劉超斌 李快樂 謝 熙 黃惠娟 王 萍 洪新如④

(福建省婦幼保健院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦四科,福州 350001)

免疫性疾病是兒童常見病，以哮喘最為常見。近20年我國兒童哮喘的患病率持續(xù)升高，全國城市14歲以下兒童哮喘的累積患病率為1.09%，2010年上升為3.02%[1]。免疫性疾病是內(nèi)部遺傳因素與外部環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。在諸多不良環(huán)境因素中，空氣污染危害較為顯著。在常規(guī)監(jiān)測的空氣污染物中，細(xì)顆粒物(fine particulate matter,PM2.5)因粒徑小、成分復(fù)雜、毒性成分多，對健康危害最為顯著[2]。我國是空氣污染較為嚴(yán)重的國家，《中國環(huán)境狀況公報》顯示，2017年全國338個地級及以上城市中有239個城市空氣污染超過GB3095-2012標(biāo)準(zhǔn)(Ⅰ、Ⅱ級標(biāo)準(zhǔn)年均值分別為15、35 μg/m3，日均值為35、75 μg/m3)，部分地區(qū)頻發(fā)霧霾加重了污染程度；以PM2.5污染為主的天數(shù)占重度及以上污染天數(shù)的74.2%，因此，PM2.5為首要污染物[3]。盡管福州市的空氣質(zhì)量相對潔凈，但其PM2.5濃度年均值也達(dá)到44～58 μg/m3，已超過GB3095-2012，是發(fā)達(dá)國家城市一般水平的2～4倍[4,5]。

鑒于大氣污染無時不有、無處不在，其不良健康影響已成為世界范圍內(nèi)的公共健康問題，PM2.5對兒童哮喘的影響更是成為關(guān)注焦點[6]。研究表明，PM2.5暴露與兒童和青少年哮喘發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。一項針對10篇相關(guān)文獻(xiàn)的Meta分析顯示，PM2.5濃度短期內(nèi)上升可導(dǎo)致兒童哮喘住院人數(shù)增加，其導(dǎo)致的發(fā)作風(fēng)險高于可吸入顆粒物(PM10)[8]。嬰幼兒由于各系統(tǒng)和器官發(fā)育不完善，極易受環(huán)境中各種毒性物質(zhì)的侵害。研究顯示，圍產(chǎn)期空氣污染物暴露與兒童期哮喘發(fā)病及加重相關(guān)，改善空氣質(zhì)量有助于降低PM2.5對兒童哮喘的不良作用[9]。研究表明，小鼠胚胎期柴油機顆粒物(主要成分為PM2.5)暴露可導(dǎo)致其出生后對致敏原的反應(yīng)性升高[10]。為探討個體早期環(huán)境水平PM2.5暴露對免疫系統(tǒng)的影響，本研究在大鼠出生后使其吸入福州地區(qū)大氣PM2.5建立暴露模型，觀察PM2.5暴露對卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏或未致敏幼鼠部分免疫功能相關(guān)指標(biāo)的影響，包括血漿IL-4、IL-5和IFN-γ、肺GATA結(jié)合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)和T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(T-box expressed in T cells,T-bet)及脾臟miRNA-146a/b等的水平變化，并探討其作用機制，闡明個體早期不良大氣環(huán)境暴露對哮喘發(fā)生的影響及作用機制、兒童哮喘防控及大氣污染指標(biāo)的再修訂提供參考[11，12]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD大鼠,雌性40只，體質(zhì)量183～239 g，雄性20只，體質(zhì)量325～400 g，購自福建醫(yī)科大學(xué)的實驗動物中心，合格證號：SCXK[閩]2012-0001。雌鼠實驗前在SPF級飼養(yǎng)室中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2主要試劑和設(shè)備 RNA提取試劑盒(Invitr-ogen)；OVA(Sigma)；RNA貯存液(Omega)；PCR試劑盒和TRIzol試劑(Invitrogen)；PM2.5暴露系統(tǒng)由俄亥俄州立大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院提供，暴露點距交通主干道25 m、距地面9 m，氣流量300～350 L/min。外部氣體導(dǎo)入暴露柜前通過顆粒物切割器濾除氣動直徑>2.5 μm的顆粒物，僅PM2.5被導(dǎo)入柜內(nèi)(與環(huán)境PM2.5濃度相同)，導(dǎo)入對照柜的外部氣體再經(jīng)高效顆粒物阻攔裝置(HEPA)過濾全部顆粒物[13]。便攜式PM2.5檢測器(CW-HAT200，宜蘭環(huán)保工程)；垂直凝膠電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)；光學(xué)顯微鏡(Olympus)；實時定量PCR儀(ABI)；光譜分析儀(北京博暉)；多功能酶標(biāo)儀(TECAN)。

