劉曉麗 鐘青燕 羅世強(qiáng) 王秋華 許澤輝 覃柳群 王敬仁 陳麗竹 唐 寧

(廣西柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科，柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，柳州市 545001，電子郵箱：1027609273@qq.com)

臨床上，在遺傳病產(chǎn)前診斷時，有時在穿刺過程中羊水和絨毛標(biāo)本可混有母親血液成分，從而使產(chǎn)前診斷樣本受到母血污染，即母源成分污染，導(dǎo)致產(chǎn)前診斷結(jié)果不準(zhǔn)確而引發(fā)嚴(yán)重后果[1]。21-三體綜合征和性染色體多倍體綜合征分別是臨床上最常見的常染色體疾病和性染色體疾病。目前，細(xì)胞核型分析是診斷染色體病的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法煩瑣、檢測周期長[2]，因此建立準(zhǔn)確、快速的產(chǎn)前診斷技術(shù)已勢在必行。短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats,STR)是目前理想的遺傳標(biāo)記。有學(xué)者針對200名韓國人染色體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在該人群的21號染色體上STR基因座D21S1435、D21S1411和D21S1412具有較高的異質(zhì)性和多態(tài)性[3]。而在中國東南地區(qū)漢族人群中21號染色體上的11個STR位點(diǎn)均表現(xiàn)出較高的多態(tài)性和異質(zhì)性，其中D21S1412、D21S1270、D21S11和D21S1442的異質(zhì)性相對較高[4-5]。目前 DXS1053、DXS981、DXS6809、DXS1187、DXS8377和X22等位點(diǎn)的檢測已被運(yùn)用于性染色體非整倍性的快速診斷中[6]。本文選取性染色體上DXS6809、DXS981、X22和21號染色體上D21S1435、D21S11、D21S1411及AMXY基因作為個體識別標(biāo)志,采用PCR-STR復(fù)合擴(kuò)增檢測技術(shù)，探討這些特異性STR位點(diǎn)檢測用于遺傳病產(chǎn)前診斷及判斷地中海貧血產(chǎn)前診斷樣本是否存在母源成分污染的可行性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2019年10月在柳州市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診，存在生育中、重型地中海貧血胎兒風(fēng)險的3 587例孕婦作為研究對象。其中孕婦年齡19～42(31.0±4.2)歲，接受產(chǎn)前診斷時的孕周為12+1～22+5周。所有研究對象均自愿接受地中海貧血基因產(chǎn)前診斷檢測。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本采集：遵循無菌操作原則，在超聲儀定位及引導(dǎo)下對1 614例孕12～14周的孕婦行絨毛組織的采樣，置于兩支無菌的離心管中；對1 973例孕16～22周的孕婦(孕15周孕婦均等到孕16周后進(jìn)行羊膜腔穿刺)進(jìn)行羊膜腔穿刺，抽取羊水20 mL，置于兩支無菌的離心管中。利用真空負(fù)壓法，抽取所有孕婦的外周靜脈血3～5 mL，置于含乙二胺回乙酸抗凝管。

1.2.2 DNA提?。翰捎梅勇确路╗7]提取適量的絨毛或羊水細(xì)胞的DNA，Lad-Aid 820自動核酸提取儀(廈門致善生物科技股份有限公司 )提取孕婦全血基因組DNA。采用ASP-2680核酸分析儀(美國ACTGene公司)檢測DNA濃度純度，待檢基因組DNA的濃度在2～200 ng/μL之間，純度(A260/A280)在1.7～2.0之間。

1.2.3 STR位點(diǎn)檢測：利用熒光PCR毛細(xì)管電泳法檢測21號染色體及性染色體上特異性STR位點(diǎn)(D21S1435、D21S11、D21S1411、DXS6809、DXS981、X22)和一個性別基因(AMXY)。(1)擴(kuò)增特定的DNA片段。取羊水或絨毛以及孕婦外周血的基因組DNA，采用21-三體綜合征和性染色體多倍體檢測試劑盒(中山達(dá)安基因公司，批號：2019003)進(jìn)行檢測，每次實(shí)驗(yàn)需做1個陰性對照、1個21-三體陽性對照、1個性染色體多倍體陽性對照。各取胎兒及母親DNA 1 μL加入24 μL PCR混合液，PCR混合液組分包括PCR反應(yīng)緩沖液16 μL、引物混合物4 μL、Taq酶0.5 μL和水3.5 μL?；靹蚝笤贏BI 9700 PCR儀(廠家：ABI公司)上擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：93℃預(yù)變性3 min；93℃ 60 s，58℃ 60 s，72℃ 60 s，共26個循環(huán)；最后60℃ 60 min。(2)毛細(xì)管電泳檢測。取PCR產(chǎn)物，95℃變性5 min，冰浴3 min后置于3 500 Dx型遺傳分析儀(美國ABI公司)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，用GeneMapper?ID-X.Ink數(shù)據(jù)收集軟件(美國ABI公司)、GeneMapper?ID-X.Ink基因掃描軟件(美國ABI公司)計算各核苷酸片段的峰高和峰面積等。不同位點(diǎn)熒光峰值面積比值的判斷參照歐盟臨床細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)協(xié)會年會關(guān)于應(yīng)用熒光定量PCR方法診斷非整倍體染色體病的實(shí)驗(yàn)指南[8]。

