劉 迪 楊 青 韓 莉 余婷婷 曹 琦 江 豐 王會(huì)霞

(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430075；2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075)

滅草松(Bentazone)又名排草丹、苯達(dá)松[結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1(a)]，為巴斯夫公司開(kāi)發(fā)的苯并噻二嗪酮類除草劑，是一類兼觸殺性和內(nèi)吸性除草劑[1-3]，被廣泛應(yīng)用于芽后雜草的防除，可用于水稻、小麥田中除草，對(duì)絕大多數(shù)雙子葉植物和莎草科雜草有殺除作用，對(duì)禾本科植物無(wú)害[4]。滅草松屬于低毒或中等毒性農(nóng)藥，其在水稻和小麥等植物中會(huì)被還原代謝成6-羥基滅草松[圖1(b)]或8-羥基滅草松[圖1(c)]，而相應(yīng)的代謝產(chǎn)物6-羥基滅草松和8-羥基滅草松均具有毒性[8]，對(duì)人體有一定的毒性，一般水體污染比較嚴(yán)重[5-7]。

根據(jù)GB 2763—2019規(guī)定，滅草松殘留物定義為滅草松、6-羥基滅草松及8-羥基滅草松之和，以滅草松表示，稻谷和麥類的臨時(shí)最大殘留限量為0.1 mg/kg，且沒(méi)有規(guī)定法定檢測(cè)方法。目前，關(guān)于滅草松的測(cè)定方法有氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法[9-10]、離子色譜法[11-12]、液相色譜法[13-14]和液質(zhì)聯(lián)用法[15-18]。實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，氣相色譜及氣質(zhì)聯(lián)用法一般需要衍生化處理，過(guò)程比較繁復(fù)；離子色譜法應(yīng)用相對(duì)較少，同時(shí)色譜柱的選擇性相對(duì)較弱；液相色譜法則存在樣品基體干擾大；而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，選擇性強(qiáng)。同時(shí)現(xiàn)有的滅草松殘留檢測(cè)建立方法多見(jiàn)滅草松母體，而代謝物6-羥基滅草松和8-羥基滅草松檢測(cè)方法只有液相方法的報(bào)道[4]，該方法靈敏度和準(zhǔn)確度不高。目前能同時(shí)測(cè)定滅草松及其代謝物6-羥基滅草松和8-羥基滅草松的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法還未見(jiàn)報(bào)道。試驗(yàn)擬以大米和面粉為研究對(duì)象，對(duì)QuEChERS法提取和凈化方法、液相質(zhì)譜參數(shù)等作優(yōu)化處理，選擇C18吸附劑對(duì)樣品作分散固相萃取凈化，建立大米和面粉中滅草松及其代謝物6-羥基滅草松與8-羥基滅草松的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。

圖1 滅草松及其代謝物結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structure formula of Bentazone and its metabolites

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料及試劑

滅草松(CAS號(hào)：25057-89-0)、6-羥基滅草松(CAS號(hào)：60374-42-7)、8-羥基滅草松(CAS號(hào)：60374-43-8)標(biāo)準(zhǔn)品：純度>98%，德國(guó)DR公司；

大米、小麥粉：市售；

乙腈(CAS號(hào)：75-05-8)、甲醇(CAS號(hào)：67-56-1)：色譜純，德國(guó)默克公司；

乙酸(CAS號(hào)：64-19-7)、甲酸(CAS號(hào)：64-18-6)：質(zhì)譜純，美國(guó)Fisher公司；

無(wú)水硫酸鈉(CAS號(hào)：15124-09-1)、無(wú)水硫酸鎂(CAS號(hào)：7487-88-9)：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)：40～60 μm，博納艾杰爾科技有限公司；

十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)：40～60 μm，博納艾杰爾科技有限公司；

針筒式微孔濾膜：孔徑0.22 μm，材質(zhì)為英國(guó)尼龍66(有機(jī)系)，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

超純水：電阻率≥18.2 MΩ·cm(25 ℃)，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 主要試驗(yàn)儀器

三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：Triple Quad 5500，美國(guó)AB SCIEX公司；

液相色譜儀：LC-30A型，日本島津公司；

電子分析天平：XS204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

電子分析天平：ME2002E型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

高速離心機(jī)：Avanti JXN-30型，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；

翻轉(zhuǎn)式混勻器：Trayster Digital型，德國(guó)IKA公司；

氮吹儀：N-EVAP24型，美國(guó)Organomation公司；

渦旋混合器：基本型，美國(guó)Talboys公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 分別準(zhǔn)確稱取滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的溶解性和測(cè)定需要分別用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，-20 ℃保存。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品中間溶液 分別準(zhǔn)確吸取1.00 mL 滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于同一個(gè)100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，即得1.0 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，4 ℃保存。

