董晨陽，張紅星，賈宇，謝遠紅，劉慧，金君華*

1(北京農(nóng)學院 食品科學與工程學院，北京，102206)2(食品質(zhì)量與安全北京實驗室(北京農(nóng)學院)，北京，102206) 3(農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京重點實驗室(北京農(nóng)學院)，北京，102206)

氧化應激是導致機體衰老和與衰老相關疾病的根本原因，可能引起糖尿病、動脈粥樣硬化、關節(jié)炎、高血脂、心腦血管疾病等多種疾病[1]。近年來，乳酸菌具有抗氧化作用的報道逐步增多，人們對乳酸菌抗氧化功能的認識也在不斷深入。KULLISAAR等[2]發(fā)現(xiàn)了2株發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)E-3、E-18，均能耐受H2O2且對羥自由基(·OH)有較強的清除能力。ZHAI等[3]評價了10株乳酸菌菌株的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM 8661菌液表現(xiàn)出較最強的脂質(zhì)過氧化抑制活性。

乳酸菌主要通過清除細胞及周圍的活性氧自由基、螯合金屬離子、緩解脂質(zhì)過氧化、自身抗氧化防御系統(tǒng)調(diào)控、調(diào)節(jié)宿主細胞抗氧化防御系統(tǒng)、調(diào)節(jié)宿主細胞與抗氧化相關的信號通路等方式發(fā)揮抗氧化作用[4-6]。乳酸菌的自身抗氧化防御系統(tǒng)分為酶類系統(tǒng)與非酶類系統(tǒng)，可以通過乳酸菌體內(nèi)存在的氧化還原調(diào)控系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化作用[7-8]。

目前，國內(nèi)外已有關于唾液乳桿菌體外抗氧化功能評價的研究，但是關于其抗氧化機制，尤其是結(jié)合全基因組序列信息，在分子層面對抗氧化機理的探究卻鮮有報道。本研究全面評價了1株唾液乳桿菌M18-6的體外抗氧化功能，檢測其無細胞上清液、菌懸液、細胞內(nèi)容物的體外抗氧化指標，并從菌株基因組中挖掘11個與抗氧化相關蛋白的編碼基因，在mRNA水平探討菌株在H2O2氧化脅迫環(huán)境下的分子應答機制。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

(1)試驗菌株：唾液乳桿菌M18-6,保藏號為CGMCC 16199。

(2)參考菌株：鼠李糖乳酸桿菌 (LactobacillisrhamnosusGG，LGG)ATCC 53103, 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院保藏。

1.2 材料、試劑

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(貨號A001-1-2)、過氧化氫酶(catalase， CAT)試劑盒(貨號A007-1-1)、谷胱甘肽過氧化物酶 (glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒(貨號A005-1-2)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)檢測試劑盒(貨號A015-2-1)，南京建成生物工程研究所；PrimeScriptTM1 st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(貨號6110A)、TB Green Premix ExTaqⅡ 試劑盒(貨號RR820A)、Recombinant DNase Ⅰ試劑盒(貨號2270A)，寶生物工程(大連)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、鄰二氮菲、FeSO4、H2O2、K3[Fe(CN)6]、FeCl3、亞油酸、三氯乙酸(trichloroacetic acid solution，TCA)、L-半胱氨酸、鹽酸、抗壞血酸鹽、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene，BHT)、丁醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.3 體外抗氧化功能評價

1.3.1 樣品制備

將菌株以體積分數(shù)為2%的接種量接種于MRS肉湯中，37 ℃恒溫培養(yǎng) 12 h，傳至3代備用。將活化好的菌液，4 ℃下5 000×g離心 10 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾所得濾液即為發(fā)酵上清液；菌體沉淀重懸于等體積無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(pH 7.4，下同)中得到菌懸液；菌體沉淀用無菌PBS緩沖液洗滌3次，重懸于無菌 PBS 緩沖液中，調(diào)整細菌的濃度為1×109CFU/mL，并用細胞破碎儀400 W 間歇 4 s，破碎 5 min，10 000×g離心10 min，收集上清液為細胞內(nèi)容物[9]。

1.3.2 DPPH自由基清除能力

將新配制的2 mL 0.1 mmol/L DPPH試劑與1 mL待測樣品混合，室溫下靜置30 min，5 000×g離心10 min，于517 nm處測定上清液的吸光值(A樣品)，以去離子水代替樣品測定的吸光值(A對照)，以無水乙醇代替DPPH測定的吸光值(A空白)，以去離子水和無水乙醇調(diào)零[10]。按照公式(1)計算DPPH自由基清除能力：

