榮玉萍 唐彬 李鵬 章潔瓊 陳慶富 朱麗偉 鄧嬌 黃娟

（1. 貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴陽(yáng) 550001；2. 貴州省農(nóng)作物技術(shù)推廣總站，貴陽(yáng) 550001）

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中受環(huán)境因素的影響較大［1］。這些環(huán)境因素包括生物脅迫（如病蟲(chóng)害）和非生物脅迫（如干旱、低溫、鹽脅迫、水澇、機(jī)械損傷）。轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫過(guò)程中具有重要作用［2］。其中，NAC（NAM/ATAF/CUC）是植物特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是植物中數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［3］，其N端含有約150個(gè)氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域，由A、B、C、D、E 5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成，其中A、C、D高度保守，B、E較為多變；NAC轉(zhuǎn)錄因子C端為高度變異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)對(duì)生物及非生物脅迫具有重要作用［4］。根據(jù)NAC轉(zhuǎn)錄因子中保守的NAM結(jié)構(gòu)，可將植物中NAC轉(zhuǎn)錄因 子 分 為ONAC4、ANAC034、SNAC、TIP、SND、NAM/CUC3六大類，同一大類的NAC基因具有相近的功能［5］，其中，響應(yīng)非生物脅迫的NAC基因都?xì)w屬于SNAC大類。干旱、低溫和鹽脅迫是較為普遍的非生物脅迫。干旱對(duì)于植物生長(zhǎng)的影響顯著，尤其葉片面積和葉片數(shù)量都會(huì)顯著減少［6］。過(guò)表達(dá)OsNAC52增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱脅迫的耐受性［7］。低溫可引起細(xì)胞膜凍結(jié)，并通過(guò)滲透、氧化和其他脅迫抑制植物的生長(zhǎng)，造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和質(zhì)量［8-9］。鹽脅迫除了引起植物失水，還會(huì)引起植物內(nèi)蛋白質(zhì)和脂類破壞和水解，導(dǎo)致代謝紊亂，甚至引起植物體死亡。此外，鹽脅迫下活性氧的過(guò)度積累加速了植物萎蔫［10］。過(guò)表達(dá)LpNAC13的轉(zhuǎn)基因煙草具有較強(qiáng)的耐鹽性［11］。蕎麥屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum），是一年生草本雙子葉植物［12］，其栽培種有甜蕎（F.esculentum）和苦蕎（F.tataricum）兩種?？嗍w作為一種藥食同源的作物，不僅富含蛋白質(zhì)、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有膳食纖維、維生素等微量物質(zhì)以及黃酮類化合物、多酚類化合物等活性成分，具有降三高、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等功效［13］。除此之外，苦蕎還具有耐瘠薄的特性［14］。因此，通過(guò)分析苦蕎NAC基因在干旱、低溫、鹽和激素脅迫下的響應(yīng)情況，進(jìn)而明確其響應(yīng)非生物脅迫機(jī)制。這對(duì)于挖掘優(yōu)異基因具有重要意義。

目前，對(duì)苦蕎的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)保健和食品加工方面，在分子生物學(xué)方面的研究尚處于起步階段。在分子方面的研究主要集中在黃酮類化合物的合成及代謝途徑中關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)錄因子的研究［15］。隨著苦蕎基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建［16］，NAC家族轉(zhuǎn)錄因子在苦蕎全基因組水平上得到分析和鑒定［17-18］。且對(duì)苦蕎FtNAC15進(jìn)行了系統(tǒng)性分析，結(jié)果表明，F(xiàn)tNAC15參與種子發(fā)育及響應(yīng)干旱脅迫［19］。Deng等［20］通過(guò)對(duì)苦蕎的8個(gè)與脅迫相關(guān)NAC基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，所有的FtNAC基因?qū)σ粋€(gè)或多個(gè)處理都有反應(yīng)，其中FtNAC4和FtNAC7在鹽、干旱、脫落酸和水楊酸處理后上調(diào)超過(guò)20倍。

