孫煒煒 蔡 超 段麗萍 陳 勝 陳 浩 金 皓 朱 杰

(1.武漢黃鶴樓香精香料有限公司，湖北 武漢 430050；2.武漢黃鶴樓新材料科技開發(fā)有限公司，湖北 武漢 430050)

為了防止食物變質(zhì)，化學(xué)合成類防腐劑成為食品中必須添加的成分，但其若在人體內(nèi)長(zhǎng)期積累，則會(huì)具有一定的負(fù)面影響[1]。目前天然防腐劑主要來自于植物、動(dòng)物和微生物產(chǎn)生的活性抑菌成分。如，植物源的黃酮類化合物用于水產(chǎn)品的保質(zhì)、動(dòng)物源的殼聚糖用于醋腌食品的防腐等[2]。但天然抗菌物質(zhì)提取、分離純化步驟復(fù)雜，技術(shù)要求較高等制約了其大規(guī)模的商業(yè)化應(yīng)用[3]。

目前，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products，MRPs)已被證實(shí)存在良好的抗菌性能[4]。美拉德反應(yīng)是指氨基酸/蛋白質(zhì)和還原糖之間發(fā)生的一種非酶褐變反應(yīng)，又稱羰氨反應(yīng)。大多數(shù)食品中都含有羰基(源自糖或油脂氧化酸敗等)和氨基(源自氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等)，因此這類反應(yīng)普遍存在于食品加工和貯存過程中。MRPs主要包括香味物質(zhì)、紫外吸收中間體和深棕色高分子化合物類黑素等，其賦予了食物誘人的色澤、濃郁的芳香和醇厚的滋味。但反應(yīng)控制不當(dāng)時(shí)，可產(chǎn)生一些危害衍生物如丙烯酰胺、雜環(huán)胺類、晚期糖基化末端終產(chǎn)物(AGEs，如羧甲基賴氨酸、戊糖苷素、3-脫氧葡萄糖酮酸、吡咯素、吡咯醛、丙酮醛等) 等物質(zhì)，可引起癌癥及慢性疾病的發(fā)生[5](人體動(dòng)脈粥樣硬化、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)衰退性疾病及糖尿病等)。已有研究[6-7]表明上述危害衍生物的形成都會(huì)受到抗氧化劑成分的抑制作用，主要包括自由基清除、羰基捕獲和金屬離子螯合3種機(jī)制。此外，賴氨酸—木糖體系美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(XL-MRPs)存在較強(qiáng)的抗氧化活性[8]。試驗(yàn)擬以木糖(Xylose)和賴氨酸(Lys)為原料，以抗氧化活性及褐變程度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過分別控制不同變量(反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH和n木糖∶n賴氨酸)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再以FRAP為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)條件設(shè)計(jì)，優(yōu)化木糖—賴氨酸體系美拉德反應(yīng)的制備條件，旨在加深對(duì)XL-MRPs宏觀特性的理解，并為天然防腐劑的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木糖(Xylose)：上海山浦化工有限公司；

賴氨酸(Lys)：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

無水醋酸鈉、冰乙酸、鹽酸、硫酸亞鐵、硫酸、碳酸氫鈉、TPTZ、氯化鈉等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

試驗(yàn)用RO水。

1.2 儀器與設(shè)備

可見分光光度計(jì)：722型，天津冠澤科技有限公司；

分析天平：BS-210型，德國Sartorius Instruments公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：BXM-30R型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

(1) 反應(yīng)時(shí)間對(duì)XL-MRPs抗氧化活性及褐變程度的影響：將Xylose和Lys按n木糖∶n賴氨酸=1∶1稱取，加入蒸餾水并定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0，120 ℃下分別反應(yīng)0，30，60，90，120，150 min，反應(yīng)產(chǎn)物于4 ℃冰箱中備用，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)褐變程度和XL-MRPs抗氧化活性的影響。

(2) 反應(yīng)溫度對(duì)XL-MRPs抗氧化活性及褐變程度的影響：將Xylose和Lys按n木糖∶n賴氨酸=1∶1稱取，加入蒸餾水并定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0，分別于80，90，100，110，120，130 ℃下反應(yīng)120 min，考察反應(yīng)溫度對(duì)褐變程度和XL-MRPs抗氧化活性的影響。