(1)

式中：A對照，1 mL H2O+2 mL DPPH；A空白，1 mL無水乙醇+2 mL樣品；A調(diào)零，1 mL H2O+2 mL無水乙醇。

1.3.3 ·OH清除率

將1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲試劑、2 mL PBS緩沖液、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4充分混勻，加入1 mL 體積分數(shù)為10%的H2O2和1 mL待測樣品溶液，在37 ℃環(huán)境下靜置90 min， 在波長536 nm處測吸光值為As。用生理鹽水替代樣品得到的吸光值為Ac，用生理鹽水代替H2O2和樣品溶液得到的吸光值為Ab[11]。按照公式(2)計算·OH清除率：

(2)

1.3.4 總還原能力

在0.5 mL待測樣品中加入0.5 mL PBS緩沖液、0.5 mL 10 g/L K3[Fe(CN)6]，置于50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷卻，加入0.5 mL 100 g/L TCA，3 000×g離心5 min，取1 mL上清液，加入1 mL蒸餾水及1 mL 1 g/L FeCl3，混合均勻，在室溫下靜置10 min，在波長700 nm處測吸光值，蒸餾水做空白管。

配制0～400 μmol/L的L-半胱氨酸鹽酸鹽，按上述步驟測吸光值，做標準曲線，將樣品吸光值帶入標準曲線，計算半胱氨酸當量[12]。

1.3.5 亞油酸過氧化抑制率

將1 mL亞油酸的乳化液與0.5 mL PBS溶液混合，加入0.2 mL 0.1 g/L FeSO4溶液、0.02 mL 0.1 g/L 抗壞血酸鹽和0.4 mL待測樣品，混勻后置于37 ℃水浴反應12 h，向混合液中加入0.2 mL 40 g/L TCA、2 mL 8 g/L TBA和0.2 mL 4 g/L BHT，混勻后在100 ℃水浴中反應30 min，取出后迅速冷卻，用2 mL丁醇提取，在532 nm處測定其上清液的吸光值為A樣品，用PBS緩沖液代替樣品的吸光值為(A空白)[5]。按照公式(3)計算亞油酸過氧化抑制率：

(3)

1.3.6 抗氧化酶類物質(zhì)活性

用試劑盒測定菌懸液、無細胞上清液、無細胞提取物中GSH-Px、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)和CAT的活性以及T-AOC。

1.4 全基因組測序以及抗氧化相關基因信息挖掘

將活化好的菌體交由美吉生物公司，結(jié)合2代Illumina Hiseq×10平臺及3代PacBio測序平臺，進行基因組序列測定，獲取菌株基因組完成圖[13]。將預測得到的編碼基因通過與數(shù)據(jù)庫(NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG)進行比對進行功能注釋。挖掘與抗氧化相關蛋白的編碼基因，利用NCBI設計引物，與內(nèi)參基因引物一同在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 總RNA的提取、cDNA的合成以及RT-qPCR

將2代的菌液以體積分數(shù)為2%的接種量分別接種到H2O2濃度為0、0.5、1.0、1.5、2和2.0 mmol/mL 的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，取2 mL菌懸液，4 ℃環(huán)境下12 000×g離心5 min。采用玻璃珠-酚仿法提取菌體RNA，利用TAKARA Recombinant DNase Ⅰ試劑盒消化DNA，具體方法參考吳思琪等[14]研究。

cDNA合成：利用TAKARA公司的PrimeScriptTM1 st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。

RT-qPCR體系：1 μL模板、1 μL上游引物、1 μL下游引物、0.4 μL ROX、0 μL TB GREEN 1和6.6 μL H2O。具體步驟為：95 ℃預變性3 min，擴增循環(huán)(95 ℃ 10 s，引物Tm 30 s)，39個循環(huán)，對每種目的基因的擴增反應都進行了擴增產(chǎn)物的融解曲線分析。

將cDNA樣品的連續(xù)稀釋后進行實時熒光定量PCR，做標準曲線評估引物擴增效率，擴增效率在1.90～2.05的引物用于后續(xù)的mRNA水平檢測，利用2-ΔΔCT計算基因表達水平，將內(nèi)參基因的表達量設定為1[15]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,采用t檢驗分析樣品的差異顯著性，P<0.05時認為有顯著性差異

