李 鵬 劉瑛麗 駱 彤 陳 靜 吳 林

(1 山東省濟寧市中醫(yī)院腦病科，濟寧市 272100，電子郵箱：luomi0926@163.com；2山東省濟寧市第四人民醫(yī)院藥劑科，濟寧市 272100；3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧市 530000)

帕金森病是一種常見于中老年人的慢性退行性神經(jīng)系統(tǒng)病變，常以運動癥狀(靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢反射異常)和非運動癥狀(排便困難、失眠、認(rèn)知功能減退、精神障礙)為臨床表現(xiàn)[1-2]。帕金森病的發(fā)病機制較為復(fù)雜，與黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元退變、路易體形成、膽堿能系統(tǒng)功能異常、紋狀體區(qū)多巴胺遞質(zhì)減少有關(guān)[3-6]。目前尚無治療特效藥，臨床多采用多巴胺受體激動劑改善癥狀,但副作用較大[7]。

熟地黃為玄參科植物地黃的根莖，經(jīng)加工蒸曬而成，其味甘，性微溫，具有滋陰補腎的作用。中醫(yī)臨床常將其用于治療陰虛血少、勞嗽骨蒸、消渴、耳鳴以及男科、婦科病癥。現(xiàn)代藥理研究表明，熟地黃含有環(huán)烯醚萜、單萜、糖苷、糖類、氨基酸、微量元素和有機酸等多種化合物，可用于改善微循環(huán)、促進骨髓造血、抑制腫瘤因子的表達(dá)、抗感染、增強免疫等[8]。一項數(shù)據(jù)挖掘研究結(jié)果顯示，我國名中醫(yī)裘昌林?jǐn)M定的用于治療帕金森病的305首方劑中，熟地黃的使用頻數(shù)共23次，僅次于天麻、鉤藤、木瓜、萸肉，其中熟地黃-萸肉藥對頻次大于50次[9]。在中醫(yī)傳承輔助平臺進行檢索，108首治療帕金森病的方劑中，使用頻次前三的中藥從高到低依次為白芍、天麻、熟地黃，熟地黃-白芍、熟地黃-天麻、熟地黃-鉤藤、熟地黃-當(dāng)歸等藥對出現(xiàn)頻率較高[10]。熟地黃在帕金森病中應(yīng)用較多，其作用機制值得深入探討。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門綜合中藥、疾病、中藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)的學(xué)科，能夠深入探討中藥何種有效成分作用于疾病，以及相關(guān)的生物學(xué)功能和通路[11]，為中藥研究提供了新的方法和方向[12]。因此，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探討熟地黃治療帕金森病的作用機制，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 熟地黃有效成分的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以“熟地黃”為關(guān)鍵詞搜索其全部活性成分。然后根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%，藥物類藥性(drug likeness,DL)>0.18篩選有效活性成分[16]。

1.2 中藥靶點的獲取 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺中，以“熟地黃”為關(guān)鍵詞進行搜索，選擇“Related Targets”一欄，將結(jié)果導(dǎo)出，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)查詢其蛋白所對應(yīng)的基因，并用Perl 5.26.3 軟件(https://www.perl.org/get.html)對篩選出的靶點基因進行注釋，去除重復(fù)項后獲得最終的中藥作用靶點。

1.3 疾病相關(guān)基因的獲取 分別在 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(https://genealacart.genecards.org/)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)中輸入“Parkinson′s disease”，對帕金森病相關(guān)的靶點基因進行檢索，導(dǎo)出結(jié)果。通過去除重復(fù)項，匯總后建立疾病基因的數(shù)據(jù)集。

1.4 中藥靶點和疾病靶點交集的獲取 所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入R×64 3.6.2軟件(https://www.r-project.org/)，采用相應(yīng)腳本運算，得出帕金森病相關(guān)靶點和熟地黃作用靶點的交集，即中藥-疾病靶點，并繪制韋恩圖。

1.5 中藥-有效成分-疾病-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Perl 5.26.3軟件將熟地黃作用的靶點和中藥-疾病靶點進行一一映射，然后運用Cytoscape 3.7.2軟件(https://cytoscape.org/)對該網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)溆嬎?，得到中?成分-疾病-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 中藥-疾病靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心基因的篩選 利用STRING 11在線軟件(https://string-db.org/)將中藥-疾病靶點輸入軟件Multiple Proteins列表下的“List of Names”中，在“Organism”中選擇“homo sapiens”，保存結(jié)果文件。將所得文件輸入 R×64 3.6.2軟件進行計算，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心靶點的條圖。