1.2方法

1.2.1大鼠分組、PM2.5暴露和OVA致敏 大鼠每籠按雌∶雄=2∶1交配，次日清晨行陰道分泌物涂片檢查，見陰栓者為妊娠第0天。受孕雌鼠單籠飼養(yǎng)、未孕鼠繼續(xù)交配過夜。本組雌鼠2 d內(nèi)均成功受孕，置于對照柜中飼養(yǎng)以消除出前空氣PM2.5的影響。孕鼠隨機分為過濾空氣-生理鹽水組(FA-NS)、PM2.5-NS組、FA-OVA組和PM2.5-OVA組，每組10只。各組孕鼠于妊娠第21～22天自然分娩。幼鼠出生后第0～27天置于暴露柜中連續(xù)PM2.5暴露，同期對照鼠置于對照柜喂養(yǎng)，溫度(23.5±1)℃、相對濕度(65±10)%，12/12 h晝夜節(jié)律照明，攝食、飲水不限。暴露裝置進氣口處空氣PM2.5濃度值采用移動式PM2.5檢測器檢測，實驗期間每天08:30、11:30和16:30各檢測1次，取均值并與環(huán)境監(jiān)測站同時間監(jiān)測值進行比較。幼鼠出生后第9、15天分別腹腔注射OVA濃度為 0.25 μg/μl的氫氧化鋁凝膠200 μl，第24～26天霧化吸入1% OVA 30 min，1次/d誘導(dǎo)過敏。未行致敏處理的幼鼠給予等量氫氧化鋁凝膠。動物實驗遵照中華人民共和國國家科學(xué)技術(shù)委員會“實驗動物管理條例”規(guī)定，并經(jīng)福建省婦幼保健院醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2標(biāo)本收集及預(yù)處理 各組大鼠于第27天吸入麻醉后行安樂死。心內(nèi)穿刺抽血，于含EDTA·2Na抗凝管中離心后取血漿。分離肺臟用于GATA3和T-bet含量檢測；分離脾臟置于RNA貯存液中用于miRNA-146a/b檢測。以母鼠為樣本單位，將每窩鼠的血漿、肺臟或脾臟組織經(jīng)預(yù)處理后合并為1份樣本保存于-70℃待測。

1.2.3血漿炎癥因子檢測 采用夾心雙抗ELISA法檢測血漿IL-4、IL-5和IFN-γ水平，按照試劑盒說明書操作。

1.2.4Western blot檢測肺組織GATA3、T-bet含量 組織樣本經(jīng)總蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗和二抗反應(yīng)后PVDF轉(zhuǎn)膜、顯影，圖像處理系統(tǒng)檢測各電泳條帶灰度值，比較各組轉(zhuǎn)錄因子含量差異。

1.2.5RT-qPCR檢測脾miRNA-146a/b水平 引物序列見表1，委托上海生工技術(shù)公司合成。以GAPDH為內(nèi)參。提取樣品總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別按miRNA-146a/b擴增要求設(shè)定循環(huán)反應(yīng)條件，于PCR儀中擴增。采用SYBR?Green法進行qPCR反應(yīng)，2-ΔΔCt法計算。

表1 基因引物序列Tab.1 Sequences of gene primer

2 結(jié)果

2.1吸入暴露點PM2.5水平和大鼠一般狀況 大鼠暴露期間，暴露裝置進氣口周圍PM2.5實測濃度為11.6～53.1 μg/m3，平均濃度為1.2 μg/m3，與同時期福州市5個監(jiān)測點“楊橋西路”的監(jiān)測值(31.8 μg/m3)接近，該監(jiān)測點與暴露點距離最短。研究期間孕鼠、幼鼠全部存活，每窩9～15只。

2.2血漿炎癥相關(guān)因子水平 PM2.5-NS組、FA-OVA組、PM2.5-OVA組血漿IL-4水平較FA-NS組顯著升高(P=0.017、0.001、0.001)，PM2.5-OVA組較PM2.5-NS或FA-OVA組顯著升高(P=0.001、0.011)，PM2.5-OVA組與FA-OVA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.011)。FA-OVA或PM2.5-OVA組血漿IL-5水平較FA-NS組(P=0.001、0.002)或PM2.5-NS組(P=0.002、0.007)顯著升高，PM2.5-NS組與FA-NS組、PM2.5-OVA組與FA-OVA組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。FA-OVA組血漿IFN-γ水平較FA-NS、PM2.5-NS或PM2.5-OVA組顯著升高(P=0.005、0.002、0.017)，其余3組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組幼鼠血漿炎癥相關(guān)因子水平Tab.2 Levels of inflammation-related factors in plasma of offspring