雖然有部分的NAC轉(zhuǎn)錄因子在苦蕎中的研究有了初步的結(jié)果，但大部分NAC轉(zhuǎn)錄因子具體功能尚不清晰。本研究根據(jù)已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挑選并克隆了一個(gè)NAC家族基因，命名為FtNAC17，對(duì)其編碼區(qū)序列、氨基酸序列等進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及其對(duì)干旱、低溫、鹽和激素脅迫的響應(yīng)進(jìn)行分析，為闡明基因功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽法將苦蕎（貴米苦11號(hào)）種子培養(yǎng)14 d，待長(zhǎng)出一片真葉后，進(jìn)行6種處理。選飽滿一致的種子36粒，按照6行6列的方式整齊地?cái)[放到鋪有濾紙的發(fā)芽盒（12 cm×12 cm×6 cm）內(nèi)，25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（光照16 h/黑暗8 h）至長(zhǎng)出一片真葉后進(jìn)行統(tǒng)一處理。

干旱處理：采用20%聚乙二醇（PEG-6000）溶液處理［21］。低溫處理：將培養(yǎng)后的幼苗在4℃處理［22］。鹽處理：用3 mg/L NaCl處理幼苗［23］。激素處理：激素處理又分為3種，分別為22.43 mg/L茉莉酸甲酯處理［24］、20 mg/L脫落酸處理［25］和150 mg/L赤霉素處理［26］。分別在處理后0、3、6、12和24 h取整株幼苗，液氮速凍后立即-80℃保存，以備提取RNA。每種處理設(shè)置2組生物學(xué)重復(fù)。

另取苦蕎幼苗用于DNA的提取，采樣地點(diǎn)為貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)中心百宜基地。將采集的樣品置于液氮中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測(cè) 苦蕎總DNA的提取用改良的CTAB法。將大約0.1 g苦蕎幼苗于研缽中加入液氮充分研磨后轉(zhuǎn)入離心管中，加入1000 μL CTAB提取液混合均勻，65℃水浴30 min。離心取上清，加入800 μL氯仿/異戊醇抽提。離心取上清，加入500 μL預(yù)冷的異丙醇，混合均勻。離心去上清，加入500 μL預(yù)冷的無(wú)水乙醇清洗沉淀2次。離心后晾干乙醇溶液，溶于100 μL ddH2O中。將提取的DNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，質(zhì)量合格后用于下一步的克隆。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 利用天根生化科技（北京）有限公司的植物總RNA提取試劑盒提取處理樣品中總RNA。取1 μg RNA用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 苦蕎FtNAC17的克隆 根據(jù)苦蕎基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中苦蕎基因組序列及預(yù)測(cè)的編碼區(qū)序列，利用Oligo7引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物擴(kuò)增苦蕎NAC17序列（FtNAC17F：5'-AAATGTCGTCGGAAGACTTGCA-3'，F(xiàn)tNAC17R：5'-CTAGCTCAGATACATGAACATATCC-3'），于生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。以苦蕎DNA和cDNA為模板，F(xiàn)tNAC17F和FtNAC17R為引物，利用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司的熱啟動(dòng)型TaKaRa Ex Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為DNA或cDNA 2 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mixture 4 μL、上下游引物各2 μL、Taq DNA聚合酶0.25 μL和ddH2O 34.75 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?8℃ 3 min；98℃ 10 s，42℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上檢測(cè)，片段大小正確后利用天根生化科技（北京）有限公司的DNA膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收?；厥债a(chǎn)物連接于天根生化科技（北京）有限公司的pGM-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP 10感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性單克隆，經(jīng)菌液PCR鑒定后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 苦蕎FtNAC17的生物信息學(xué)分析 將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對(duì)FtNAC17的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。用DNAMAN軟件分析其開(kāi)放閱讀框，預(yù)測(cè)其編碼的氨基酸序列；利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域。利用EXPASY（https：//web.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。利用PSORT Ⅱ Prediction（https：//psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl）軟件預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位。使用GOR IV SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用BLASTP將蛋白序列與NCBI非冗余蛋白庫(kù)（NR）進(jìn)行比對(duì)，然后利用BankIt（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/）將FtNAC17序列提交到GenBank。利用DNAMAN將與FtNAC17同源的NAC蛋白進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，使用鄰接法，設(shè)置重復(fù)次數(shù)（bootstrap）為1000次。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用Primer 6設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物qNAC17-F：5'-GAATCGGTGCCACGGTGTCA-3'和qNAC17-R：5'-ACCTTGTGCAGACGGCTGATTA-3'。將1.2.2中合成的cDNA稀釋10倍為模板，以Actin作為內(nèi)參基因，以qNAC17-F和qNAC17-R作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司的TB Green Premix Ex Taq II進(jìn)行熒光定量PCR［27］。反應(yīng)體系為cDNA 2 μL、TB Green Premix Ex Taq II 10 μL、上下游引物各0.8 μL和ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30 s；95℃ 5 s，55℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。2次生物學(xué)重復(fù)，2次技術(shù)重復(fù)。采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的處理。

