范亞莉，洪軍，郭小英，顧錫娟，殷青寧，王珍，蒲蘭青

青海省婦女兒童醫(yī)院急診科，青海 西寧 810007

人類不同個(gè)體對新環(huán)境的遺傳學(xué)適應(yīng)是一個(gè)漫長的過程，高海拔適應(yīng)正是該過程的最好體現(xiàn)[1]。青海地區(qū)位于我國西北部，平均海拔在4 000 m以上，氧氣含量只有平原地區(qū)的40%，紫外線強(qiáng)度比內(nèi)地要高30%[2]。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)的主要功能是平衡體內(nèi)氧含量，其主要由α和β兩個(gè)亞基構(gòu)成，其中的HIF1-α亞基受缺氧調(diào)控并調(diào)節(jié)HIF-1的活性，是體內(nèi)重要的氧含量調(diào)節(jié)因子[3]。研究表明，低氧信號通路是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的重要途徑，在低氧或缺血損傷條件可阻礙HIF-1α的羥基化過程，使其穩(wěn)定性增強(qiáng)，從而發(fā)揮低氧、缺血條件下的適應(yīng)和保護(hù)作用[4]。本文就HIF-1α基因的9 個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)基因多態(tài)性與青海地區(qū)不同海拔、民族、性別和年齡人群的相關(guān)性進(jìn)行研究，為未來利用SNP多態(tài)性差異對高原地區(qū)相關(guān)個(gè)體相關(guān)疾病預(yù)防和治療提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 根據(jù)知情同意原則，以青海省西寧和玉樹地區(qū)進(jìn)行健康體檢人群作為研究對象，隨機(jī)采集2018—2020 年位于海拔2 300 m 的西寧地區(qū)(50 例)和海拔 4 000 m 的玉樹地區(qū)(100 例)的不同民族(藏族 72 例，非藏族 78 例)、不同年齡(學(xué)齡前組30 例，青少年組 120 例)和不同性別(男、女各 75 例)人群的外周血樣本。以上研究對象均在青海省居住10 年以上，本研究經(jīng)過青海省婦女兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 SNP位點(diǎn)選取及引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Hap Map數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov)中選取HIF-1α基因的 9 個(gè) SNP 位點(diǎn)(rs3783752、rs61755705、rs4899056、rs1957757、rs10873142、rs41508050、rs11549465、rs11549467和rs1802821)，引物由使用Primer5.0設(shè)計(jì)。

1.2.2 基因分析 將已提取的DNA 及試劑從-20℃冰箱取出后置于室溫下解凍，振蕩混勻，短暫離心。將Custom Taqman?探針(40×)、LightCycler?480預(yù)混液(2×)、無DNase 水按說明配好后分裝至384 孔板中，每孔 4 μL，按順序?qū)? μL DNA 模板加入相應(yīng)孔中。貼好貼膜，刮平，板式離心機(jī)2 000 r/min 離心1 min。使用Roche LC480Ⅱ型熒光定量PCR 儀，按照：95℃ 10 min，95℃ 10 s退火、60℃延伸45個(gè)循環(huán)的設(shè)置，掃描讀取9個(gè)SNP位點(diǎn)的探針信號，選擇Genotyping進(jìn)行等位基因分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)比較各因素兩種對象中對應(yīng)SNP位點(diǎn)的基因型表達(dá)差異。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各群體中9 個(gè)SNP 位點(diǎn)基因型分布 對HIF-1α基因9 個(gè)SNP 基因型進(jìn)行比較分析后發(fā)現(xiàn)，SNP 基 因 型 rs3783752、rs61755705、rs4899056、rs10873142、rs41508050、rs11549465 和 rs11549467 在民族、區(qū)域、年齡和性別四個(gè)方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但其中 rs61755705 在 150 例樣本中為純合子，皆為GG基因型；rs41508050在所有樣本中為純合子，皆為CC型；rs1802821在在民族、區(qū)域、年齡和性別四個(gè)方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，且在150 例樣本中都為AA 基因型。而rs1957757 和rs11549465分別在年齡和性別中比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

2.2 各群體中9個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因分布 對青海西寧和玉樹地區(qū)藏族和非藏族、學(xué)齡前和青少年以及不同性別之間群體中HIF-1α基因9 個(gè)SNP 位點(diǎn)使用Genotyping 進(jìn)行等位基因分型檢驗(yàn)和分析，見表 2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，9 個(gè) SNP 的等位基因中，SNP 位點(diǎn) rs3783752、rs61755705、rs4899056、rs10873142、rs41508050、rs11549467 和rs1802821 在民族、區(qū)域、年齡和性別方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而SNP 位點(diǎn)rs1957757 和 rs11549465 在年齡和性別中比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 HIF-1α基因SNP基因型在不同群體中的分布比較(例)