1.3.3 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品工作液 取經(jīng)凈化后的空白基質(zhì)溶液1 mL(取樣量與相應(yīng)的試樣處理取樣量相同)，氮?dú)獯蹈桑?.00 mL相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液復(fù)溶，過(guò)微孔濾膜，濾液待測(cè)。基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品工作溶液應(yīng)保證現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取 準(zhǔn)確稱取已研磨的大米或小麥粉5.00 g于50 mL帶蓋聚乙烯離心管中，先加入10 mL超純水，充分渦旋均勻，靜置30 min。再同時(shí)加入10 mL乙腈和0.5 mL 6 mol/L HCl溶液，加入5 g無(wú)水硫酸鈉，劇烈振蕩渦旋2 min，翻轉(zhuǎn)提取20 min，4 000 r/min離心5 min，將上清液置于50 mL離心管中，待凈化。

1.4.2 凈化 吸取2 mL上清液加入至含200 mg PSA、100 mg C18粉末和200 mg無(wú)水硫酸鎂的15 mL塑料離心管中，渦旋混合2 min，4 000 r/min 離心5 min，上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，高效液相色譜—串聯(lián)/質(zhì)譜儀待測(cè)。

1.5 液相色譜參考條件的確定

對(duì)比不同的色譜柱與不同的有機(jī)相與水相溶液配比(見(jiàn)表1)，通過(guò)比較色譜行為，選擇合適的色譜柱和流動(dòng)相。對(duì)梯度洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，并設(shè)置和調(diào)節(jié)儀器的進(jìn)樣條件，以達(dá)到分離度高、峰型優(yōu)和響應(yīng)最佳的色譜行為，從而確定液相色譜條件。

1.6 質(zhì)譜參數(shù)條件的確定

1.6.1 分子離子峰的確定 配制一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用全自動(dòng)進(jìn)樣，掃描范圍為200～300 Da，運(yùn)用Q1 MSFull Scan模式正、負(fù)離子模式進(jìn)行掃描，得到對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜總離子流圖，并通過(guò)總離子流圖確定化合物的分子離子峰。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Liquid chromatography gradient elution procedure

1.6.2 二級(jí)質(zhì)譜掃描 選擇Product ion掃描模式，掃描范圍為50～300 Da，輸入分子離子質(zhì)核比數(shù)值，施加碰撞電壓進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描。

1.6.3 化合物質(zhì)譜條件的優(yōu)化 對(duì)目標(biāo)化合物質(zhì)譜條件的優(yōu)化項(xiàng)目包括電噴霧電壓、離子源溫度、氣簾氣壓力、霧化氣壓力、輔助氣壓力、去簇電壓、碰撞氣能量。選擇二級(jí)質(zhì)譜中相對(duì)響應(yīng)較高的子離子進(jìn)行MRM質(zhì)譜條件的優(yōu)化，記錄最優(yōu)的去簇電壓和碰撞氣能量，生成化合物質(zhì)譜條件。

1.7 提取條件和凈化方式的優(yōu)化

比較不同的有機(jī)試劑以及pH值對(duì)提取過(guò)程的影響，以提取效率為指標(biāo)，確定提取條件；對(duì)PSA、C18、MgSO4用量進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松含量的檢出值為參考指標(biāo)，通過(guò)極差分析確定最終優(yōu)化添加量，從而確定合適的凈化方式。

1.8 方法學(xué)驗(yàn)證

1.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及樣品的測(cè)定 取1.3.3中的混合標(biāo)準(zhǔn)系列對(duì)照品工作液，按優(yōu)化后液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄對(duì)應(yīng)定量離子的峰面積，以濃度對(duì)峰面積進(jìn)行繪制和擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到對(duì)應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。對(duì)于市售大米及面粉樣品，按1.4前處理后，經(jīng)液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，以保留時(shí)間和相應(yīng)的定量、定性離子對(duì)定性，定量離子的峰面積外標(biāo)法定量。

1.8.2 準(zhǔn)確度和精密度 準(zhǔn)確度用樣品加標(biāo)回收率衡量，精密度用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的百分?jǐn)?shù)表示。不同的基質(zhì)樣品進(jìn)行3個(gè)加標(biāo)濃度(低、中、高)的添加，分別測(cè)定回收率并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的百分?jǐn)?shù)(RSD%)。