2 結(jié)果

2.1 苦蕎FtNAC17的克隆

以苦蕎DNA和cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小約為1000 bp的序列（圖1）。經(jīng)測(cè)序，該片段大小為903 bp。利用GSDS分析基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，在該基因中存在2個(gè)外顯子（1-438 bp和523-903 bp），其中包含一個(gè)內(nèi)含子（439-522 bp）（圖2）。將該基因命名為FtNAC17，GenBank登錄號(hào)為MT641452。

圖1 苦蕎FtNAC17的擴(kuò)增

圖2 FtNAC17的結(jié)構(gòu)

2.2 苦蕎FtNAC17蛋白生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN對(duì)該序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其含有819 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼272個(gè)氨基酸（圖3）。利用SMART分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，顯示在其9-132位氨基酸序列是NAC蛋白特有的NAM結(jié)構(gòu)域，其E-value值為1.5e-37，說(shuō)明其屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子。利用EXPASY預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，F(xiàn)tNAC17蛋白的分子質(zhì)量為30.77 kD，等電點(diǎn)為7.05，疏水性平均值為-0.584，推測(cè)該蛋白可能為親水性蛋白（表1）。利用PSORT Ⅱ Prediction對(duì)FtNAC17蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果表明FtNAC17蛋白有45%的可能性在細(xì)胞質(zhì)中（表2）。綜上所述，F(xiàn)tNAC17蛋白很可能存在于細(xì)胞質(zhì)中。

圖3 FtNAC17的核酸及其編碼的氨基酸序列

表1 FtNAC17蛋白的理化性質(zhì)

表2 FtNAC17蛋白亞細(xì)胞定位

利用GOR IV SECONDARY STRUCTURE PRE-DI CTION METHOD對(duì)FtNAC17蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明FtNAC17蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋有32個(gè)氨基酸，占序列的11.76%；β-折疊有70個(gè)氨基酸，占序列的25.74%；無(wú)規(guī)則卷曲有170個(gè)氨基酸，占序列的62.5%（圖4）。上述數(shù)據(jù)表明FtNAC17蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，β-折疊其次，α-螺旋數(shù)量最少。

2.3 FtNAC17蛋白同源進(jìn)化分析

將FtNAC17序列與擬南芥TAIR11蛋白庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因與擬南芥中SNAC類中ANAC002最為相近。為推測(cè)FtNAC17的功能，從植物NAC轉(zhuǎn)錄因子家族6大類中挑選具代表性的蛋白，分別為ONAC4、ANAC034、ANAC002（SNAC）、ANAC078（TIP）、ANAC012（SND）、NAM/CUC3（ANAC018、ANAC031）。將FtNAC17與這7條蛋白NAM保守結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果表明，NAC蛋白N端的氨基酸序列較為保守，由A、B、C、D、E 5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成（圖5）。將以上氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，F(xiàn)tNAC17與擬南芥ANAC002（ATAF1）親緣關(guān)系最近（圖6）。

2.4 FtNAC17的表達(dá)分析

為揭示FtNAC17響應(yīng)干旱、低溫、鹽和激素脅迫情況，采用熒光定量PCR方法來(lái)探究FtNAC17在干旱、低溫、鹽、茉莉酸甲酯、脫落酸和赤霉素處理苦蕎幼苗0、3、6、12和24 h的表達(dá)模式（圖7）。結(jié)果表明，6種非生物脅迫均有顯著影響（P＜0.05）。尤其是赤霉素處理下，F(xiàn)tNAC17的表達(dá)水平最高（達(dá)10.27倍）。

