黃志漢 黎文杰 鄭景輝

(1 廣西大新縣中醫(yī)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，大新縣 532300，電子郵箱：huangzhihan163@163.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院心內(nèi)科，南寧市 530000)

據(jù)國家癌癥中心統(tǒng)計(jì)，2019年我國肺癌發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位，其中新發(fā)病例約78.1萬，死亡病例約62.6萬[1]。目前肺癌的主流治療方案仍是以化療為主的綜合治療方案，但由于耐藥性強(qiáng)等原因治療效果并不理想[2]。中藥因具有高效、低毒、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢，在肺癌耐藥性研究中優(yōu)勢日益明顯[3]。鴉膽子為苦木科植物鴉膽子的干燥成熟果實(shí)，具有清熱解毒、截瘧、止痢的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鴉膽子具有廣泛的抗癌作用，并可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[4]。但是由于中藥多因、多效、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，鴉膽子治療癌癥的具體作用機(jī)制尚未被闡明。本研究利用系統(tǒng)藥理學(xué)方法綜合闡釋鴉膽子治療肺癌的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 鴉膽子的化學(xué)成分 本研究采用藥代動(dòng)力學(xué)特征和毒性計(jì)算方法，借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索鴉膽子所有化學(xué)成分，以口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18篩選鴉膽子的活性成分，最后得到相關(guān)化合物以及其相關(guān)靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)名稱輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中統(tǒng)一為規(guī)范基因名；剔除不同化合物預(yù)測產(chǎn)生的相同靶點(diǎn)，得出鴉膽子化合物潛在靶點(diǎn)信息。

1.2 蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將1.1所得的靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫v10.5(http://string-db.org)，選擇以人為分類的物種，設(shè)定打分值為高置信度0.7，隱藏?cái)嗔压?jié)點(diǎn)，得出蛋白質(zhì)互相作用(protein-protein interaction,PPI)信息，將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建鴉膽子化合物靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.3 鴉膽子治療肺癌潛在靶點(diǎn)篩選 本研究基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)綜合篩選與肺癌相關(guān)的靶點(diǎn)，具體操作如下：以“l(fā)ung cancer”作為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫中查詢，初步篩選出20 650個(gè)候選基因，根據(jù)“Reference Count”值取相關(guān)度大于30的靶點(diǎn)。將構(gòu)建的肺癌相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫與鴉膽子化合物潛在靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析，并利用Venny 2.1在線工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/)繪制韋恩圖，篩選出鴉膽子治療肺癌的潛在靶點(diǎn)。

1.4 鴉膽子治療肺癌潛在靶點(diǎn)的連通特性 根據(jù)1.1和1.3的預(yù)測結(jié)果,利用Cytoscape 3.6.1軟件中的Merge功能,將兩個(gè)預(yù)測結(jié)果合并成化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖,進(jìn)行全局化可視網(wǎng)絡(luò)分析；并通過Cytoscape 3.6.1軟件的Network analysis插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù),分析其相互關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)(node)之間如存在調(diào)控作用關(guān)系則以邊(edge)相連。本研究通過平均最短路徑、介數(shù)中心性、中心接近度、聚類系數(shù)和連通度等參數(shù)來評(píng)估節(jié)點(diǎn)在全網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵性。

1.5 生物學(xué)功能和通路富集分析 將鴉膽子作用于肺癌潛在相關(guān)靶點(diǎn)的官方簡寫上傳到DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)中，依次勾選OFFICIAL_GENE_SYMBOL(官方基因標(biāo)志)、Gene list、Submit list,修改背景和物種為人類進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)分析。選擇“KEGG-Pathway”得到京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析相關(guān)數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1 鴉膽子的活性成分及其潛在靶點(diǎn)間的的PPI網(wǎng)絡(luò)圖 共得到13個(gè)鴉膽子的化學(xué)成分，包括β-谷甾醇、鴉膽子素、矢車菊甙、木犀草素、鴉膽子苷等，見表1。刪除無相關(guān)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的化學(xué)成分，得到鴉膽子有效活性成分2個(gè)，分別為β-谷甾醇和木犀草素，共分析得到48個(gè)最終潛在靶點(diǎn)進(jìn)行下一步研究。鴉膽子有效化合物靶點(diǎn)圖及其PPI網(wǎng)絡(luò)分別見圖1、圖2。