(3) 反應(yīng)pH對(duì)XL-MRPs抗氧化活性及褐變程度的影響：將Xylose和Lys按n木糖∶n賴氨酸=1∶1稱取，加入蒸餾水并定容至100 mL，分別調(diào)節(jié)pH為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，110 ℃反應(yīng)120 min，考察pH對(duì)褐變程度和XL-MRPs抗氧化活性的影響。

(4)n木糖∶n賴氨酸對(duì)XL-MRPs抗氧化活性及褐變程度的影響：將Xylose和Lys分別按n木糖∶n賴氨酸=1.0∶1.0，1.5∶1.0，2.0∶1.0，1.0∶1.5，1.0∶2.0稱取，加入蒸餾水并定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH至9.0，110 ℃反應(yīng)120 min，考察n木糖∶n賴氨酸對(duì)褐變程度和XL-MRPs抗氧化活性的影響。

1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)響應(yīng)面法中Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)原理，以反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH、n木糖∶n賴氨酸為試驗(yàn)因素，以FRAP為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化XL-MRPs的制備條件[9]。

1.3.3 XL-MRPs的抑菌性 采用抑菌圈法測(cè)定XL-MRPs對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用[10]。

1.3.4 XL-MRPs的抗氧化性能 以FRAP值作為抗氧化性能的考察指標(biāo)，參照文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 XL-MRPs的褐變程度 采用吸光度法[12]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)平行3次，結(jié)果取平均值。運(yùn)用Origin 2018、Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間≤120 min時(shí)，XL-MRPs的抗氧化活性及褐變程度均隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，其中FRAP值由0.23增大至0.73，抗氧化能力提升3倍以上，且反應(yīng)體系前30 min產(chǎn)生褐變物質(zhì)的速率最快(斜率最大)；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間>120 min時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，XL-MRPs的抗氧化活性及褐變程度緩慢減小，說明MRPs中具有抗氧化活性的成分以及褐變物質(zhì)易于在反應(yīng)進(jìn)行的前期階段形成，反應(yīng)過程中，中間產(chǎn)物經(jīng)脫氫、縮合、分子重排生成的類黑精和揮發(fā)性雜環(huán)化合物增多，XL-MRPs的抗氧化活性增強(qiáng)，褐變程度加深；反應(yīng)后期，這些具有抗氧化活性的物質(zhì)會(huì)繼續(xù)反應(yīng)而損失減少，可能是由于高溫反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，生成的物質(zhì)降解導(dǎo)致的[13]。故控制體系反應(yīng)時(shí)間為120 min左右能產(chǎn)生最大的抗氧化能力和褐變程度。當(dāng)反應(yīng)溫度由90 ℃升高至110 ℃時(shí)，體系褐變程度加深，抗氧化活性增強(qiáng)；當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)升高至130 ℃時(shí)，XL-MRPs的褐變值由0.484降至0.308，F(xiàn)RAP值由0.69降至0.32。一般而言，高溫有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，使得反應(yīng)體系在較短時(shí)間內(nèi)生成較多的還原酮雜合物和類黑精等化合物，這些物質(zhì)對(duì)MRPs的還原力有重要貢獻(xiàn)，XL-MRPs的抗氧化活性增強(qiáng)；溫度過高會(huì)使生成的中間產(chǎn)物發(fā)生分解，導(dǎo)致抗氧化活性降低[14]。因此控制體系反應(yīng)溫度為109 ℃，此時(shí)有最大的抗氧化能力和褐變程度。當(dāng)反應(yīng)體系初始pH從5.0上升至9.0時(shí)，F(xiàn)RAP值及褐變吸光度均逐漸增大，體系抗氧化活性和褐變程度逐步增強(qiáng)，可能是由于參與美拉德反應(yīng)的是胺離子，反應(yīng)體系堿性越強(qiáng)，尤其是當(dāng)pH>7.0時(shí)，胺離子的質(zhì)子被釋放，增加了參與美拉德反應(yīng)的游離氨基的有效濃度，體系pH增加有利于XL-MRPs的形成，生成的類黑素等化合物含量較高，抗氧化活性增強(qiáng)。因此體系pH為9.0時(shí)，褐變程度和抗氧化活性均最大。當(dāng)增加反應(yīng)體系中木糖含量時(shí)，XL-MRPs的FRAP值及褐變程度均明顯提高；其中，當(dāng)n木糖∶n賴氨酸為2∶1時(shí)，XL-MRPs的FRAP值最高，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，此時(shí)體系也有最大的褐變程度。綜上，賴氨酸—木糖體系美拉德反應(yīng)最佳制備條件為：反應(yīng)時(shí)間120 min，pH 9.0，反應(yīng)溫度110 ℃，n木糖∶n賴氨酸為2∶1。此外，褐變值和FRAP值總是同時(shí)達(dá)到最大，且同步增大和減小，表明體系美拉德反應(yīng)進(jìn)程中抗氧化產(chǎn)物和形成褐變的物質(zhì)總是同步產(chǎn)生或損失。