表2 HIF-1α基因SNP等位基因在不同群體中的分布比較(例)

3 討論

HIF-1α廣泛表達(dá)于多個(gè)物種的各組織細(xì)胞中，研究表明，HIF-1α基因缺失的小鼠胚胎會因大腦、心臟和血管系統(tǒng)的發(fā)育異常而在懷孕中期死亡，說明其在正常發(fā)育過程中具有重要作用[5-6]。HIF-1α在常氧條件下很快會被降解，而低氧條件會促進(jìn)其與β亞基結(jié)合形成HIF-1復(fù)合物，從而促進(jìn)和保護(hù)機(jī)體對低氧環(huán)境的適應(yīng)能力[7]。HIF-1α在人類染色體上編碼基因的位置為14q21-24，具有14個(gè)內(nèi)含子和15個(gè)外顯子[8-9]。研究表明，HIF-1α在不同海拔引起的不同低氧環(huán)境中表現(xiàn)出選擇作用，這種作用與多種疾病如大腦神經(jīng)元損傷等有著密切關(guān)系。

本研究根據(jù)我國多民族人群HIF-1α的基因多態(tài)性特點(diǎn)，結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)，最終選取了9 個(gè)有代表性的SNP 位點(diǎn)(rs3783752、rs61755705、rs4899056、rs1957757、rs10873142、rs41508050、rs11549465、rs11549467 和rs1802821)。結(jié)果顯示，在西寧和玉樹地區(qū)、藏族和漢族、青少年和學(xué)齡前以及不同性別四組中，rs61755705、rs41508050 和rs1802821 三個(gè)位點(diǎn)在150 例樣本中均為純合子，分別為 GG、CC 和 AA 基因型。SNP 位點(diǎn)rs1957757 和rs11549465 等位基因與基因型在年齡和性別中具有顯著性差異，說明該位點(diǎn)等位基因與年齡和性別因素具有相關(guān)性。李晟等[9]的研究結(jié)果表明，HIF-1α的rs4899056和rs10873142 SNP位點(diǎn)的變異與一氧化碳中毒后中樞神經(jīng)脫髓鞘損傷有關(guān)，從而影響HIF蛋白的功能，但HIF-1α的rs4899056和rs10873142兩個(gè)SNP位點(diǎn)在本研究的四組中并未表現(xiàn)出相關(guān)性，而在正常組中無變化的rs1957757，在本研究中卻表現(xiàn)出了性別和年齡組中的差異，提示低氧環(huán)境差異可能對HIF1-α基因有選擇作用。

青海常住居民對高原環(huán)境的適應(yīng)有著獨(dú)特的生理學(xué)特征。本課題組前期的研究表明，在青海玉樹地區(qū)，不同性別、不同年齡和不同民族兒童的淋巴細(xì)胞亞群分布存在差異[10]。以往針對高海拔地區(qū)人群的遺傳學(xué)研究主要為EPAS1和EGLN1，該兩種基因的多態(tài)性對藏族人群高海拔適應(yīng)具有促進(jìn)作用，研究表明，這種適應(yīng)作用與該基因影響藏族人群的血紅蛋白濃度密不可分[2]。而EGLN1是HIF-1α的上游基因，當(dāng)其在低氧或其他因素所致的基因表達(dá)量改變時(shí)，也會影響下游HIF-1α的低氧應(yīng)答，從而通過缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia induced factor,HIF)促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)信號通路中的相關(guān)低氧信號蛋白(hypoxia pathway protein，HPP)，最終促進(jìn)機(jī)體在高海拔環(huán)境下的低氧適應(yīng)[4]。

綜上所述，青海地區(qū)HIF-1α基因多態(tài)性與年齡和性別有相關(guān)性。但本文尚有不足：(1)難以獲得更多的民族和年齡組的樣本，造成樣本量偏小；(2)缺乏HIF-1α上下游相關(guān)重要基因的研究，造成研究內(nèi)容不夠系統(tǒng)；(3)缺少平原地區(qū)(0 海拔)研究數(shù)據(jù)作為對照。建議后期做更大的樣本和更完善的對照指標(biāo)，進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。