表1 鴉膽子的化學(xué)成分

圖1 鴉膽子化合物靶點(diǎn)圖

圖2 鴉膽子作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 鴉膽子治療肺癌的潛在靶點(diǎn) 共獲得321個(gè)肺癌相關(guān)靶點(diǎn)。將48個(gè)鴉膽子的潛在靶點(diǎn)與肺癌靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析，得到鴉膽子治療肺癌的20個(gè)潛在靶點(diǎn)，分別為TP53、JUN、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)2、前列腺素g/h合酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、雄激素受體(androgen receptor，AR)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)、孕酮受體(progesterone receptor，PGR)、干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)、MMP1、IL-2、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)、肝細(xì)胞生長因子受體MET、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白R(shí)B1、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1(glutathione S-transferase P1，GSTP1)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1(DNA topoisomerase 1，TOP1)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2，BCL-2)，重合率為5.7%，見圖3。鴉膽子對(duì)肺癌作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見圖4。經(jīng)拓?fù)鋵W(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這20個(gè)潛在靶點(diǎn)在全局性關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)了較好的連通特性。見表2。

圖3 鴉膽子的潛在靶點(diǎn)與肺癌作用靶點(diǎn)的韋恩圖

圖4 鴉膽子-肺癌作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 20個(gè)鴉膽子-肺癌作用靶點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)分析

2.3 鴉膽子治療肺癌潛在靶點(diǎn)的生物學(xué)功能和通路分析 將20個(gè)鴉膽子治療肺癌潛在靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO分析和KEGG分析。GO分析結(jié)果得到7個(gè)生物學(xué)過程、11個(gè)細(xì)胞組成、22個(gè)分子功能，見圖5；通路富集KEGG分析獲得37條鴉膽子治療肺癌潛在靶點(diǎn)的通路，見圖6。

圖5 鴉膽子-肺癌作用靶點(diǎn)的GO分析結(jié)果

圖6 鴉膽子-肺癌作用靶點(diǎn)的KEGG富集分析結(jié)果

2.4 鴉膽子治療肺癌潛在靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果 系統(tǒng)分子對(duì)接結(jié)果顯示，有4個(gè)靶點(diǎn)的DS值>7.0，超過90%靶點(diǎn)的DS值>5.0，說明鴉膽子主要化學(xué)成分β-谷甾醇與木犀草素對(duì)鴉膽子治療肺癌潛在靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性。見表3。

表3 鴉膽子治療肺癌潛在靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

3 討 論

中醫(yī)上認(rèn)為腫瘤的發(fā)生多是由于邪毒趁機(jī)體正氣虛弱之時(shí)侵入，引起臟腑功能失調(diào)，機(jī)體氣滯血瘀時(shí)間過長，逐漸誘發(fā)腫塊形成。放化療治療雖可腫瘤產(chǎn)生一定作用，但副作用過大，對(duì)機(jī)體損害大，甚至可引起攻邪傷正發(fā)生，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[6]。中醫(yī)藥輔助治療肺癌副作用較小，但是中藥的具體成分難以簡單辨別，具體作用機(jī)制也難以清楚闡釋。系統(tǒng)藥理學(xué)協(xié)同起效的觀念與中醫(yī)上“整體觀”相吻合。本研究采用系統(tǒng)藥理學(xué)方法，利用化合物映射靶點(diǎn)的方法系統(tǒng)探究鴉膽子治療肺癌的具體作用機(jī)制。

