吳美麗 周 鷹 崔玉寶

(無(wú)錫市兒童醫(yī)院,無(wú)錫 214023)

腐食酪螨(Tyrophagusputrescentiae)遍布全世界，它常見于許多受污染的食品中，如小麥粉、小麥胚芽、奶酪、麥片、干果、蘑菇[1-2]。它可以同時(shí)耐受高溫和低溫，在潮濕的環(huán)境中快速生長(zhǎng)，并已成為亞洲家庭性害蟲[3-4]。腐食酪螨引起的過(guò)敏主要發(fā)生在農(nóng)民與糧食工人身上，被認(rèn)為與這些人的呼吸道疾病有關(guān)[5]。屋塵螨在大多情況下與腐食酪螨共存，它們可能會(huì)引起伴隨的超敏反應(yīng)，但對(duì)腐食酪螨的單過(guò)敏反應(yīng)很難辨別[6-7]。目前僅對(duì)腐食酪螨過(guò)敏的患者也已經(jīng)被報(bào)道[8]。此外，有研究表明腐食酪螨在IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)中起重要作用，并且被腐食酪螨污染的食物可能導(dǎo)致全身過(guò)敏反應(yīng)[9-10]。目前至少已有20多種與IgE結(jié)合的腐食酪螨過(guò)敏原組分被分離出來(lái)，其中只有8個(gè)腐食酪螨的過(guò)敏原組分全長(zhǎng)序列被報(bào)道，Tyr p 2、Tyr p 3、Tyr p 10、Tyr p 13、Tyr p 28、Tyr p 34、Tyr p 35、Tyr p 36。然而，腐食酪螨的許多致敏成分迄今為止還沒有明確闡明，尤其是那些具有蛋白酶活性的。本研究采用基因工程技術(shù)對(duì)腐食酪螨過(guò)敏原組分5(Tyr p 5)進(jìn)行基因克隆并用生物信息學(xué)軟件對(duì)其分子特征進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料NdeⅠ 酶、EcoRⅠ 酶、TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒、TakaRa PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthrsis Kit 試劑盒、高保真PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒、PrimeSTAR@HS DNA、DNA純化試劑盒、DNA連接試劑盒、E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α均購(gòu)自TaKaRa公司；pET-28a(+)由Novagen公司生產(chǎn)。TP3000 PCR儀購(gòu)自TaKaRa公司，Mupid電泳儀購(gòu)自Advance-Bio Co.Ltd公司，ImageMaster@VDS電泳成像裝置購(gòu)自Pharmacia Biotech公司。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank (AY800 360)公布的Tyr p 5 CDS區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，并加入NdeⅠ/EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，由寶生物工程(大連)有限公司合成如下:上游引物F：5′-GGAATTCCATATGATGAAGTTCGTCATCGCCCTC-3′；下游引物R：5′-CCGGAATTCTTAGACCTTGATGGCGTTCA-3′。

1.2.2總RNA提取 解剖鏡下挑取腐食酪螨500只(不帶培養(yǎng)基)，將其迅速轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨螨蟲，研磨過(guò)程中不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀，后續(xù)采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒上的操作說(shuō)明提取總RNA。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄 采用TakaRa PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthrsis Kit 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA合成。首先進(jìn)行去除基因組DNA反應(yīng)，根據(jù)以下配比配制反應(yīng)體系：5×g DNA Eraser Buffer 2 μl，gDNA Eraser 1 μl，Total RNA 1 μg，RNase Free dH2O補(bǔ)充反應(yīng)至10 μl，42℃ 孵育2 min。反應(yīng)結(jié)束后，置于冰上冷卻。之后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：上述步驟的反應(yīng)液 10 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μl，RT Primer Mix 1 μl，5×緩沖液4 μl，RNase Free dH2O 4 μl，反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.2.4PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系為：5×PrimeSTAR緩沖液10 μl，dNTP混合液4 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，模板1 μl，PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5 μl，超純水32.5 μl，總體積為50 μl。設(shè)定的PCR擴(kuò)增條件如下：98℃預(yù)變性2 min，98℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸(1 kb/min)，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.2.5克隆載體構(gòu)建、 陽(yáng)性克隆篩選及鑒定 PCR擴(kuò)增完之后進(jìn)行產(chǎn)物回收，對(duì)Tyr p 5和pET28a(+)進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下：10×H buffer 5 μl，質(zhì)粒 35 μl，NdeⅠ2.5 μl，EcoRⅠ2.5 μl，ddH2O 5 μl，總體積為50 μl。反應(yīng)條件如下：37℃反應(yīng) 6 h。雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行再回收。將切膠回收的產(chǎn)物進(jìn)行酶聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：10×T4 buffer 1 μl，pET28a雙酶切回收 2 μl，Tyr p 5雙酶切回收 2 μl，T4連接酶 0.5 μl，ddH2O 4.5 μl。4℃酶聯(lián)反應(yīng)8 h轉(zhuǎn)化至DH5α中，涂布于含Kan50的LB平板上。挑取轉(zhuǎn)化子至kan50抗性的LB試管中。菌落PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。同時(shí)提取陽(yáng)性克隆子質(zhì)粒，送至金斯瑞生物有限公司測(cè)序。

