌呤核苷酸標準品，用雙蒸水定容至500 mL，配制成質量濃度為100 μg/mL的鳥嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸混合溶液。取30 mL 100 μg/mL核苷酸標準混合溶液于100 mL小燒杯中，加入1 g樹脂，置于恒溫水浴鍋，60 ℃攪拌吸附1 h，過濾，稀釋，采用紫外分光光度法在260 nm處測光吸收值，按公式(1)計算濾液中的核苷酸含量。比較4種樹脂對核苷酸的吸附效果，選擇吸附率高的樹脂。

(1)

式中：OD260為溶液在 260 nm 波長下的光吸收值；N為稀釋倍數(shù)；0.032為1 mL溶液含1 μg核苷酸的比消光系數(shù)。

1.2.4 豆?jié){的核酸酶酶解條件預實驗

1.2.4.1 核酸酶用量

取30 mL豆?jié){于100 mL小燒杯中，分別加入6.67、12.33、20.00、26.67 和33.33 U/mL核酸酶，置于60 ℃恒溫攪拌水浴鍋中酶解1 h后，測定豆?jié){中核苷酸和核酸含量，按公式(2)計算酶解轉化率，并分析核酸酶用量對酶解轉化率的影響。

(2)

1.2.4.2 酶解時間

取30 mL豆?jié){于100 mL小燒杯中，加入26.67 U/mL核酸酶，置于60 ℃恒溫攪拌水浴鍋中分別反應0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h，分析酶解時間對酶解轉化率的影響。

1.2.4.3 酶解溫度

取30 mL豆?jié){于100 mL小燒杯中，加入26.67 U/mL核酸酶，置于恒溫攪拌水浴鍋中，分別在50、55、60、65、70和75 ℃下反應1 h，分析酶解溫度對酶解轉化率的影響。

1.2.5 樹脂NUF20結合核酸酶酶解技術條件的確定

1.2.5.1 樹脂添加量對嘌呤吸附效果的影響

取30 mL豆?jié){于100 mL 燒杯中，分別加入3、4、5、6和7.5 g樹脂，26.67 U/mL核酸酶，置于70 ℃恒溫水浴鍋中，攪拌吸附1 h，過濾，按1.2.2.2小節(jié)方法檢測總嘌呤含量，按公式(3)計算吸附率?？疾鞓渲砑恿繉ξ叫Ч挠绊憽?/p>

(3)

式中：X，豆?jié){嘌呤類物質的吸附率，%；ρ0，酶解吸附前豆?jié){總嘌呤質量濃度，mg/mL；ρ，酶解吸附后豆?jié){總嘌呤質量濃度，mg/mL。

1.2.5.2 處理溫度對嘌呤吸附效果的影響

取30 mL豆?jié){于100 mL燒杯中，加入6 g樹脂、26.67 U/mL核酸酶，置于恒溫水浴鍋中，分別在60、70和80 ℃下攪拌吸附1 h，過濾，分析同上?？疾觳煌瑴囟葘ξ叫Ч挠绊?。

1.2.5.3 處理時間對嘌呤吸附效果的影響

取30 mL豆?jié){于100 mL燒杯中，加入6 g樹脂，26.67 U/mL核酸酶，置于70 ℃恒溫水浴鍋中，分別攪拌吸附0.5、1、1.5和2 h，過濾，分析同上?？疾焯幚頃r間對吸附效果的影響。

1.2.5.4 正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，確定各因素對應水平，按L9(34)正交表安排正交試驗。

1.2.5.5 嘌呤吸附率的計算

按公式(3)計算豆?jié){中總嘌呤類物質的吸附率[16]。

1.2.6 腐竹成品嘌呤含量檢測

采用煮漿揭皮鍋(由北京二商(江西大觀樓)食品有限公司提供)進行低嘌呤腐竹工業(yè)化制作實驗，將按照前期研究所獲最佳的酶解條件、最佳樹脂類型及用量、最佳吸附溫度和時間處理的豆?jié){倒入揭竹盤，漿量約為盤容量的2/3，揭竹溫度控制在80～85 ℃。待豆?jié){表面自然凝固成薄膜時，用涂油的竹棍挑起，將腐竹內(nèi)的漿液控干之后烘干。稱量腐竹樣品(精確到0.000 g)于燒杯中，加入10 mL 體積分數(shù)為70%的HClO4溶液，在100 ℃水浴鍋中水解1 h，冰浴冷卻，用8 mol/L KOH溶液中和水解液pH至7.0，濾去沉淀物，再用0.2 mol/L的冰乙酸溶液調(diào)pH至3.0，離心，取上清液加水定容至50 mL，再取1 mL樣品過0.22 μm濾膜，進行高效液相色譜分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