圖4 FtNAC17蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 NAM保守結(jié)構(gòu)域氨基酸多重序列比對(duì)

圖6 FtNAC17與6類NAC蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

干旱處理后，F(xiàn)tNAC17的表達(dá)量呈波浪型變化。推測(cè)在響應(yīng)干旱脅迫時(shí)，F(xiàn)tNAC17可能與多個(gè)基因協(xié)同響應(yīng)該脅迫。低溫處理后，F(xiàn)tNAC17的表達(dá)量上調(diào)。鹽脅迫處理后，F(xiàn)tNAC17顯著上調(diào)表達(dá)。茉莉酸甲酯處理后，F(xiàn)tNAC17呈上調(diào)表達(dá)。脫落酸處理后，F(xiàn)tNAC17呈顯著上調(diào)表達(dá)。赤霉素處理后，F(xiàn)tNAC17呈顯著上調(diào)表達(dá)。

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要調(diào)控的作用，分析鑒定相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，并揭示其分子機(jī)制一直是分子生物學(xué)領(lǐng)域的焦點(diǎn)。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特異的轉(zhuǎn)錄因子，也是植物中數(shù)量最大的轉(zhuǎn)錄因子，所以研究其家族成員的結(jié)構(gòu)與功能具有重要意義。本研究鑒定了苦蕎FtNAC17，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。通過(guò)對(duì)FtNAC17編碼的蛋白分析可知，該蛋白為親水蛋白，與王洋等［28］結(jié)果一致。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是其整個(gè)空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程的早期形成，為蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成奠定基礎(chǔ)，對(duì)亞細(xì)胞定位有一定作用。預(yù)測(cè)FtNAC17蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，無(wú)規(guī)卷曲在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中占據(jù)最大比例，使蛋白質(zhì)構(gòu)型多樣化，這一點(diǎn)與黎幫勇等［29］研究結(jié)果相一致。根據(jù)NAC轉(zhuǎn)錄因子保守NAM結(jié)構(gòu)域，可將植物中NAC轉(zhuǎn)錄因子分為6個(gè)大類，同一大類的NAC基因具有相近的功能，其中響應(yīng)非生物脅迫的NAC基因都?xì)w屬于SNAC大類。本文克隆的FtNAC17，經(jīng)與擬南芥TAIR蛋白庫(kù)比對(duì)，與擬南芥中SNAC類中ANAC002（ATAF1）最為相近。過(guò)表達(dá)ANAC002（ATAF1）的植物敏感性增強(qiáng)，表明ANAC002（ATAF1）響應(yīng)病原和非生物脅迫有關(guān)［30］。因此，推測(cè)親緣關(guān)系較近的FtNAC17參與響應(yīng)非生物脅迫。通過(guò)研究干旱、低溫、鹽和激素等非生物脅迫下FtNAC17的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)Ω珊?、低溫、鹽、茉莉酸甲酯、脫落酸和赤霉素脅迫處理均有不同程度的響應(yīng)，這表明FtNAC17確實(shí)參與響應(yīng)非生物脅迫。干旱處理時(shí)，F(xiàn)tNAC17的表達(dá)量呈先到達(dá)峰值后下降后再上升的一個(gè)趨勢(shì)，推測(cè)該基因在響應(yīng)這些脅迫時(shí)并非獨(dú)自發(fā)揮作用，很可能與其他基因共同發(fā)揮作用。目前，本研究?jī)H就單一脅迫影響FtNAC17表達(dá)進(jìn)行研究，未在多脅迫層面上研究該基因的響應(yīng)情況。因此，后續(xù)可以將FtNAC17響應(yīng)多脅迫情況進(jìn)行量化，更深層次的挖掘FtNAC17的功能。

圖7 FtNAC17在不同脅迫下的表達(dá)情況

4 結(jié)論

初步明確FtNAC17參與應(yīng)對(duì)部分非生物脅迫反應(yīng)。并且FtNAC17可能通過(guò)ABA和MeJA信號(hào)通路響應(yīng)非生物脅迫。