1.7 中藥-疾病靶點的功能富集分析和通路富集分析 利用 R×64 3.6.2軟件進行計算，對熟地黃治療帕金森病的核心靶點進行基因本體(Gene Ontology,GO) 功能富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG) 通路富集分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熟地黃有效成分的篩選和靶點預(yù)測結(jié)果 共搜索到熟地黃的活性成分76個，根據(jù)OB 和DL進行篩選，共獲得有效活性成分2個，包括β-谷甾醇(Mol編碼為MOL000359，OB=36.91%，DL=0.75)和豆甾醇(Mol編碼為MOL000449，OB=43.83%，DL=0.76)。 共得到中藥相關(guān)靶點327個，去除重復(fù)項后獲得中藥作用靶點26個。

2.2 中藥-疾病靶點構(gòu)建的結(jié)果 獲得帕金森病相關(guān)的靶點7058個，取交集后得到中藥-疾病靶點共19個，見圖1。

圖1 中藥-疾病靶點的韋恩圖

2.3 中藥-有效成分-疾病-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果 構(gòu)建的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖2)中紅色橢圓形代表帕金森病，綠色菱形代表中藥熟地黃，黃色三角形代表熟地黃有效成分豆甾醇，紫色V形代表中藥-疾病靶點，即熟地黃主要通過豆甾醇作用于19個靶點，這19個靶點可能影響帕金森病的發(fā)生和發(fā)展。

圖2 中藥-成分-疾病-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 中藥-疾病靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)以及核心基因的篩選結(jié)果 中藥-疾病靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖3。由圖 4 可知，中藥-疾病核心基因按鄰接節(jié)點數(shù)目由多到少依次為MAOA、ADRA1B、ADRA1A、MAOB、SLC6A2、ADRA2A、ADRB2、CHRM1、SLC6A3、ADRB1、CHRM2、CHRM3、PTGS2、ADHIC、AKR1B1等。鄰接節(jié)點數(shù)目越多，成為核心基因的概率越大，故MAOA、ADRA1B、ADRA1A、MAOB、SLC6A2很有可能成為核心基因。

圖3 中藥-疾病靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 中藥-疾病核心靶點的條圖

2.5 GO功能富集分析結(jié)果 共富集到65條生物過程，熟地黃治療帕金森病的核心靶點的 GO 功能主要涉及G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、乙酰膽堿受體活性、G蛋白偶聯(lián)、5-羥色胺受體活性等，見表1、圖5。

表1 GO富集分析部分結(jié)果

圖5 GO功能富集分析柱狀圖 (前20個)

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果 共富集出27條通路與熟地黃治療帕金森病有關(guān)，主要包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、鈣信號通路、唾液分泌通路、脂肪細(xì)胞脂解的調(diào)節(jié)通路、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)-蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)信號通路、5-羥色胺能突觸通路、藥物代謝-細(xì)胞色素P450通路、組氨酸代謝通路、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信號通路、多巴胺能突觸通路、膽堿能突觸通路等，見表2和圖6。 鈣信號通路、 cGMP-PKG 信號通路、cAMP信號通路分別見圖7～9。

表2 KEGG 通路富集分析結(jié)果(前20個)

圖6 KEGG 通路富集分析柱狀圖

圖7 鈣信號通路

圖8 cGMP-PKG 信號通路

圖9 cAMP信號通路

3 討 論

帕金森病屬中醫(yī)“顫證”范疇,別名“顫振”“震顫”“振掉”。中醫(yī)臨床常將顫證分為肝腎陰虛型、肝風(fēng)內(nèi)動型、風(fēng)痰阻絡(luò)型、氣血虧虛型4型[17-18]。顫證病位在腦，年老體弱是病因，而腎虛是根本[19]。熟地黃歸肝、腎經(jīng)，可以滋陰補腎，適合肝腎陰虛型的帕金森病患者。

由中藥-成分-疾病-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖可知，豆甾醇是熟地黃治療帕金森病的主要有效成分。植物甾醇類具有抗神經(jīng)性退化、抗氧化、抗衰老、抗動脈粥樣硬化等作用，豆甾醇屬于植物甾醇類中的一種。豆甾醇能通過大腦血流屏障,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高線粒體跨膜電位和ATP量，從而減輕帕金森病患者的神經(jīng)元變性[20]。