2.3肺GATA3和T-bet蛋白水平 FA-OVA或PM2.5-OVA組肺GATA3水平較FA-NS組顯著升高(P=0.014、0.001)，PM2.5-OVA較PM2.5-NS顯著升高(P=0.005)， 與FA-OVA組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。FA-OVA、PM2.5-OVA組T-bet水平較FA-NS組(P=0.001)或PM2.5-NS組(P=0.001)、PM2.5-OVA組較FA-OVA組(P=0.049)均顯著降低，PM2.5-NS組與FA-NS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1、表3。

圖1 GATA-3和T-bet蛋白電泳條帶Fig.1 Electrophoresis strips of GATA-3 and T-bet proteins

表3 各組幼鼠肺組織GATA3、T-bet蛋白含量Tab.3 GATA3 and T-bet protein levels in lung tissue of offspring in each

2.4脾miRNA-146a/b表達(dá)變化 PM2.5-OVA組miRNA-146a表達(dá)較FA-NS組(P=0.001)、PM2.5-NS組(P=0.001)和FA-OVA組(P=0.037)顯著升高，F(xiàn)A-OVA組較PM2.5-NS組顯著升高(P=0.042)，PM2.5-NS組與FA-NS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.733)。FA-OVA或PM2.5-OVA組miRNA-146b表達(dá)較FA-NS組(P=0.007、0.001)或PM2.5-NS組(P=0.006、0.001)顯著升高，PM2.5-NS組與FA-NS組(P=0.960)、PM2.5-OVA組與FA-OVA組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.293)，見表4。

表4 各組幼鼠脾miRNA-146a/b表達(dá)水平Tab.4 miRNA-146a/b expression levels in spleen tissue of offspring in each

3 討論

本研究在大鼠出生后早期吸入特定地區(qū)環(huán)境濃度的大氣PM2.5，觀察其對幼鼠免疫系統(tǒng)是否存在負(fù)面效應(yīng)。PM2.5暴露使未致敏幼鼠血漿IL-4水平升高、使OVA致敏幼鼠血漿IL-4水平和脾組織miRNA-146a表達(dá)進一步升高、血漿IFN-γ水平降低。表明出生后早期PM2.5暴露可加重OVA致敏個體免疫系統(tǒng)損傷；未接觸OVA的個體也可使特定免疫功能指標(biāo)發(fā)生異常改變，提示環(huán)境PM2.5暴露可誘發(fā)或加重機體免疫功能異常，可能是導(dǎo)致或加重哮喘和其他免疫性疾病的有害環(huán)境因素之一。

免疫因子水平的改變可破壞免疫系統(tǒng)Th1、Th2動態(tài)平衡，導(dǎo)致免疫反應(yīng)異常，后者是免疫系統(tǒng)的調(diào)控和效應(yīng)細(xì)胞，在正常生理條件下處于動態(tài)平衡。IFN-γ是Th1的標(biāo)志性細(xì)胞因子，IL-4、IL-5是Th2的特征性細(xì)胞因子，可表征Th1、2的免疫應(yīng)答狀況[14]。研究表明，PM2.5暴露導(dǎo)致成年大鼠氣道反應(yīng)性增高，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進IL-4、IL-5分泌[15]。另有研究表明PM2.5暴露可導(dǎo)致成年大鼠循環(huán)血液中單個核細(xì)胞IL-4水平升高，但I(xiàn)FN-γ水平未見明顯變化[16]。本研究表明，出生后早期PM2.5暴露不但可使IL-4水平顯著升高，還可顯著降低IFN-γ水平，提示個體發(fā)育早期PM2.5暴露對免疫系統(tǒng)具有不良效應(yīng)，比成年期暴露更為嚴(yán)重，可能與個體早期免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善、更易受不良環(huán)境因素影響有關(guān)。IFN-γ水平降低、IL-4水平升高使IFN-γ/IL-4比值更加偏離其平衡點，提示同時存在Th1功能不足和Th2功能亢奮。胎兒免疫系統(tǒng)存在生理性免疫抑制效應(yīng)，Th1/Th2偏低可抑制母-胎免疫反應(yīng)，該狀況在出生后仍可持續(xù)一段時間，提示在出生后早期個體免疫系統(tǒng)較為脆弱。PM2.5暴露使IFN-γ和IL-4水平變化更為顯著，進一步破壞Th1/Th2的功能平衡，對免疫系統(tǒng)的傷害也更為明顯。個體早期PM2.5暴露可導(dǎo)致免疫功能異常、免疫性疾病易感性升高[17]。本研究中，不論是未致敏還是致敏幼鼠，PM2.5暴露后IL-5水平均未見明顯變化，其在PM2.5暴露中的作用可能較小。

