寧顯會(huì) 盧涵宇 蔣懷禮 翟長(zhǎng)文 王勝資 王德輝

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200031；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200032；3.復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院病理科 上海 200031；4.復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院放療科 上海 200031)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是起源于鼻咽部黏膜上皮的惡性腫瘤。放射治療(簡(jiǎn)稱放療)是鼻咽癌的主要治療方法。特別是調(diào)強(qiáng)放療的應(yīng)用，明顯改善了患者的預(yù)后。但是由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的放療敏感度，即存在放療抵抗[1]。由于放療抵抗引起的腫瘤殘留、局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移成為鼻咽癌患者治療失敗的主要原因[1]。因此找尋有價(jià)值的生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)鼻咽癌的放療敏感度，提高鼻咽癌患者的生存預(yù)后至關(guān)重要。NOX4是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)家族成員之一。NOX4在多種人類腫瘤中表達(dá)，與腫瘤發(fā)生，癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲，DNA損傷，抗凋亡，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，化療耐藥等密切相關(guān)[2]。此外，NOX4還可能抑制腫瘤對(duì)放療的敏感度，造成腫瘤對(duì)放療的抵抗[3]。然而NOX4在鼻咽癌中的作用尚不清楚。本文通過(guò)檢測(cè)鼻咽癌組織和正常鼻咽部黏膜組織中NOX4的表達(dá)，分析NOX4與鼻咽癌患者臨床病理學(xué)特征、放療敏感度和生存預(yù)后的關(guān)系，旨在探討NOX4在鼻咽癌中的表達(dá)和臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病例收集 收集2012年1～6月在復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院確診的鼻咽癌患者97例，其中男性74例、女性23例；中位年齡54歲(范圍8～80歲)。所有患者均經(jīng)過(guò)病理活檢證實(shí)為鼻咽癌，均為初發(fā)鼻咽癌，腫瘤無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，確診前未經(jīng)過(guò)任何抗腫瘤治療。收集病理證實(shí)為正常鼻咽部黏膜組織20例。另外，收集2010～2018年確診的同一患者的初發(fā)和復(fù)發(fā)鼻咽癌組織22對(duì)。所有鼻咽癌組織標(biāo)本均來(lái)源于復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院病理科存檔蠟塊。病例收集和蠟塊用途經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，相關(guān)操作按倫理委員會(huì)章程進(jìn)行。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 以磷酸鹽緩沖液代替一抗為空白對(duì)照，正常腎臟組織切片為陽(yáng)性對(duì)照。NOX4蛋白著色于細(xì)胞核。染色強(qiáng)度：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比：陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比≥3分為免疫反應(yīng)陽(yáng)性。乘積范圍：0～12分，判定0～2分(-)，3～5分 (+)，6～ 8分 (++)，9～ 12分 (+++)，(+++)判定為NOX4高表達(dá)[4-6]。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判定由2名病理科主治醫(yī)師完成，2名病理科主治醫(yī)生對(duì)患者的臨床信息不知曉。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 鼻咽癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn) 采用美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)2010年鼻咽癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.3.2 鼻咽癌放療敏感與抵抗 放療敏感定義為根治性放療后3個(gè)月原發(fā)病灶和淋巴結(jié)無(wú)殘留，2年內(nèi)無(wú)原發(fā)灶和頸部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)；放療抵抗定義為根治性放療后3個(gè)月原發(fā)病灶和(或)淋巴結(jié)有殘留，2年內(nèi)有原發(fā)灶和(或)頸部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分類資料組間比較用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。單因素及多因素分析采用logistic二元和多元回歸。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，以Log-Rank法進(jìn)行組間比較，生存多因素采用Cox回歸分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理資料分析 所有患者均接受調(diào)強(qiáng)放射治療，總放療劑量為65.3～70.8 Gy，中位放療劑量為67.5 Gy。97例患者中，12例(12.4%)為單純放療，85例(87.6%)合并化療，12例(12.4%)合并靶向治療?；煼桨福赫T導(dǎo)化療±同步化療或輔助化療。誘導(dǎo)或輔助化療方案：TPF[多西他賽70 mg·m-2·d-1(D1)+ 順鉑 20 ～ 25 mg·m-2·d-1(D1 ～ 3)+5-氟尿嘧啶 500 mg·m-2/·d-1(D1 ～ 4)]或 PF 方案 [順鉑 20 ～25 mg·m-2·d-1(D1 ～ 3)+5-氟尿嘧啶500 mg·m-2·d-1(D1～ 4)]。同步化療方案 [順鉑 20～ 25 mg·m-2·d-1(D1～3)]。靶向治療方案：泰欣生200 mg/周，6～8次。自患者放療結(jié)束開始隨訪，截至2018年12月31日，中位隨訪時(shí)間78個(gè)月(7～81個(gè)月)。至放療結(jié)束后3個(gè)月，32例(33%)患者存在腫瘤殘留，其中18例(56.3%)為原發(fā)灶殘留，14例(43.8%)為淋巴結(jié)殘留。至隨訪時(shí)間結(jié)束，復(fù)發(fā)11例(11.3%)，9例為原發(fā)灶復(fù)發(fā)，2例為頸部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)，放療結(jié)束至復(fù)發(fā)中位時(shí)間24個(gè)月(12～59個(gè)月)。發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移20例(20.6%)，放療結(jié)束至發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的中位時(shí)間為17個(gè)月(2～55個(gè)月)。死亡28例(28.9%)，放療結(jié)束至死亡的中位時(shí)間為29個(gè)月(7～81個(gè)月)。