本實驗采用Origin 9.0作圖，并通過SPSS 21.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)的方差和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 嘌呤標準曲線

圖1為4種嘌呤標準品的高效液相色譜圖，腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤的保留時間分別為9.859、12.580、17.364和20.439 min，各峰達到了完全分離。

圖1 四種嘌呤標準品的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatograms of four purine standards

對每種嘌呤的峰面積(Y)與對應質量濃度(X)進行線性回歸分析，得線性回歸方程、相關系數(shù)R2及RSD于表1。由表1可知，RSD<1%，可知該方法精密度高，重現(xiàn)性很好。

表1 四種嘌呤的標準曲線及方法精密度Table 1 Standard curve of four purine and accuracy of the method

2.2 豆?jié){中的嘌呤含量分析

圖2為豆?jié){經(jīng)高氯酸水解后的高效液相色譜圖，經(jīng)與圖1比對，可見腺嘌呤、鳥嘌呤的峰的保留時間分別為9.888和12.874 min，未見另2種嘌呤的峰，可能是含量太低導致未能檢出。不同品種大豆生產(chǎn)的豆?jié){中嘌呤含量有所不同，但本文中黃嘌呤和次黃嘌呤含量很低的結果與文獻報道基本一致。如毛玉濤等[14]測定了貴州地區(qū)大豆制作的豆?jié){中嘌呤含量，未在豆?jié){中檢測到黃嘌呤和次黃嘌呤；李慧慧等[17]采用高效液相色譜法在豆?jié){中檢出了黃嘌呤和次黃嘌呤，但含量偏低。根據(jù)計算，豆?jié){中腺嘌呤、鳥嘌呤的含量分別為(52.2±1.09)和(68.9±2.28)mg/L，總嘌呤含量為(121.1±3.38)mg/L。

2.3 嘌呤核苷酸吸附效果最佳樹脂確定

由表2可見，樹脂NUF10和樹脂NUF20對嘌呤核苷酸的吸附效果很好，吸附率分別達到96.48%和98.4%，均超過95%，樹脂NUF110對嘌呤核苷酸吸附作用微弱，吸附率只有9.6%，而樹脂NUF01對核苷酸幾乎沒有吸附，這可能是由于不同種類樹脂性質和結構不同，導致對嘌呤核苷酸的吸附效果存在顯著差異。所以選定樹脂NUF20進行后續(xù)實驗。

圖2 豆?jié){中嘌呤的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatograms of various purines in soymilk

表2 四種樹脂對嘌呤核苷酸的吸附率 單位：%

2.4 豆?jié){的核酸酶酶解條件

由圖3-a可知，豆?jié){的核酸酶酶解條件：核酸酶用量26.67 U/mL，溫度60 ℃，酶解時間為1 h時，酶解轉化率為(79.51±1.32)%，較其他水平的高。由圖3-b可知，26.67 U/mL，溫度60 ℃，酶解時間為2 h時，酶解轉化率為(85.71±3.01)%，較其他水平的高，但1 h的酶解率即可達到(81.20±1.88)%，為了節(jié)約時間和生產(chǎn)成本，后續(xù)實驗采用了1 h的作用時間。由圖3-c可知，核酸酶用量26.67 U/mL，酶解溫度在70 ℃，酶解時間為1 h時，酶解轉化率為(84.40±4.32)%，較其他水平的高。比較上述酶解轉化率數(shù)值，并參考文獻的報道，陳雪玉等[18]酶解RNA的水解溫度為70 ℃，慕娟[19]以麥芽根為核酸的水解酶源制備核苷酸時，酶解溫度也為70 ℃，故將核酸酶用量26.67 U/mL、酶解1 h、溫度70 ℃作為后續(xù)實驗的參考值。

a-酶用量；b-反應時間；c-反應溫度圖3 酶用量、反應時間和反應溫度對豆?jié){核酸酶解反應的影響Fig.3 Effects of enzyme dosage, reaction time and reaction temperature on nuclease hydrolysis in soymilk