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株體外抗氧化能力評價

2.1.1 DPPH自由基清除能力

由圖1可知，唾液乳桿菌M18-6的菌懸液、無細胞上清液以及細胞內(nèi)容物中均有較強的清除DPPH自由基的能力，其中無細胞上清液DPPH自由基清除能力最強(26.9%)，顯著高于菌懸液和細胞內(nèi)容物的清除能力，分別為13.9%和11.75%；無細胞上清液和細胞內(nèi)容物的DPPH自由基清除能力均顯著高于商業(yè)菌株LGG的無細胞上清液和細胞內(nèi)容物，分別為20.2%和9.05% (P<0.05)。結(jié)果表明，菌株無細胞上清液中的活性物質(zhì)能很好地清除DPPH自由基。有研究表明，菌體清除DPPH自由基的能力與菌體代謝產(chǎn)生的胞外多糖有關[16]。

圖1 唾液乳桿菌M18-6清除DPPH自由基能力Fig.1 DPPH free radicals scavenging rate of L.salivarius M18-6 注：*表示與同處理組的LGG相比具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.1.2 ·OH清除能力

本實驗體系中，·OH由Fenton反應產(chǎn)生，被清除后體系中Fe2+的質(zhì)量濃度升高，吸光度也相應升高[17]?！H清除率如圖2所示，唾液乳桿菌M18-6的無細胞上清液以及細胞內(nèi)容物的·OH清除能力分別為61.95%和18.76%，其中無細胞上清液的清除·OH的能力顯著高于商業(yè)菌株LGG(49.21%) (P<0.05)。與類似研究結(jié)果相比較發(fā)現(xiàn)，唾液乳桿菌M18-6無細胞上清液的·OH清除能力高于其他乳桿菌。劉少敏[1]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌NDC 75017、嗜酸乳桿菌ATCC 14917和植物乳桿菌NCFM的無細胞上清液·OH清除率分別為32.13%、23.65%和17.28%，均低于本實驗的唾液乳桿菌M18-6。無細胞上清液中的·OH清除率高，說明菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了可清除·OH的活性物質(zhì)。

圖2 唾液乳桿菌M18-6的·OH清除率Fig.2 The hydroxyl radical scavenging rate of L.salivarius M18-6

2.1.3 總還原能力

具有抗氧化性的物質(zhì)可將K3[Fe(CN)6]還原成K4[Fe(CN)6]，再與Fe3+作用生成普魯士藍，在700 nm波長具有最大的光度值，以檢測普魯士藍的生成量作為試樣的還原能力[18]。如圖3所示，唾液乳桿菌M18-6的菌懸液、無細胞上清液以及細胞內(nèi)容物中均有較強的總還原能力，與對照菌株LGG持平，分別為371.125、1 448.625和155.29 μmol/L半胱氨酸當量，其中無細胞上清液顯著高于菌懸液與細胞內(nèi)容物(P<0.05)。由結(jié)果可知，菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了還原力強的活性物質(zhì)，還原能力優(yōu)于菌體與細胞內(nèi)容物。

圖3 唾液乳桿菌M18-6總還原能力Fig.3 The total reducing capacity of L.salivarius M18-6

2.1.4 亞油酸過氧化抑制能力

亞油酸易發(fā)生氧化而形成過氧化物，進而氧化Fe2+為Fe3+，與鄰菲羅啉中的SCN-生成絡合物，在500 nm處有最大吸光值，吸光值與亞油酸自氧化程度成正比[19]。由圖4可知，唾液乳桿菌M18-6具有良好的抑制亞油酸過氧化能力，其中無細胞上清液的抑制亞油酸過氧化能力為71.3%，顯著高于商業(yè)菌株LGG(54.08%)，也高于同菌株的菌懸液和細胞內(nèi)容物的抑制亞油酸過氧化能力，分別為31.79%和17.93%。結(jié)果表明，菌株無細胞上清液中的活性物質(zhì)是抑制亞油酸過氧化率的主要因素，部分完整細胞的非酶物質(zhì)也能夠起到一定的作用。

圖4 唾液乳桿菌 M18-6抑制亞油酸過氧化率Fig.4 Inhibition rate of linoleic acid peroxidation in L.salivarius M18-6 注：**表示與同處理組的LGG和菌株其他處理組相比 具有顯著性差異(P<0.05)

