敖軍，毛祥,2*

(1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000;2.四川輕化工大學 食品產業(yè)技術研究院，四川 宜賓 644000)

四川泡菜是在低鹽條件下，乳酸菌發(fā)酵產生乳酸，抑制其他有害微生物生長發(fā)育而成的發(fā)酵食品，含有豐富的營養(yǎng)物質，還具有一定的促消化、抑菌、預防疾病、降低膽固醇等作用[1-3]。在四川泡菜的發(fā)酵過程中，主導發(fā)酵的菌種有功能乳酸菌、酵母菌等，陳功[4]通過研究四川不同區(qū)域泡菜中優(yōu)勢微生物的菌群和生態(tài)分布確定了植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、短乳桿菌、耐乙醇片球菌等功能乳酸菌是四川泡菜發(fā)酵的優(yōu)勢菌群。李南薇[5]對接種乳酸菌發(fā)酵泡菜的研究發(fā)現(xiàn)，與自然發(fā)酵泡菜相比較，人工接種乳酸菌發(fā)酵泡菜能明顯縮短泡菜的發(fā)酵周期。敖曉琳等[6]認為功能乳酸菌的接種量對于泡菜口感的影響較小，但是對于泡菜產酸的速率，功能乳酸菌活菌數(shù)量的影響較大。酵母菌群在四川泡菜發(fā)酵過程中能夠消耗泡菜發(fā)酵前期環(huán)境中的氧氣，為泡菜后續(xù)發(fā)酵營造良好環(huán)境，而且賦予泡菜特殊的風味物質，如酯類、有機酸等。曾駿[7]認為酵母菌在泡菜發(fā)酵過程中也會產生一部分有機酸，對于泡菜的風味和酸度起到一定的作用，并且在大量的實驗后得出酸度和原材料是影響泡菜中酵母菌形態(tài)變化的重要因素。近年來，都側重研究單一功能菌株對于泡菜發(fā)酵的影響和形態(tài)變化，對功能乳酸菌、酵母菌結合的研究和泡菜強化發(fā)酵工藝方面的研究較少[8]。因此，本文主要通過接種不同濃度梯度的功能乳酸菌、酵母菌，研究泡菜發(fā)酵過程中乳酸、總酯的含量及變化情況的影響，并在功能乳酸菌與酵母菌的最適接種量下，探究功能乳酸菌、酵母菌的最適產酸、產酯溫度，初步建立四川泡菜的強化發(fā)酵工藝，為提升泡菜品質，縮短泡菜發(fā)酵周期，促進泡菜工業(yè)化、標準化純種發(fā)酵生產提供了理論依據[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗材料及菌種

白蘿卜、桂皮、八角、花椒、糖、香葉、白酒、食鹽：購于綠源超市；功能乳酸菌、酵母菌：實驗室提供。

1.1.2 實驗設備、試劑

GZ-250-HSⅡ恒溫恒濕箱 韶關市廣智科技設備有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；GR6F立式自動壓力蒸汽滅菌器、RJ-TDL-5低速臺式大容量離心機 天津市泰斯特儀器有限公司；SKY-210搖床 奧豪斯儀器(上海)有限公司。

瓊脂、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨：以上均為生化試劑；氯化鈉、檸檬酸氫二銨、吐溫80、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、碳酸鈉：以上均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基: 蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、檸檬酸氨二銨2 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、 磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸錳0.2 g、瓊脂粉18 g、蒸餾水1000 mL，pH 6.2～6.6。

YPD固體培養(yǎng)基：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、蒸餾水900 mL、瓊脂20 g、20%葡萄糖100 mL。

液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基成分相同，但不需添加瓊脂。

1.2 實驗方法

1.2.1 泡菜制作工藝流程

選材→清洗→切片→裝瓶→加入功能乳酸菌與酵母菌→加鹽水→封瓶→恒溫發(fā)酵。

泡菜鹽水：向7000 mL清水中放入花椒2 g、八角2個、桂皮1塊、香葉5片、冰糖10 g、老姜5 g，煮沸5 min，冷卻后，加入500 mL高粱酒、3%食鹽。

