石禹，姚行，韋路絲，趙訓(xùn)曉，李妃，肖曼，王晗

海南醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，海南 ?？?571199

肝癌是目前世界上死亡率極高的癌癥之一，因?yàn)槠湓缙跓o明顯的癥狀，晚期治療困難，導(dǎo)致治療效果不佳[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，中草藥龍血竭不僅有活血化瘀的功效，同時也有抑制肝癌細(xì)胞生長的作用[2-3]，但龍血竭抑制肝癌細(xì)胞生長的機(jī)制尚不清楚?，F(xiàn)有資料表明，TLR4不單表達(dá)于免疫細(xì)胞當(dāng)中，它的沉默表達(dá)還能夠?qū)Ω伟┘?xì)胞的生長產(chǎn)生影響[1，4-5]。為此，本課題以此為切入點(diǎn)，主要探究龍血竭是否通過調(diào)控toll 樣受體4(toll-like receptor-4，TLR4)基因的表達(dá)影響肝癌細(xì)胞的生長。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 本研究所使用細(xì)胞為凍存于海南醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的人肝癌細(xì)胞系HepG2和HepG2.2.15。

1.1.2 主要試劑 龍血竭購于中國(海南博大制藥廠)，高糖DMEM購于中國(Hyclone公司)，胎牛血清購于美國(BI公司)，青鏈霉素雙抗購于中國(上海碧云天公司)，DMSO 購于美國(SIGMA公司)，CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒購于日本(DOJINDO 公司)，Eastep Super Total RNA Extraction Kit 購于美國(Promega 公司)，TransStart Tip Green qPCR SuperMix購于中國(北京全式金公司)，anti-TLR4抗體購于美國(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 培養(yǎng)肝癌細(xì)胞系HepG2 和HepG2.2.15，分別將以上兩種肝癌細(xì)胞隨機(jī)等量分為對照組和上藥組，上藥組在培養(yǎng)基中加入龍血竭，對照組僅加入等量細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 配置含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL 的DMEM 高糖培養(yǎng)基，將HepG2 細(xì)胞和HepG2.2.15 細(xì)胞置于其中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱飽和濕度下培養(yǎng)，每1～2 d傳代一次。

1.2.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測 將生長狀態(tài)至對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞和HepG2.2.15 細(xì)胞進(jìn)行消化，制備細(xì)胞懸液并計數(shù)，根據(jù)每孔4 000 個細(xì)胞的96 孔板中的細(xì)胞數(shù)量，配制濃度為 2×104個/mL 細(xì)胞懸液。向每孔加入200 μL 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 待其貼壁。細(xì)胞貼壁后，棄去96 孔板中的培養(yǎng)基，加入100 L 不同濃度(濃度梯度分別為0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL、140 μg/mL、160 μg/mL、180 μg/mL)的龍血竭培養(yǎng)基，再等待24 h。龍血竭處理24 h后，向每個孔中加入10 μL CCK-8，并置于5%CO2培養(yǎng)箱中30 min。每個孔的吸光度值在OD450下測量。測試后，將其放回37℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)反應(yīng)，培養(yǎng)4 h 后終止。以龍血竭濃度為橫坐標(biāo)，平均抑制率為縱坐標(biāo)，繪制濃度-抑制率曲線。計算龍血竭作用于細(xì)胞后在每個孔中不同濃度的抑制率。抑制率(%)=(給藥OD 值－空白組OD值)/(不給藥OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR 檢測TLR4 mRNA 表達(dá)水平 利用總RNA 提取試劑盒提取各組細(xì)胞中的總RNA，再利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以β-actin[6]為內(nèi)參，擴(kuò)增后，以 2-ΔΔCt方法計算HepG2 和 HePG2.2.15 細(xì)胞中 TLR4 mRNA 的表達(dá)。所用引物序列為：TLR4 上游，5"-AGACCTGTCCCT GAACCCTAT-3"；TLR4 下 游 ，5"-CGATGGACTTCT AAACCAGCCA-3"[7]；β-actin 上游，5"-TCCTGTGGC ATCCACGAAACT-3"；β-actin下游，5"-GAAGCATTT GCGGTGGACGAT-3"。

1.2.5 Western-blot 檢測TLR4 蛋白表達(dá)水平 用BCA 蛋白定量法提取各組細(xì)胞并進(jìn)行定量。然后經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、膜轉(zhuǎn)移和5%脫脂奶粉密封1 h。加一抗anti-TLR4抗體(1∶500)和anti-GAPDH 抗體 4℃溫育過夜。TBST 洗膜 3 次×10 min，二抗(1∶1 000)室溫溫育1 h，TBST洗膜3次×10 min，ECL 化學(xué)發(fā)光劑暗室顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)中的所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龍血竭對HepG2 細(xì)胞和HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的影響 采用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測，龍血竭對HepG2 和HepG2.2.15 細(xì)胞增殖的影響見圖1。經(jīng)24 h 不同濃度龍血竭處理的HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)，當(dāng)龍血竭濃度增加時細(xì)胞抑制率隨之增加。加入龍血竭后，HePG2、HePG2.2.15兩組細(xì)胞系生長速度明顯減慢，IC50值分別為(97.78±8.19)μg/mL和 (66.89±5.86)μg/mL。