本研究篩選出β-谷甾醇、鴉膽子素、木犀草素、鴉膽子苷等鴉膽子的主要化學(xué)成分，且得到48個(gè)最終潛在靶點(diǎn)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鴉膽子素是鴉膽子中發(fā)揮抗腫瘤作用的主要成分，其中單體鴉膽子素D不僅能夠誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡，還能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[7-8]。β-谷甾醇作為廣譜抗癌成分，在治療乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌方面均具有較好的療效[9]。林明珠等[10]在小鼠實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可通過介導(dǎo)IL-6、IFN-γ和VEGF表達(dá)促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞的凋亡。木犀草素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵犯具有良好的抑制作用[11]。周亮等[12]發(fā)現(xiàn)，木犀草素可顯著降低CD8+T淋巴細(xì)胞水平，降低肺組織中表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、VEGF的表達(dá)及蛋白激酶B1、細(xì)胞周期蛋白D1、核因子κB mRNA的表達(dá)水平，提高肺組織中PTEN蛋白的表達(dá)，降低磷脂酰肌醇3-激酶、磷酸化蛋白激酶蛋白B表達(dá)水平，提示木犀草素可顯著抑制肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。

在對(duì)鴉膽子作用于肺癌的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選時(shí)，發(fā)現(xiàn)有20個(gè)鴉膽子有效化合物的潛在靶點(diǎn)與肺癌靶點(diǎn)重合；將這20個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG分析，結(jié)果顯示，有7個(gè)生物學(xué)過程、11個(gè)細(xì)胞組成、22個(gè)分子功能及37條通路參與鴉膽子作用于肺癌的過程，包括癌癥中的微小RNA、癌癥的信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子1α信號(hào)通路等都與肺癌具有高度相關(guān)性。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用：一方面通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展；另一方面通過參與免疫抑制微環(huán)境的形成介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[13]。該通路抑制劑通過對(duì)抗免疫抑制的形成，重塑腫瘤免疫微環(huán)境，抑制腫瘤進(jìn)展[14]。由于腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖、轉(zhuǎn)移能力，容易導(dǎo)致血液供應(yīng)不足，此時(shí)腫瘤細(xì)胞會(huì)上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)來維持腫瘤細(xì)胞的增殖代謝，從而適應(yīng)缺氧微環(huán)境[15]。低氧誘導(dǎo)因子1α能通過調(diào)節(jié)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄來影響腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖、凋亡，使得腫瘤細(xì)胞更好地適應(yīng)缺氧微環(huán)境；同時(shí)其還具有促進(jìn)腫瘤血管生成、增加侵襲轉(zhuǎn)移能力以及提高對(duì)放化療抵抗的作用等[16]。此外，癌癥中的微小RNA在肺癌的發(fā)生中也具有重要作用[17]。

在分子對(duì)接模擬結(jié)合力驗(yàn)證中，HMOX1、GSTP1、CDK4與β-谷甾醇、木犀草素模擬結(jié)合力較強(qiáng)，提示HMOX1、GSTP1、CDK4基因在鴉膽子治療肺癌的過程中可能具有重要研究意義。GSTP1是體內(nèi)重要的致癌物代謝酶基因，在保護(hù)正常細(xì)胞免受促癌因素的影響以及在抑制細(xì)胞癌變中起重要作用[18]。在既往研究表明，激活HMOX1可以參與Janus激酶2/信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3的信號(hào)傳導(dǎo)，通過促進(jìn)程序性死亡受體1及其配體的表達(dá)以及細(xì)胞之間的相互作用來削弱CD8+T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[19]。在很多癌癥中，細(xì)胞周期蛋白D-CDK4/6-CDK4抑制物-Rb通路的失調(diào)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖；而鑒于CDK4/6活性在癌細(xì)胞中的重要性，CDK4/6抑制劑已成為一種很有前途的腫瘤治療候選藥物[20]。

目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于治療肺癌的方法僅局限于主流的化療和靶向藥物。因此，探索有效治療肺癌且天然、高效、副作用小的藥物是當(dāng)今醫(yī)藥界研究的熱點(diǎn)。本研究初步探討了鴉膽子治療肺癌的作用機(jī)制，從分子水平分析了中醫(yī)藥治療疾病的具體作用機(jī)制，為現(xiàn)代中藥的開發(fā)提供了科學(xué)基礎(chǔ)。但是本研究僅基于系統(tǒng)藥理學(xué)探討了鴉膽子對(duì)肺癌治療的作用，相關(guān)研究結(jié)果還需實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。