2.2 NOX4與鼻咽癌患者臨床病理特征的相關(guān)性免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示NOX4主要定位于細(xì)胞核。NOX4的表達(dá)情況見圖1。NOX4在鼻咽癌組織中的表達(dá)高于正常鼻咽部黏膜組織(P=0.008)。NOX4與鼻咽癌患者臨床病理特征的相關(guān)性見表1，結(jié)果顯示臨床分期(P=0.003)和復(fù)發(fā)(P=0.007)與NOX4的表達(dá)相關(guān)，而性別、年齡、吸煙史、病理類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與NOX4表達(dá)無(wú)關(guān)(P＞0.05)。

圖1 鼻咽癌和正常鼻咽部黏膜組織中NOX4的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ×200) A.鼻咽癌組織中NOX4高表達(dá)；B.鼻咽癌組織中NOX4低表達(dá)；C.正常鼻咽部黏膜組織中NOX4低表達(dá)。

表1 NOX4與鼻咽癌患者臨床病理特征、放療敏感度的相關(guān)性

2.3 NOX4與鼻咽癌患者放療敏感度的相關(guān)性 根據(jù)腫瘤對(duì)放療的敏感度，將97例鼻咽癌患者分為放療敏感組60例和放療抵抗組37例。結(jié)果顯示放療抵抗組NOX4表達(dá)高于放療敏感組(P＜0.001；表1)。logistic 回歸單因素和多因素分析顯示NOX4與放療敏感度有關(guān)(P＜0.001)，表明NOX4是鼻咽癌放療敏感度的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

2.4 NOX4與鼻咽癌患者生存預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier法繪制生存曲線，結(jié)果顯示NOX4低表達(dá)的鼻咽癌患者生存明顯好于NOX4高表達(dá)的 患 者 (P＜0.001； 圖2)。Cox 回歸分析顯示NOX4(P=0.023)、年齡 (P=0.012)、復(fù)發(fā) (P=0.001)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P＜0.001)與生存有關(guān)，而性別(P=0.673)、吸煙(P=0.617)、病理類型(P=0.138)、放療次數(shù)(P=0.269)、化療(P=0.603)、靶向治療(P=0.08)、臨床分期(P=0.439)與生存無(wú)關(guān)。表明NOX4是鼻咽癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

圖2 NOX4與鼻咽癌患者生存時(shí)間的關(guān)系

2.5 同一患者初發(fā)和復(fù)發(fā)鼻咽癌組織中NOX4的表達(dá) 檢測(cè)同一患者初發(fā)和復(fù)發(fā)鼻咽癌組織中NOX4的表達(dá)情況。結(jié)果顯示復(fù)發(fā)鼻咽癌組織中NOX4表達(dá)高于初發(fā)鼻咽癌組織(P=0.002)。

3 討論

放療是鼻咽癌的主要治療方法。雖然放療技術(shù)的進(jìn)步明顯改善了患者的預(yù)后，但仍然有10%～30%的鼻咽癌患者在放療后出現(xiàn)腫瘤殘留和復(fù)發(fā)[9]，是鼻咽癌治療失敗的主要原因。由于殘留和復(fù)發(fā)，患者5年生存率僅為12.4%～27%[10]。根治性放療后局部殘留率為7%～13%[11]，局部復(fù)發(fā)率為8.4%～23%[12]。本研究中，97例鼻咽癌患者根治性放療后3個(gè)月殘留率為33%(32例)，高于文獻(xiàn)報(bào)道，可能與腫瘤分期較晚(32例患者中 、期占94%)有關(guān)。至隨訪時(shí)間結(jié)束，局部復(fù)發(fā)率為11.3%，9例為原發(fā)灶復(fù)發(fā)，2例為頸部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)中位時(shí)間為24個(gè)月。另外，本研究發(fā)現(xiàn)根治性放療后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率為20.6%，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的中位時(shí)間為17個(gè)月，與文獻(xiàn)報(bào)道的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率20%[13]基本一致。鼻咽癌放療后腫瘤殘留、復(fù)發(fā)的主要原因與腫瘤缺乏放療敏感度有關(guān)。因此，找尋一種能夠預(yù)測(cè)鼻咽癌放療敏感度的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