1.2.4 地中海貧血基因分析：取羊水或絨毛以及孕婦外周血的基因組DNA，采用裂口PCR法檢測缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因，反向斑點(diǎn)雜交法檢測非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因以及β-珠蛋白生成障礙性貧血突變型基因，具體方法步驟詳見試劑盒說明書(深圳益生堂生物企業(yè)有限公司，批號：20190301)。

1.2.5 核型G顯帶分析：取適量的絨毛或羊水標(biāo)本，兩線獨(dú)立無菌接種培養(yǎng)，消化法常規(guī)收獲絨毛或羊水細(xì)胞后行G顯帶分析。每例兩線細(xì)胞共計數(shù)至少20個細(xì)胞中期分裂相，對其中至少6個進(jìn)行核型分析。

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)前診斷樣本母源成分污染情況及地中海貧血檢測結(jié)果 1 973例羊水和1 614例絨毛樣本中共檢測到6例存在母源污染成分，其中3例原標(biāo)本中重新提取DNA，另3例從核型分析留存的羊水貼壁細(xì)胞中重新提取DNA，檢測結(jié)果均提示無母源污染。編號為CR7456的胎兒及其母親(編號M7456)的STR位點(diǎn)檢測結(jié)果顯示，母親的各STR產(chǎn)物長度與胎兒的各STR產(chǎn)物長度一致(如圖1A和圖1B)，即胎兒絨毛有母源成分；在原標(biāo)本中重新提取胎兒絨毛DNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示胎兒的AMXY、DXS6809、DXS981產(chǎn)物長度與母親的AMXY、DXS6809、DXS981產(chǎn)物長度不一致(如圖1C)，即無母源污染。6例母源成分污染羊水或絨毛DNA，以及在原絨毛標(biāo)本或羊水貼壁細(xì)胞中重新提取的DNA的地中海貧血基因檢測結(jié)果見表1。

圖1 母源成分污染結(jié)果圖

表1 6例母源成分污染羊水或絨毛樣本的地中海貧血基因檢測結(jié)果

2.2 STR檢測與染色體核型分析對21-三體的檢出情況 采用特異性STR位點(diǎn)檢測和染色體核型分析技術(shù)對1 973例羊水和1 614例絨毛進(jìn)行檢測，均檢出21-三體胎兒2例(羊水、絨毛標(biāo)本各1例)，兩種方法檢出的結(jié)果一致。

2.3 STR檢測與染色體核型分析對X染色體嵌合體的檢出情況 根據(jù)遺傳定律，胎兒的遺傳物質(zhì)一半來自父親，一半來自母親。1例絨毛樣本的X染色體上的同1個STR位點(diǎn)峰值面積不一致，如圖2A中a區(qū)域藍(lán)色熒光波峰(性別基因AMXY位點(diǎn))只有1條，說明胎兒是女性；其他3個b、c、d區(qū)域藍(lán)色熒光波兩組峰值面積比為1 ∶2或者2 ∶1，即X染色體DXS6809、DXS981、X22位點(diǎn)出現(xiàn)兩個等位基因峰含量不平衡，提示可能存在(45，X)/(46，XX)嵌合體、X三體核型等情況。召回孕婦，抽提羊水進(jìn)行染色體核型分析驗(yàn)證，分析的50個染色體核型中有1個(45，X)，其余核型為(46，XX)。