GATA3和T-bet在體內(nèi)的功能復(fù)雜多樣，在維持免疫系統(tǒng)正常功能中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，通過與IL-4、IFN-γ等炎癥因子的基因啟動子相結(jié)合，可調(diào)節(jié)Th1、Th2增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)因子的分泌，是維持Th1/Th2平衡和穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子[18]。本研究表明，出生后早期PM2.5暴露可下調(diào)OVA致敏幼鼠脾臟T-bet因子表達(dá)，GATA3因子表達(dá)在OVA致敏或未致敏幼鼠均有升高趨勢，可導(dǎo)致Th1/Th2平衡失調(diào)。結(jié)合本研究結(jié)果和相關(guān)免疫調(diào)節(jié)機制可以認(rèn)為，出生后早期PM2.5暴露影響幼體免疫系統(tǒng)作用的途徑可能是通過上調(diào)T-bet、下調(diào)GATA3因子表達(dá)、破壞Th1/Th2動態(tài)平衡，下調(diào)Th1相關(guān)因子IFN-γ表達(dá)、上調(diào)Th2相關(guān)因子IL-4表達(dá)，導(dǎo)致個體早期免疫系統(tǒng)功能上調(diào)異常，促發(fā)哮喘和其他免疫性疾病。

脾miRNA-146a/b表達(dá)檢測結(jié)果顯示，PM2.5暴露可進一步上調(diào)OVA致敏幼鼠miRNA-146a表達(dá)，但未致敏幼鼠的表達(dá)無明顯改變，表明在免疫系統(tǒng)已受損的情況下，miRNA-146a易受PM2.5暴露影響而發(fā)生改變；miRNA-146b則僅對OVA致敏產(chǎn)生反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IFN-γ等炎癥因子可誘導(dǎo)支氣管平滑肌細(xì)胞表達(dá)miRNA-146a/b[19,20]；miRNA-146a/b參與機體過敏反應(yīng)，與哮喘等免疫相關(guān)疾病的發(fā)生密切相關(guān)[21,22]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146a是免疫系統(tǒng)及炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，與免疫性疾病的關(guān)系比miRNA-146b更為密切[19]。本研究結(jié)果顯示脾miRNA-146a/b表達(dá)發(fā)生變化，提示miRNA-146a在PM2.5暴露損傷效應(yīng)中可能發(fā)揮更大作用，與上述研究結(jié)果類似，但其在PM2.5暴露損傷中的作用機制需要進一步研究。

流行病學(xué)研究表明個體早期空氣PM2.5暴露與哮喘及其他免疫性疾病的發(fā)生相關(guān)。歐洲的一項研究表明，出生后早期空氣污染物暴露可增加兒童和青少年哮喘發(fā)生的風(fēng)險，減少空氣污染物可降低兒童哮喘發(fā)病率[23]。國內(nèi)研究也有類似報道。Zhang等[24]在山東萊蕪開展的調(diào)查表明PM2.5與兒童咳嗽變異性哮喘發(fā)病有關(guān)；Chen等[9]針對臺灣17 931例居住點與大氣監(jiān)測站距離小于1 km學(xué)齡期兒童的調(diào)查也顯示大氣PM2.5暴露與兒童哮喘發(fā)病相關(guān)。母鼠妊娠期氣道滴注大氣顆粒物可使幼鼠出生后早期出現(xiàn)免疫系統(tǒng)功能異常[25]。本實驗使大鼠吸入環(huán)境濃度PM2.5，比實驗室條件下設(shè)定濃度的PM2.5暴露更能真實地復(fù)制早期個體環(huán)境大氣PM2.5的暴露效應(yīng)。實驗點的空氣PM2.5濃度實測值為31.2 μg/m3，接近同時間監(jiān)測站的監(jiān)測值31.8 μg/m3，表明實驗點的PM2.5暴露水平可較好地反映福州地區(qū)個體暴露平均水平。但本研究也存在不足，在暴露的模擬方面，為使研究條件一致，設(shè)計為24 h持續(xù)暴露，暴露時程雖已設(shè)置較長(出生后連續(xù)暴露4周)，但實際暴露在胚胎發(fā)育甚至更早期的配子發(fā)育階段已持續(xù)存在；對照柜僅濾除PM2.5，其他污染物(如O3等氣態(tài)污染物)的聯(lián)合效應(yīng)未排除，觀察指標(biāo)也有待進一步完善，包括同時針對母體的觀察。盡管如此，本研究顯示出生后早期環(huán)境水平PM2.5暴露對免疫功能指標(biāo)存在不良影響。鑒于福州地區(qū)的空氣PM2.5水平低于全國多數(shù)城市，個體早期較低水平PM2.5暴露導(dǎo)致的不良健康效應(yīng)應(yīng)引起重視。嬰幼兒時期在類似環(huán)境下的PM2.5暴露是否存在不良效應(yīng)有待進一步研究。