1.8.3 最低定量限(LOQ) LOQ由10倍信噪比得出(S/N=10)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Analyst分析軟件采集，MultiQuant 定量軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)匯總后，采用Microsoft Office Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松的極性相對(duì)較弱，在普通C18色譜柱都能較好地保留。6-羥基滅草松和8羥基滅草松為同分異構(gòu)體，色譜柱以及流動(dòng)相的選擇既要保證重疊峰有最佳分離度同時(shí)也要保證色譜峰的峰型及質(zhì)譜響應(yīng)，試驗(yàn)選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，較Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)能達(dá)到更好的分離度。試驗(yàn)表明，0.1%甲酸水—甲醇流動(dòng)相體系不僅可以改善峰型，且在7 min內(nèi)可以達(dá)到較好的基線分離，更有利于化合物的定性和定量分析。故確定最優(yōu)色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm)；色譜柱溫度40 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸—水溶液，B為甲醇，梯度洗脫；流動(dòng)相流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。最優(yōu)色譜質(zhì)譜條件下各待測(cè)物質(zhì)的MRM色譜圖見(jiàn)圖2。由圖2可知，3種化合物峰型良好，分離度高，無(wú)干擾。

2.2 質(zhì)譜條件的確定

試驗(yàn)表明，ESI-模式下，3種化合物的分子離子[M-H]-均最為理想；然后分別以目標(biāo)化合物的 [M-H]-作為母離子，施加碰撞能量將其打碎，同時(shí)進(jìn)行子離子掃描，根據(jù)二級(jí)碎片離子掃描質(zhì)譜圖及可能的斷裂規(guī)律，選擇干擾較少、相對(duì)豐度較高的兩個(gè)子離子，并在負(fù)電離模式下以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式優(yōu)化碰撞電壓(CE)和去簇電壓(DP)，滅草松和6-羥基滅草松及8-羥基滅草松的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。確定掃描方式為負(fù)離子掃描，氣簾氣壓力為275 kPa，電噴霧電壓為-4 500 V(負(fù)離子模式)，離子源溫度為450 ℃，霧化氣壓力為345 kPa，輔助氣壓力為380 kPa，檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，相應(yīng)的質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

2.3 樣品提取溶劑優(yōu)化

農(nóng)藥殘留測(cè)定常用的萃取溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正己烷等[19]。根據(jù)相似相溶原理，提取溶劑的極性和樣品基質(zhì)的類型決定目標(biāo)物質(zhì)的提取效率[20]。大米和面粉作為糧谷類產(chǎn)品進(jìn)行農(nóng)藥殘留測(cè)定前需先加入一定量的水進(jìn)行浸潤(rùn)和溶脹，使提取試劑與樣品充分接觸互溶從而利于提取。試驗(yàn)表明，甲醇提取液經(jīng)鹽析也無(wú)法與水相分離；丙酮與水互溶，加大后續(xù)提取液的凈化難度；正己烷和乙酸乙酯的提取率不高，故選擇乙腈作為提取液，加入無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行鹽析。

圖2 滅草松及其代謝物的MRM色譜圖Figure 2 MRM chromatograms of bentazone,6-hydro- xymetazone,8-hydroxymetazone

圖3 滅草松及其代謝物的二級(jí)質(zhì)譜圖Figure 3 Secondary mass spectra of bentazone,6-hydroxymetazone,and 8-hydroxymetazone

表2 滅草松及其代謝物的質(zhì)譜條件?Table 2 The main reference mass spectrometry conditions of bentazone and its metabolites

滅草松及其代謝物的pKa值較小，降低溶液的pH值能有效地使目標(biāo)物由離子狀態(tài)轉(zhuǎn)為分子形式析出，從而使其在有機(jī)溶劑中的分配效率升高[21]。試驗(yàn)采取直接加入酸的方式調(diào)節(jié)pH值，各目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率見(jiàn)表3。由表3可知，加酸后目標(biāo)化合物的回收率明顯高于未加酸的；加入鹽酸后的提取效果要明顯高于甲酸、乙酸等有機(jī)酸，且當(dāng)HCl添加量為0.5 mL時(shí)，滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松的回收率均高于其他添加情況。因此，提取過(guò)程中加入0.5 mL 6 mol/L的鹽酸溶液有助于提高提取率，從而提高過(guò)程回收率。