1.2.6重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 本研究通過(guò)查閱文獻(xiàn)了解相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-Tyr p 5加入感受態(tài)E.coliBL21 ，經(jīng)卡那平板篩選，挑取陽(yáng)性菌落過(guò)夜培養(yǎng)[11]。吸取1 ml菌液接種到100 ml新鮮的含有卡那抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600= 0.5，加入IPTG至終濃度為0.10 mmol/L，30℃下180 r/min誘導(dǎo)2 h。將誘導(dǎo)后的重組菌株4℃下12 000 r/min 離心10 min收集菌體，用Tris-HCl(pH7.5)緩沖液洗滌菌體兩次后重懸于15 ml的Tris-HCl(pH7.5)緩沖液中。在冰浴條件下超聲波破碎至細(xì)胞懸浮液變澄清透明，然后將破碎液4℃，12 000 r/min 離心40 min除去細(xì)胞碎片，獲得的上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，將上清液以低速Ni柱上樣進(jìn)行親和層析純化蛋白。依次加入不同濃度咪唑洗脫緩沖液對(duì)接合在Ni-NTA上的蛋白進(jìn)行梯度洗脫，流速控制為1 ml/min，分管收集，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證后，合并較純樣品。將合并獲得的目的重組蛋白洗脫液轉(zhuǎn)入透析袋中，用透析緩沖液透析12 h脫鹽，其間更換透析緩沖液數(shù)次。

1.2.7生物信息學(xué)分析 用 ExPaSy(www.expasy.org)、 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站上的在線工具進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1腐食酪螨過(guò)敏原Tyr p 5基因擴(kuò)增結(jié)果 TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒提取腐食酪螨總RNA后，擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，約見一條約417 bp的條帶，與理論值相符合(圖1A)。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-Tyr p 5進(jìn)行NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，酶切回收結(jié)果顯示在400 bp處有明顯基因條帶(圖1B)，與Tyr p 5理論基因大小相符。

2.2Tyr p 5蛋白的表達(dá)和純化 經(jīng)IPTG小量誘導(dǎo)后，可以看出Tyr p 5理論分子質(zhì)量為17.98 kD，同時(shí)Tyr p 5在沉淀中表達(dá)(圖2A)。 將純化后的Tyr p 5蛋白SDS-PAGE 電泳鑒定，結(jié)果顯示在分子量約17 kD處有明顯的蛋白條帶(圖2B)，與Tyr p 5蛋白理論分子質(zhì)量基本相符且純度較高。

圖1 Tyr p 5 PCR產(chǎn)物(A)和pET-28a-Tyr p 5(B)雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agm gel electrophoresis of PCR product Tyr p 5 (A)and recombinanat plasmids pET-28a-Tyr p 5(B)by NdeⅠ plus EcoRⅠNote:M.DNA marker；1.pET-28a-Tyr p 5 plasmid digested with restriction enzyme.

圖2 腐食酪螨Tyr p 5蛋白小量誘導(dǎo)SDS-PAGE電泳圖(A)和腐食酪螨Tyr p 5蛋白SDS-PAGE電泳圖(B)Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of small amount induced Tyr p 5 recombinant protein(A)and SDS-PAGE electrophoresis of Tyr p 5 recombinant protein (B)Note:M.Marker；FT.Outflow；W.50 μmol/L microns imidazole；E.150 μmol/L microns imidazole.

2.3核酸序列測(cè)定、氨基酸序列推導(dǎo)、結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè) 將初篩的2個(gè)陽(yáng)性重組菌通過(guò)搖菌、質(zhì)粒提取并純化。使用BcaBEST引物M13-47、RV-M對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序，去除原始測(cè)序結(jié)果5′和3′端的酶切位點(diǎn)后，從起始密碼子ATG到終止密碼子TAA共417 bp，與參考序列(AY800360)同源性為99.8%，Tyr p 5由158個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為17 521.29 Da，分子式為C786H1271N225O222S3，等電點(diǎn)為8.71，摩爾消光系數(shù)為1 490，具體氨基酸組成見表1，其中推測(cè)出帶負(fù)電荷氨基酸(Asp+Glu) 21個(gè)，占13.3%，帶正電荷氨基酸(Arg+Lys) 23個(gè)，占14.5%(表1)。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為26.24，屬穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為101.33，為脂溶蛋白；總平均疏水指數(shù)為 -0.128，表明其具有一定親水性。通過(guò)Expasy的Protscale在線對(duì)Tyr p 5蛋白進(jìn)行疏水性的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白疏水性的最大值為3.033，最小值為 -3.433，分值越大說(shuō)明疏水性越強(qiáng)。該蛋白質(zhì)存在4個(gè)高分值(Scale>1.5)峰，分別分布在20～40、50～70、95～115、130～150等區(qū)域；而5個(gè)低分值(Scale<0)峰位于53、70、90、119、148氨基酸位點(diǎn)附近，這些區(qū)域?qū)俑哂H水性。由于氨基酸殘基表現(xiàn)為親水性的區(qū)域較多，整體預(yù)測(cè)表現(xiàn)為較強(qiáng)的親水性(圖3)， 其結(jié)果與Protparam軟件預(yù)測(cè)一致。