2.5 樹脂NUF20結合核酸酶酶解的最佳工藝條件

2.5.1 樹脂添加量、反應溫度和反應時間對吸附效果的影響

由圖4可知，當樹脂的添加量逐漸增大時，嘌呤的吸附率也逐漸增大，當樹脂添加量達到0.2 g/mL時，吸附率已趨于平穩(wěn)，反應溫度對嘌呤吸附率的影響不是很大，70 ℃時，嘌呤吸附率最大。隨著反應時間的增長，嘌呤吸附率先明顯上升，1 h的吸附率高達95%以上，后即使時間延長，吸附率仍保持相對平穩(wěn)。

由表4可見，R1>R2>R3，因素A對嘌呤吸附率的影響最大，其次是因素B、因素C，最佳組合為A3B3C3。但從單因素試驗中可以得出，當樹脂添加量為0.2 g/mL時，吸附率已趨于平穩(wěn)；當吸附時間為1 h時，吸附率增加趨勢已經(jīng)不明顯。k2與k3相差不大，為節(jié)省能耗，縮短生產(chǎn)周期，且考慮到樹脂添加量越大以及吸附時間越長，對豆?jié){的理化與感官性質影響越大，故在樹脂添加量為0.2 g/mL、反應溫度70 ℃下攪拌吸附1 h，嘌呤平均吸附率(91.73±0.32)%，即豆?jié){絕大部分嘌呤類物質可被除去。從文獻中獲知幾種對豆?jié){中嘌呤物質的脫除方法的效果，如CaCl2對豆?jié){中嘌呤物質的去除率為45.33%[16]，活性炭對豆?jié){中嘌呤物質的脫除率為48.88%[20]，CaCl2鹽析結合活性炭吸附處理得到的最高嘌呤脫除率65.87%[17]。通過對比可知，本文將樹脂吸附和核酸酶酶解核酸相結合的處理方法所得到的嘌呤脫除率較高。

a-樹脂添加量；b-反應溫度；c-反應時間圖4 樹脂添加量、反應溫度和反應時間對豆?jié){中嘌呤吸附率的影響Fig.4 Effect of resin addition，reaction temperature and reaction time on purine adsorption rate in soymik

2.5.2 正交實驗結果

根據(jù)單因素試驗結果，確定各因素對應水平見表3。

表3 因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

表4 正交實驗結果Table 4 Results of orthogonal experiment

表5 正交試驗方差分析表Table 5 ANOVA of orthogonal experiment

2.6 樹脂NUF20結合核酸酶酶解技術生產(chǎn)的腐竹成品降嘌呤效果分析

由表6可知，對照組腐竹總嘌呤含量為(1 226.4±8.21)μg/g，不同原材料和生產(chǎn)工藝制作而成的腐竹嘌呤含量有所不同，榮勝忠等[11]測得的腐竹嘌呤含量為(1 598.7±70.6)μg/g。與對照組相比，經(jīng)過樹脂NUF20結合核酸酶酶解技術處理加工的腐竹產(chǎn)品，第1～5張腐竹中總嘌呤含量分別下降(89.70±0.80)%、(88.28±0.72)%、(76.69±0.41)%、(72.03±0.58)%和(65.62±0.47)%。其中，第1、2張腐竹總嘌呤含量分別為126.29和143.48 μg/g，低于普通低嘌呤食品250 μg/g限量。

表6 腐竹中嘌呤含量的變化Table 6 Change of purine content in dried beancurd sticks

3 結論

優(yōu)化得到樹脂NUF20結合核酸酶酶解吸附豆?jié){中嘌呤的工藝條件為:核酸酶26.67 U/mL，樹脂添加量0.2 g/mL，反應溫度70 ℃下攪拌吸附1 h，豆?jié){中的嘌呤類物質吸附率最高達98.40%。與對照組相比，經(jīng)過樹脂NUF20結合核酸酶酶解技術處理加工的腐竹產(chǎn)品，第1～5張腐竹的嘌呤含量分別下降89.70%、88.28%、76.69%、72.03%和65.62%，其中第1、2張腐竹總嘌呤含量分別為126.29 和143.48 μg/g，屬于低嘌呤食品。據(jù)此研究開發(fā)出一種適合具高血尿酸癥和痛風的特殊人群的低嘌呤腐竹產(chǎn)品，豐富市場上腐竹產(chǎn)品的種類，也擴大了腐竹的消費人群，同時可為其他豆制品中降嘌呤研究提供理論參考，能進一步帶動低嘌呤豆制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。