根據(jù)中藥-疾病靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和核心靶點條形圖，MAOA、ADRA1B、ADRA1A、MAOB、SLC6A2有可能是熟地黃發(fā)揮抗帕金森病作用的核心基因。MAO是人體內(nèi)的能夠催化單胺類物質(zhì)氧化脫氨反應(yīng)的酶，包括MAOA和MAOB兩種同工酶。其中，MAOA主要分布在兒茶酚胺能神經(jīng)元中，可使單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(如去甲腎上腺素、5-羥色胺)失活[21]。MAOA表達(dá)上調(diào)與抑郁癥密切相關(guān)[22]，而部分帕金森病患者有不同程度的抑郁表現(xiàn)。MAOB主要分布在神經(jīng)元(組胺能、5-羥色胺能)與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，MAOB的抑制劑有司來吉蘭、雷沙吉蘭、沙芬酰胺等[21]。MAOB的水平越高，帕金森病發(fā)病越嚴(yán)重，而MAOB抑制劑能治療早期帕金森病，延緩病情進展。ADRA1A 是腎上腺素能系統(tǒng)中可介導(dǎo)腎上腺素和去甲腎上腺素發(fā)揮生物學(xué)功能的生物傳感器[22]。ADRA1A基因和廣泛性焦慮障礙密切相關(guān)[23]，較多帕金森病患者存在焦慮障礙，而熟地黃可能通過調(diào)控ADRA1A水平改善帕金森病患者的焦慮癥狀。ADRA1B屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族,在激活有絲分裂以及調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和增殖中發(fā)揮主要作用[24]，但目前尚無針對ADRA1B與帕金森病之間確切關(guān)系的研究報道，值得進一步探討。SLC6A2為去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體，對調(diào)控去甲腎上腺素的表達(dá)和終止神經(jīng)沖動信號，保持受體對神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性具有關(guān)鍵的作用[26-27]。去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體和多巴胺轉(zhuǎn)運體、5-羥色胺轉(zhuǎn)運體具有很高的序列同源性,而后兩者與帕金森病的發(fā)病密切相關(guān),故作用于去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體很可能能改善帕金森病患者的癥狀。

GO功能分析結(jié)果，熟地黃治療帕金森病的核心基因可通過影響G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、乙酰膽堿受體活性、G蛋白偶聯(lián)5-羥色胺受體活性等，來調(diào)控帕金森病的發(fā)生，即主要從神經(jīng)遞質(zhì)、乙酰膽堿、G蛋白偶聯(lián)等分子水平來治療帕金森病。本研究共富集出27條通路與治療帕金森病有關(guān)，其中包括鈣信號通路、cGMP-PKG信號通路和cAMP信號通路等。鈣離子是真核細(xì)胞中重要的第二信使[28]，對神經(jīng)傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄及信號通路傳導(dǎo)等有重要作用，鈣信號通路與帕金森病、阿爾茲海默病等神經(jīng)性疾病發(fā)病密切相關(guān)[29]。研究表明，給予帕金森病小鼠注射鈣離子通道拮抗劑尼莫地平，能明顯改善小鼠的運動過緩、肌強直、靜止性震顫行為學(xué)異常[30]；高血壓病患者使用鈣離子拮抗劑治療，可明顯降低帕金森病發(fā)病風(fēng)險[31]。以上研究結(jié)果均說明鈣離子拮抗劑能夠保護帕金森病，而熟地黃治療帕金森病的作用之一則是通過鈣信號通路。 GMP和NO、8-Br-c 可增加細(xì)胞內(nèi)cGMP的水平，發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡的作用[32]；而血管鈉肽通過激活cGMP/PKG信號通路，起到保護多巴胺能神經(jīng)元作用[33]。但目前尚無研究表明熟地黃何種成分能促進血管鈉肽的釋放，從而激活cGMP/PKG信號通路，起到保護多巴胺能神經(jīng)元。

綜上所述，熟地黃通過豆甾醇作用于帕金森病，體現(xiàn)了多靶點、多途徑治療帕金森病的特點，為熟地黃的臨床及實驗研究提供理論依據(jù)，為帕金森病的治療提供新方向，今后應(yīng)從臨床和實驗多方面進一步驗證。