1.2.2 一定濃度酵母菌、功能乳酸菌菌懸液的制備

用移液槍吸取200 μL冷凍功能乳酸菌、酵母菌菌體液分別加于MRS、YPD平板中，涂抹均勻。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，功能乳酸菌在37 ℃培養(yǎng)48 h，酵母菌在30 ℃培養(yǎng)24 h，從斜面培養(yǎng)基中，挑取單一菌落加入液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，功能乳酸菌置于37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)48 h，酵母菌置于30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h,取50 mL擴培后培養(yǎng)基于50 mL離心管中，2000 r/min離心15 min，得到菌泥，加入25 mL生理鹽水洗滌，離心(2000 r/min， 15 min)，重復2～3次，得到菌泥，用滅菌生理鹽水將其稀釋至0.5 Abs(分光光度計，波長600 nm)。

1.2.3 單菌株發(fā)酵最佳產酸、產酯接種量的確定

將切片后的蘿卜200 g加入密閉的發(fā)酵瓶中，并添加泡菜鹽水450 mL，分別接種1%、3%、5%、7%、9%(菌液體積與蘿卜質量，V/m)的0.5 OD值乳酸菌菌液(酵母菌液)到發(fā)酵瓶中[10]，兩種菌株單獨加入，每個梯度做3個平行試驗，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，每隔24 h檢測泡菜中的乳酸和總酯含量變化，當乳酸和總酯不再改變時，即為發(fā)酵終點，確定最佳菌種接種量。

1.2.4 復配菌劑發(fā)酵泡菜最佳時間的確定

按上述步驟制作泡菜，接種最適濃度的乳酸菌和酵母菌，30 ℃恒溫發(fā)酵，每隔24 h檢測泡菜中乳酸、總酯的含量，當泡菜中乳酸、總酯的含量不再改變時，視為發(fā)酵終點，并記錄時間[11]。

1.2.5 發(fā)酵溫度對泡菜產酸產酯的影響

按上述步驟制作泡菜，接種最適濃度的乳酸菌和酵母菌，分別置于22，25，28，31，34，37 ℃ 6個發(fā)酵溫度條件下，發(fā)酵7 d后，檢測泡菜中乳酸和總酯的含量，并做感官評定，綜合確定最佳發(fā)酵溫度。每個溫度條件做3組平行試驗。

1.2.6 總酸、總酯的測定方法

總酸的檢測參見國標GB/T 12456-2008[12]。

總酯的檢測參見國標GB/T 10345-2007[13]。

1.2.7 感官評價標準

泡菜的感官評價標準表見表1。

表1 泡菜的感官評價標準表Table 1 The sensory evaluation standard table of pickles

2 結果與分析

2.1 功能乳酸菌接種量對泡菜發(fā)酵產酸的研究

由圖1可知，泡菜中的乳酸含量比泡菜汁中的乳酸含量高，功能乳酸菌接種量為1%、3%(V/m)時，泡菜中乳酸的含量隨著接種量增加而上升，乳酸含量分別為0.38，0.43 g/100 g；當接種量達到5%(V/m)時，此時乳酸菌的含量適當且濃度大，乳酸的積累快，乳酸含量高達0.52 g/100 g；當功能乳酸菌接種量為7%、9%(V/m)時，功能乳酸菌濃度已經飽和，乳酸含量不再增加。結合泡菜中乳酸含量變化可以確定，功能乳酸菌的最佳接種量是5%，產酸量最高可以達到0.52 g/100 g。

圖1 不同功能乳酸菌接種量(V/m)條件下乳酸的含量Fig.1 The content of lactic acid under different functional lactic acid bacteria inoculation amount (V/m)

2.2 酵母菌接種量對泡菜發(fā)酵產酯的研究

酵母菌的主要功能是產酯，是形成泡菜特殊風味的主要物質，酵母菌接種量越大，產生的總酯含量越高，隨著酵母菌的接種量達到飽和，單一地繼續(xù)加大酵母菌的接種量不會再對泡菜中總酯的含量有所改變。由圖2可知，酵母菌接種量為1%、3%(V/m)時，泡菜中總酯含量隨著接種量的增加而上升；當接種量達到5%(V/m)時，酵母菌濃度已經飽和[14]，總酯的含量相對較高，達到1.27 g/100 g，繼續(xù)加大酵母菌的接種量對于泡菜總酯含量不會再有影響。結合泡菜汁中的總酯含量變化可以確定酵母菌的最佳接種量為5%(V/m)，最大產酯可以達到1.27 g/100 g。

圖2 不同酵母菌接種量(V/m)條件下泡菜汁中總酯的含量Fig.2 The content of total esters in pickle juice and picklesunder different yeast inoculation amount (V/m)