NOX4是NADPH氧化酶(NOX)家族成員，在多種人類腫瘤中表達(dá)，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腎癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、甲狀腺癌等[14]。有研究[15]表明，NOX4在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，并與患者的臨床分期、不良預(yù)后高度相關(guān)。 NOX4過(guò)表達(dá)是口腔鱗狀細(xì)胞癌患者接受手術(shù)切除后預(yù)后較差的因素[16]。然而NOX4在鼻咽癌中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)NOX4在鼻咽癌組織中高表達(dá)，并與鼻咽癌患者的臨床分期、復(fù)發(fā)和不良預(yù)后有關(guān)。這與在其他腫瘤中的發(fā)現(xiàn)一致。

有研究[3]表明，NOX4能夠抑制腫瘤對(duì)放療的敏感度，造成腫瘤對(duì)放療抵抗。NOX4的下調(diào)可以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、侵襲及腫瘤相關(guān)血管生成，提高其體外放射敏感度[14]。使用NOX4抑制劑處理人類腎癌細(xì)胞可使細(xì)胞對(duì)放療敏感[2]。NOX4的表達(dá)與鼻咽癌放療敏感度的關(guān)系尚未見報(bào)道。文獻(xiàn)中對(duì)于鼻咽癌放療敏感和抵抗的定義并不統(tǒng)一。本研究采用Wu等[8]定義的標(biāo)準(zhǔn)：即根治性放療后3個(gè)月復(fù)查，原發(fā)病灶和淋巴結(jié)無(wú)殘留以及2年內(nèi)無(wú)原發(fā)灶和頸部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)定義為放療敏感；而根治性放療后3個(gè)月復(fù)查原發(fā)病灶和(或)淋巴結(jié)有殘留以及2年內(nèi)有原發(fā)灶和(或)頸部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)定義為放療抵抗。根據(jù)放療敏感和抵抗的定義，將97例鼻咽癌患者分為放療敏感組60例和放療抵抗組37例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放療抵抗組NOX4表達(dá)高于放療敏感組。logistic 回歸單因素、多因素分析表明NOX4是鼻咽癌放療敏感度的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，提示靶向抑制NOX4有望提高鼻咽癌患者對(duì)放療的敏感度。

由于腫瘤細(xì)胞缺乏對(duì)放療的敏感度，在放療結(jié)束后，雖然組織學(xué)上無(wú)法檢測(cè)到腫瘤，但一些微小病灶仍保留在原發(fā)部位，它們?cè)谏砩咸幱谛菝郀顟B(tài)，這些惰性細(xì)胞有可能因?yàn)橥蛔儷@得新的致病力，是放療后腫瘤復(fù)發(fā)的原因[17]。例如p16、fibulin-5、FLJ10540等基因的突變與鼻咽癌放療后復(fù)發(fā)有關(guān)[18-20]。本研究收集2010～2018年在復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院確診的同一患者初發(fā)和復(fù)發(fā)鼻咽癌組織共22對(duì)，檢測(cè)同一患者初發(fā)和復(fù)發(fā)鼻咽癌組織中NOX4的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)同一患者復(fù)發(fā)后NOX4表達(dá)更高，進(jìn)一步提示NOX4在鼻咽癌復(fù)發(fā)中起到作用。可能是因?yàn)镹OX4降低了鼻咽癌放療的敏感度，造成一些“微小病灶”的逃逸，導(dǎo)致了腫瘤的復(fù)發(fā)。然而在放療過(guò)程中，基因突變和NOX4表達(dá)變化的機(jī)制仍需后續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，NOX4在人類鼻咽癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤放療敏感度、復(fù)發(fā)及生存預(yù)后相關(guān)。因此，靶向抑制NOX4有望提高鼻咽癌患者對(duì)放療的敏感度，進(jìn)而減少放療后腫瘤殘留和復(fù)發(fā)，改善鼻咽癌患者的生存預(yù)后。