2.2 龍血竭對HepG2 細(xì)胞和HepG2.2.15 細(xì)胞TLR4 mRNA 表達(dá)水平的影響 分別使用IC50 濃度的龍血竭處理HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞，提取各組總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時熒光定量方法檢測TLR4 mRNA的表達(dá)水平見表1。與未經(jīng)龍血竭處理的細(xì)胞相比，經(jīng)龍血竭處理的HepG2 和HepG2.2.15 細(xì)胞的TLR4 mRNA 表達(dá)水平明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 龍血竭對HepG2 細(xì)胞和HepG2.2.15 細(xì)胞中TLR4mRNA 表達(dá)的影響

2.3 Western-blot 法檢測TLR4 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平 分別使用IC50 濃度的龍血竭處理HepG2 細(xì)胞和 HepG2.2.15 細(xì)胞，Western-blot 檢測 TLR4 蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果見圖2。與未經(jīng)龍血竭處理的細(xì)胞相比，經(jīng)龍血竭處理的HepG2 和HepG2.2.15 細(xì)胞的TLR4 蛋白表達(dá)明顯降低[(0.89±0.05)vs(0.68±0.06)、(1.11±0.04) vs (0.56±0.08)]，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 龍血竭對HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)的影響

3 討論

人肝癌細(xì)胞系HepG2 來源于一位15 歲白人的肝癌組織，HepG2.2.15 細(xì)胞是由兩個頭尾相連的HBV-DNA全基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞而建立的細(xì)胞系。本文主要是以HepG2 細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞為研究對象，用CCK8 法測得龍血竭在這兩種細(xì)胞中的IC50 濃度，并采用實(shí)時熒光定量PCR 和Western-blot 技術(shù)對龍血竭通過TLR4 作用于HepG2 細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞的可能性進(jìn)行了研究。

原發(fā)性肝癌(以下簡稱肝癌)是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居惡性腫瘤第四位，肝癌病情發(fā)展極快，死亡率居惡性腫瘤第三位，被稱為“癌中之王”[8]。長期的臨床實(shí)踐表明，中醫(yī)藥可以降低肝硬化患者的肝癌發(fā)病率，它在治療肝硬化方面有很好的優(yōu)勢。OKA等[9]隨訪5 年，觀察小柴胡湯顆粒治療肝硬化的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與安慰劑對照組相比，小柴胡湯可降低肝硬化患者肝癌的發(fā)病率和病死率。中藥成分多種多樣，其作用具有多渠道、多層次的綜合效應(yīng)，也是其對復(fù)雜肝纖維化病理具有良好療效的重要基礎(chǔ)。

原始植物如龍血樹的木質(zhì)部在受到外力破壞或被微生物侵入后會分泌紅色樹脂[10]。自古以來，這種樹脂被稱為血竭，是傳統(tǒng)名貴中藥[11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明血竭具有消炎、止血、鎮(zhèn)痛[12]、止瀉、抗?jié)僛13]、抗菌、抗腫瘤等多種藥理作用，廣泛應(yīng)用于跌打損傷、外傷出血、潰瘍、瘀滯疼痛等臨床治療。在預(yù)防和治療冠心病、缺血性心臟病和高脂血癥等方面也有很好的效果[14]。劍葉龍血樹是目前國產(chǎn)血竭的主要原料[15]，同時，近年來也發(fā)現(xiàn)海南島廣泛分布的常見植物柬埔寨龍血樹也能產(chǎn)生紅色樹脂，初步臨床醫(yī)學(xué)證明海南龍血竭的藥理和臨床效果與進(jìn)口龍血竭基本相同[16]。相關(guān)研究還表明，海南龍血竭對人肝癌細(xì)胞的生長具有抑制作用[3]。本研究通過CCK8 法也證實(shí)了龍血竭能夠使肝癌細(xì)胞的生長受到抑制，抑制作用隨著龍血竭濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。

TLR4全稱為Toll樣受體，作為炎癥信號傳遞過程中的一種門戶蛋白，它在免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。研究人員發(fā)現(xiàn)，TLR4 在許多不同組織的腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)，這可能與腫瘤免疫微環(huán)境的建立和維持有關(guān)[17-19]。肝癌細(xì)胞的表面也有TLR4的表達(dá)，可能與介導(dǎo)肝癌的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)聯(lián)系[20]。通過實(shí)時熒光定理PCR 和Western-blot 分別檢測兩種肝癌細(xì)胞系中TLR4 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)龍血竭能夠明顯抑制TLR4 的表達(dá)，證實(shí)龍血竭可能通過TLR4信號通路抑制了肝癌細(xì)胞的生長。本研究驗(yàn)證了龍血竭對肝癌細(xì)胞確實(shí)起到抑制作用，并初步探討了龍血竭是否通過調(diào)控TLR4 基因?qū)Ω伟┘?xì)胞起到抑制作用。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)在肝免疫異常、炎癥反應(yīng)觸發(fā)的肝損傷、肝星狀細(xì)胞的活化及肝纖維化惡化與肝癌的發(fā)展中TLR4-MyD88-NF-κB信號通路均有重要調(diào)節(jié)作用[21]，未來可在龍血竭是否通過調(diào)控TLR4-MyD88-NF-κB信號通路抑制肝癌細(xì)胞的生長的方向進(jìn)行深入研究。

目前關(guān)于肝癌的研究很多，但能有效治愈肝癌的藥物數(shù)量仍然有限，本研究試圖通過探討龍血竭抑制肝癌細(xì)胞生長的機(jī)制，從而為肝癌的藥物治療提供新的思路，但找到徹底治愈肝癌藥物的研究仍然任重而道遠(yuǎn)。