2.4 樣品凈化步驟優(yōu)化

研究[22]表明，石墨化碳黑粉、Al2O3粉對(duì)除草劑有較強(qiáng)的吸附，不建議作為凈化吸附劑。凈化小柱HLB按通用凈化過(guò)程，經(jīng)活化、上樣、淋洗、洗脫處理后，滅草松及其代謝物回收率均較低；直接提取后稀釋有基質(zhì)效應(yīng)且對(duì)儀器有一定程度損傷。故在最優(yōu)條件提取后的溶液中加入PSA、C18、MgSO4進(jìn)行凈化，綜合參照文獻(xiàn)[23-25]和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[26-27]的通用用量添加，以滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松含量的檢出值為參考指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表4，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5、6。

表3 酸添加量對(duì)滅草松及其代謝物提取率的影響Table 3 Effect of acid addition on the extraction rate of Bentazone and its metabolites

表4 正交試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factor level table of orthogonal test mg

由表6可知，滅草松的最優(yōu)凈化方式為PSA 300 mg、C18200 mg、MgSO4200 mg；6-羥基滅草松的最優(yōu)凈化方式為PSA 200 mg、C18100 mg、MgSO4200 mg；8-羥基滅草松的最優(yōu)凈化方式為PSA 200 mg、C18100 mg、MgSO4400 mg。當(dāng)PSA添加量分別為200，300 mg 時(shí)，滅草松含量無(wú)顯著差異；當(dāng)C18添加量分別為100，200 mg時(shí)，滅草松含量變化不顯著；MgSO4作為吸水劑，對(duì)滅草松及其代謝物含量影響不顯著。綜合考慮，選擇更少的添加量試劑：PSA 200 mg、C18100 mg、MgSO4200 mg。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

試驗(yàn)使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)作用，即當(dāng)該比率為0.8～1.2時(shí)，為弱的基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)該比率<0.8時(shí)，為基質(zhì)抑制作用；當(dāng)該比率>1.2時(shí)，為基質(zhì)增強(qiáng)作用[28]。由表7可知，滅草松、6-羥基滅草松、8-羥基滅草松的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值分別為1.06，1.42，1.82，說(shuō)明滅草松具有較弱的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性影響不大，而其代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的基質(zhì)作用，即基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的干擾較大。為了消除基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，試驗(yàn)擬使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的方式進(jìn)行校準(zhǔn)，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

2.6 方法的線性范圍與檢出限

由表8可知，當(dāng)樣品濃度為0.1～100.0 μg/kg時(shí)，滅草松、6-羥基滅草松及8-羥基滅草松基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均>0.995，LOQ均能滿足GB 2763—2019中滅草松及其代謝物臨時(shí)限量檢測(cè)的要求。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal test results

表6 極差分析Table 6 Range analysis of each parameter

表7 滅草松及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)Table 7 Matrix effects of Bentazone and its metabolites

表8 滅草松及其代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和定量限Table 8 Linear equation,correlation coefficient,linear range and limit of quantification of bentazone and its metabolites

2.7 方法的精密度與準(zhǔn)確度

由表9可知，滅草松、6-羥基滅草松及8-羥基滅草松的回收率為89.6%～106.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～11.7%，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合GB/T 27404—2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范，能夠滿足滅草松及其代謝物的殘留分析要求。

表9 大米和面粉中滅草松及其代謝物的加標(biāo)回收率及精密度Table 9 Recoveries rate and precision experiment (RSDs) of Bentazone and its metabolites in rice and flour (n=6)

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

按試驗(yàn)檢測(cè)方法對(duì)20批次武漢市各大農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的市售大米和面粉樣品進(jìn)行提取檢測(cè)。結(jié)果表明，各市售大米和面粉樣品均未檢出滅草松及其代謝物殘留。

3 結(jié)論

采用優(yōu)化的QuEChERS凈化方法，通過(guò)液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大米和面粉中滅草松及其代謝物殘留量。結(jié)果表明，該檢測(cè)方法的可操作性強(qiáng)、步驟簡(jiǎn)單快捷、色譜峰在7 min內(nèi)分離效果好，準(zhǔn)確度和精密度良好，能適用于實(shí)際樣品檢測(cè)，效果理想。滅草松及其代謝物在0.1～100.0 μg/kg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法定量限為0.2 μg/kg，平均加標(biāo)回收率為89.6%～106.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～11.7%。試驗(yàn)僅針對(duì)糧谷類基質(zhì)進(jìn)行了研究，對(duì)于油料作物和油脂等基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜的農(nóng)產(chǎn)品的前處理方法也亟待開(kāi)發(fā)。后續(xù)應(yīng)加大對(duì)不同種類、地域的農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測(cè)，完善其他不同種類基質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)方法，為最大限量值地制定和法定標(biāo)準(zhǔn)方法的生成提供理論依據(jù)。