圖2 (45，X)、(46，XX)嵌合體核型

3 討 論

地中海貧血，又稱珠蛋白合成障礙性貧血，是廣東、廣西、海南、云南、貴州等地區(qū)發(fā)病率最高的一種單基因遺傳病[9]。目前對于地中海貧血的治療主要有定期輸血、干細(xì)胞移植治療，但費(fèi)用昂貴，因此地中海貧血產(chǎn)前診斷是預(yù)防重度和極重度地中海貧血患兒出生的重要手段。在羊膜腔穿刺過程中，穿刺針通過孕婦腹壁層、子宮層及羊膜腔時攜帶微量的孕婦組織；絨毛穿刺時不慎抽到蛻膜組織或在顯微鏡下去除蛻膜不干凈或直接把蛻膜當(dāng)作絨毛[10-11]，這些均可導(dǎo)致所提取出來的DNA部分或全部含有母親的DNA，使得產(chǎn)前診斷的結(jié)果不準(zhǔn)確。本研究通過檢測STR位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了6例地中海貧血產(chǎn)前診斷標(biāo)本存在母體成分污染，其中3例絨毛樣本在原標(biāo)本中重新提取DNA，3例羊水標(biāo)本從羊水貼壁細(xì)胞中提取DNA后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)均提示無母源污染；重新抽提的樣本中，有2例檢測出地中海貧血基因型為--SEA/--SEA，即為水腫胎，及時對孕婦進(jìn)行引產(chǎn)，避免了對孕晚期孕婦的生命造成危害。因此STR位點(diǎn)檢測可以有效地鑒別產(chǎn)前診斷樣本的母源成分，是地中海貧血產(chǎn)前診斷的必要補(bǔ)充。據(jù)了解,目前有些地區(qū)已采用STR位點(diǎn)檢測來排除穿刺造成的母體組織污染[12]。有些地區(qū)采取的措施是丟棄最初2 mL羊水[13]，但并未進(jìn)行STR位點(diǎn)的檢測，因此最初2 mL羊水是否已全部排除母體細(xì)胞還有待考究。

染色體病即染色體異常，主要是染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常而引發(fā)的疾病。臨床上常見的常染色體異常主要有21-三體綜合征(唐氏綜合征)、18-三體綜合征和13-三體綜合征。何薇等[14-15]報告應(yīng)用熒光定量PCR法進(jìn)行產(chǎn)前診斷，即檢測21號染色體STR位點(diǎn),可有效判斷胎兒是否為21-三體，檢出率達(dá)91%以上，且與細(xì)胞核型分析結(jié)果一致。本研究通過PCR-STR法對21-三體進(jìn)行檢測，檢出結(jié)果亦與染色體核型分析結(jié)果一致。但本研究僅對21號染色體和性染色體的STR位點(diǎn)進(jìn)行檢測，后續(xù)將增加13號染色體和18號染色體STR位點(diǎn)的檢測，從而排除臨床上常見的常染色體異常。STR還可以提示性染色體數(shù)目是否異常，從而判斷單親二倍體、性染色體嵌合以及X三體等情況。本研究中，PCR-STR法檢出1例孕婦的絨毛組織(45，X)、(46，XX)嵌合體核型比例與羊水染色體嵌合核型比例不一致，這可能與胚胎發(fā)育過程中發(fā)生的改變有關(guān)。研究表明，絨毛膜主要是由胚外中胚層和滋養(yǎng)層組成，與胎兒組織有同源性；而羊水細(xì)胞為胎兒體表、泌尿道、呼吸道、消化道等脫落的細(xì)胞，來源于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層；在胚胎發(fā)育的過程中，染色體變異可以發(fā)生在不同胚層的分化過程中，如果變異只發(fā)生在外胚層或內(nèi)胚層，就會出現(xiàn)羊水核型與絨毛核型不一致的現(xiàn)象[16-17]。而染色體核型分析如何鑒別真假嵌合體以及判斷嵌合體的風(fēng)險是細(xì)胞遺傳學(xué)工作者面臨的一個問題，同時也是醫(yī)生進(jìn)行遺傳咨詢時難以決定胎兒去留的難題。因此， 應(yīng)嚴(yán)格按照技術(shù)規(guī)范與指南進(jìn)行產(chǎn)前診斷項(xiàng)目的檢測，并采用多種方法相互驗(yàn)證。

產(chǎn)前診斷羊水或絨毛樣本是否存在母體細(xì)胞直接影響產(chǎn)前診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性,母體細(xì)胞污染導(dǎo)致產(chǎn)前診斷結(jié)果的誤診可危害孕婦的生命健康。特異性STR位點(diǎn)檢測可用于鑒別產(chǎn)前診斷樣本是否存在母體細(xì)胞，同時其還可檢測出21-三體及性染色體數(shù)目異常，在快速產(chǎn)前診斷中具有重要的意義。