2.1.5 抗氧化酶類物質(zhì)活性

抗氧化酶類在機體防御活性氧的損傷中扮演著極為關鍵的角色[19]。如表1所示，唾液乳桿菌M18-6的菌懸液及無細胞上清液中具有GSH-Px活性，且活性顯著高于商業(yè)菌株LGG(P<0.05)；無細胞上清液中T-SOD活性顯著高于商業(yè)菌株LGG(P<0.05)；菌懸液中具有CAT活性；無細胞上清液以及細胞內(nèi)容物中檢測出較強的T-AOC。結(jié)果表明，SOD與GSH-Px活性主要展現(xiàn)在無細胞上清液中，證明其主要來源于菌體代謝產(chǎn)物；CAT活性主要是由于菌體表面的活性物；菌體無細胞上清液的T-AOC很強，與上文總還原能力結(jié)果一致。與類似研究結(jié)果相比較發(fā)現(xiàn)[20]，對于乳桿菌抗氧化酶類物質(zhì)的檢測，鮮有將這4種酶類同時檢測的報道，并且與同類菌株相比較，唾液乳桿菌M18-6的無細胞上清液的SOD、GSH-Px活性也有較強的優(yōu)勢。

表1 M18-6及LGG抗氧化酶類物質(zhì)活性單位：U/mg

2.2 基因水平分析菌株抗氧化功能機制

2.2.1 抗氧化相關基因的引物設計

硫氧還蛋白系統(tǒng)、谷胱甘肽系統(tǒng)和是乳酸菌細胞內(nèi)最主要的氧化還原調(diào)控系統(tǒng)[1]。硫氧還蛋白系統(tǒng)由硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)、硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase， TrxR)和還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)組成[21]。谷胱甘肽系統(tǒng)主要是由還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、GSH-Px、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)以及谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(glutathione-S-transferase，GST)組成[22]。

同時，sod、cat等抗氧化酶基因表達出的SOD和CAT能夠與過氧化物作用，發(fā)生還原反應，實現(xiàn)抗氧化的功能。根據(jù)以上抗氧化機理，選擇基因注釋中與抗氧化功能相關酶的基因，并設計相應引物(表2)。

2.2.2 H2O2脅迫下抗氧化相關基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

為了探討唾液乳桿菌M18-6的抗氧化機理，本研究檢測了菌株在不同濃度的H2O2脅迫環(huán)境下，基因組中11個抗氧化性相關基因(表2所示)在mRNA上表達水平變化(圖5)。研究結(jié)果顯示，各基因均在0.5 mmol/L H2O2脅迫后出現(xiàn)顯著表達上調(diào)，其中，NADH氧化酶(gene1634)和超氧化物歧化酶基因(sod)在2.5 mmol/L H2O2脅迫下，mRNA表達水平上調(diào)最多，分別上調(diào)了6.2和4.5倍。硫氧還蛋白系列(trxA1、trxA2、trxA3、trx)4個基因分別在2.5 mmol/L H2O2脅迫下表達上調(diào)了3.2、3.8、2.5和3.7倍，3個過氧化氫酶基因(cat1、cat2、cat3)分別上調(diào)了2.3、3.3和1.2倍，gene0157基因表達水平在H2O2脅迫下未發(fā)生顯著變化。推測在分子水平上，M18-6主要通過NADH氧化酶與硫氧還蛋白系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化作用[23]，并且sod、cat編碼的抗氧化。

表2 唾液乳桿菌M18-6基因組中抗氧化功能相關編碼基因及其引物設計Table 2 Genome and primer design of L.salivarius M18-6 about antioxidant function-encoding gene

圖5 唾液乳桿菌M18-6基因組中抗氧化相關基因在 H2O2脅迫環(huán)境下的mRNA表達水平Fig.5 The mRNA expression levels of antioxidant-related genes in the L.salivarius M18-6 genome under H2O2 stress

3 結(jié)論

M18-6無細胞上清液的DPPH自由基清除能力、·OH清除能力、亞油酸過氧化抑制能力均顯著高于商業(yè)菌株LGG，另外，菌株的無細胞上清液中的GSH-PX與SOD活性也顯著高于LGG上清液，表明菌株M18-6的無細胞上清液同時具有酶類和非酶類的抗氧化活性物質(zhì)。

針對唾液乳桿菌M18-6的抗氧化機制探討結(jié)果顯示，唾液乳桿菌M18-6可能通過上調(diào)NADH氧化酶基因與硫氧還蛋白系統(tǒng)相關基因(gene1634、trxA1、trxA2、trxA3、trx)表達，及激活硫氧還蛋白系統(tǒng)呈現(xiàn)抗氧化作用效果，同時sod和cat基因表達上調(diào)，提高SOD、CAT酶量，提高酶活力，發(fā)揮抗氧化作用。