圖1 各因素對(duì)XL-MRPs褐變程度和抗氧化活性的影響Figure 1 Effects of different conditions on the browning degree and antioxidant activity of XL-MRPs

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合原理對(duì)XL-MRPs制備條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素和水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 11.1.0.1軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到XL-MRPs的FRAP值與各因素的回歸方程：

Y=1.29+7.285E-003A+0.092B+0.042C+0.13D+0.013AB+0.025AC-0.051AD+0.070BC+0.013BD-0.070CD-0.094A2-0.093B2-0.14C2-0.11D2。

(1)

經(jīng)響應(yīng)面分析得XL-MRPs的最佳制備條件為反應(yīng)時(shí)間119.87 min，反應(yīng)pH 8.97，反應(yīng)溫度109.49 ℃，n木糖∶n賴氨酸=2.1∶1.0，此條件下XL-MRPs的預(yù)測(cè)FRAP值為1.32。由于實(shí)際操作等因素影響，將最佳制備條件修正為反應(yīng)時(shí)間120 min，反應(yīng)pH 9.0，反應(yīng)溫度109 ℃，n木糖∶n賴氨酸=2.1∶1.0，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=3)，得實(shí)測(cè)FRAP值為(1.33±0.16)，與預(yù)測(cè)值相符，證明用所建模型預(yù)測(cè)XL-MRPs的FRAP值是準(zhǔn)確可行的。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表Table 1 Experiment design of response surface factor

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experiment design and results of response surface methodology

2.3 XL-MRPs的抑菌性

由表4可知，XL-MRPs對(duì)3種供試菌均具有抑菌圈，同濃度下其對(duì)大腸桿菌的抑菌圈最大，金黃色葡萄球菌的次之，枯草芽孢桿菌的最小。3種供試菌中，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，說明XL-MRPs對(duì)革蘭氏陽性菌及陰性菌均有抑菌作用，且對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用強(qiáng)于陽性。隨著XL-MRPs稀釋梯度的增加，其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)XL-MRPs稀釋至10-6梯度時(shí)，產(chǎn)生的抑菌圈直徑均小于抑菌性判斷標(biāo)準(zhǔn)的(7 mm)，說明在此梯度下XL-MRPs沒有抑菌性，故最小抑菌濃度為10-6。

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Regression coefficient and variance analysis

3 結(jié)論

以賴氨酸和木糖作為原料制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，其最優(yōu)制備條件為反應(yīng)溫度109 ℃，反應(yīng)時(shí)間120 min，反應(yīng)pH 9.0，木糖與賴氨酸摩爾比2.1∶1.0。此條件下木糖—賴氨酸體系美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性最強(qiáng)，F(xiàn)RAP值為1.33±0.16。木糖—賴氨酸體系美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均具有抑菌作用，且木糖—賴氨酸體系美拉德反應(yīng)產(chǎn)物溶液的最小抑菌濃度為10-6。后續(xù)擬開展中試論證試驗(yàn)，設(shè)計(jì)賴氨酸—木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的規(guī)?；a(chǎn)工藝路線。

表4 XL-MRPs稀釋梯度對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑的影響?Table 4 Effects of different concentration of XL-MRPs on the diameter of inhibition zone of Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis mm