2.3 不同發(fā)酵時間對泡菜發(fā)酵產酸、產酯的研究

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的增長，泡菜中乳酸含量呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢。發(fā)酵開始的1～3 d，功能乳酸菌含量較少，發(fā)酵緩慢，此時泡菜中乳酸含量為0.22 g/100 g，達到第4天，功能乳酸菌增加到一定數(shù)量，繁殖基數(shù)增大，產酸能力增強，隨著時間的推移，乳酸逐漸積累，pH下降，功能乳酸菌成為優(yōu)勢菌種，抑制其他微生物的生長，繼續(xù)產酸，到第7天時，泡菜中功能乳酸菌達到飽和，功能乳酸菌總量不再改變，乳酸含量不再上升，開始趨于穩(wěn)定。所以功能乳酸菌的最佳發(fā)酵時間為7 d。發(fā)酵到第7天時，乳酸的最高產量可以達到0.61 g/100 g。

圖3 不同發(fā)酵時間的泡菜汁和泡菜中的乳酸含量Fig.3 The content of total acids in pickle juice and pickles at different fermentation time

圖4 不同發(fā)酵時間的泡菜汁和泡菜中的總酯含量Fig.4 The content of total esters in pickle juice and pickles at different fermentation time

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的增長，泡菜中總酯含量呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢。發(fā)酵開始的1～3 d內，酵母菌大量繁殖，產生大量的總酯，此時泡菜中的總酯達0.68 g/100 g，這時酵母菌成為優(yōu)勢菌種，隨著時間的推移，酵母菌的數(shù)量增多，乳酸積累，pH下降，使功能乳酸菌成為優(yōu)勢菌種，酵母菌生長變緩慢，增長速度上相比于之前有所放緩，總酯的總體含量仍在變化中，當發(fā)酵到第7天時，泡菜中的總酯達1.26 g/100 g，此時泡菜中酵母菌含量達到飽和，酵母菌不再生長繁殖，總酯含量也不再上升，趨于穩(wěn)定，所以酵母菌的最佳發(fā)酵時間為7 d。發(fā)酵到第7天時，總酯的含量可以達到1.26 g/100 g。

2.4 不同發(fā)酵溫度對泡菜產酸、產酯的影響

由圖5和圖6可知，在溫度單因素實驗中，從22 ℃開始，泡菜中乳酸、總酯的含量隨著溫度的上升而明顯增加，說明隨著溫度的升高，功能乳酸菌和酵母菌的生長、發(fā)酵速度在加快；當溫度達到28 ℃時，泡菜中乳酸、總酯含量最大，乳酸含量為0.56 g/100 g，總酯含量為1.76 g/100 g；當溫度超過28 ℃后，乳酸、總酯的含量開始下降。結合之前功能乳酸菌接種量、酵母菌接種量、發(fā)酵時間的單因素實驗，可以判斷泡菜發(fā)酵溫度在28 ℃時最佳。泡菜中總酯的最高產量可以達到1.76 g/100 g，乳酸的最高產量可以達到0.56 g/100 g。

圖5 不同發(fā)酵溫度條件下乳酸的含量Fig.5 The content of lactic acid at different fermentation temperatures

圖6 不同發(fā)酵溫度條件下總酯的含量Fig.6 The content of total esters at different fermentation temperatures

2.5 最適發(fā)酵條件下泡菜的感官評價得分

由表2可知，在泡菜發(fā)酵過程中添加5%(V/m)、OD值為0.5的功能乳酸菌和酵母菌菌懸液，在28 ℃條件發(fā)酵7 d后，得到的泡菜色澤鮮艷、香味濃郁、味道咸酸、酸度適中、口感脆嫩。

表2 泡菜感官評價表Table 2 The sensory evaluation of pickles

續(xù) 表

3 結論

本研究通過接種不同濃度梯度的功能乳酸菌、酵母菌，研究泡菜發(fā)酵過程中乳酸、總酯的含量及其變化情況，并在最適接種量下，探究功能乳酸菌、酵母菌的最適產酸、產酯溫度。結果表明，在泡菜發(fā)酵過程中功能乳酸菌、酵母菌的最佳接種量為5%(V/m)，OD值為0.5，最佳發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵7 d。此時泡菜中的乳酸和總酯含量最高，乳酸的含量最高可達0.56 g/100 g，總酯的含量最高可達1.76 g/100 g。此研究為提升泡菜品質，縮短泡菜發(fā)酵周期，促進泡菜工業(yè)化、標準化純種發(fā)酵生產奠定了基礎。