表1 Tyr p 5氨基酸組成結(jié)果

圖3 Tyr p 5 親水性分析(ProtScale)Fig.3 Hydrophilic analysis of Tyr p 5 by ProtScale

圖4 Tyr p 5信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果(SignalIP 5.0軟件)Fig.4 Prediction results of signal peptide(LSTM networks)of Tyr p 5 by SignalIP 5.0 software

圖5 Tyr p 5跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果(TMpred軟件)Fig.5 Transmembrane domain prediction for Tyr p 5 by TMpred

信號(hào)肽位于1～36AA處(圖4)，TMpred軟件預(yù)測(cè)跨膜區(qū)位于23～33AA(圖5)，TMHMM軟件預(yù)測(cè)Tyr p 5蛋白不存在跨膜螺旋區(qū)(圖6)。用SOPMA軟件預(yù)測(cè)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明Tyr p 5蛋白的氨基酸序列由75.32%的α螺旋、1.9%的β轉(zhuǎn)角和22.78%的無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。α螺旋為Tyr p 5蛋白的主要折疊形式(圖7)。

2.4同源序列比對(duì)及分子進(jìn)化樹構(gòu)建 將上述推導(dǎo)出的Tyr p 5氨基酸序列輸入NCBI，用BLASTp選出螨類同源序列棉蘭皺皮螨(Suidasiamedan-ensis，GenBank AAX34059.1)、家食甜螨(Glycyhagusdoesticus，GenBank AAQ54606.1)、害嗜鱗螨(Lepidogly-phusdestructor，GenBank Q9U5P2.1)、粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae，GenBank AAX340 48.1)、橢圓食粉螨(Aleuroglyphusovatus，GenBankAAX34060.1)、熱帶無(wú)爪螨(Blomiatropicalis，GenBank ABH06359.1)、屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus，GenBank XP 027199623.1)，并進(jìn)行序列比對(duì)(圖8)，可以得出腐食酪螨與棉蘭皺皮螨過(guò)敏原第5組分相似率為52.68%(表2)，上述蜱螨類氨基酸序列構(gòu)建出的分子進(jìn)化樹中,腐食酪螨與棉蘭皺皮螨聚成一簇(圖9)。

圖6 Tyr p 5跨膜螺旋區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果(TMHMM軟件)Fig.6 Transmembrane helix region prediction for Tyr p 5 by TMHMM software

圖7 Tyr p 5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(SOMPA)Fig.7 Second structure prediction for Tyr p 5 by SOMPA software

圖8 螨類過(guò)敏原第5組分序列比對(duì)(DNAMAN 5.2.2)Fig.8 Alignment of group 5 allergen among different mite-species by DNAMAN 5.2.2 software

表2 腐食酪螨過(guò)敏原Tyr p 5及蜱螨類同源序列的相似度和覆蓋率

圖9 腐食酪螨過(guò)敏原Tyr p 5及蜱螨類同源序列的分子進(jìn)化樹Fig.9 Phylogenetic tree constructed for Tyr p 5 and other group 5 allergen or cysteine proteases from ticks or mites

3 討論

腐食酪螨屬于粉螨科(Acaridae)、食酪螨屬(Tyrophagus)，是世界性倉(cāng)儲(chǔ)物品和食用菌重要害菌，該螨食性復(fù)雜，通常大量發(fā)生于脂肪和蛋白質(zhì)含量高的儲(chǔ)藏食品中，給人類生活造成了很多不便之處[12-14]。此外，該螨還可攜帶和傳播霉菌，可引起過(guò)敏癥狀，臨床表現(xiàn)為支氣管哮喘、過(guò)敏性皮炎和結(jié)膜炎等[15]。一項(xiàng)針對(duì)韓國(guó)和歐洲過(guò)敏性疾病患者的調(diào)查報(bào)告稱，腐食酪螨致敏性范圍約為22～43%。此外約有30%的過(guò)敏性患者血清對(duì)腐食酪螨表現(xiàn)出陽(yáng)性反應(yīng)[9,16-17]。因此深入探討過(guò)敏原各組分的免疫學(xué)、分子生物學(xué)特性將對(duì)腐食酪螨過(guò)敏性疾病的過(guò)敏原診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)。

對(duì)Tyr p 5進(jìn)行基因克隆表達(dá)純化，并根據(jù)GenBank公布的Tyr p 5基因序列，由RT-PCR擴(kuò)增手段獲得其cDNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其全長(zhǎng)為417 bp的條帶，推測(cè)其由158個(gè)氨基酸組成，其分子質(zhì)量為17521.29Da，等電點(diǎn)為8.71，編碼細(xì)胞外親水蛋白。其信號(hào)肽位于1-36AA處，跨膜區(qū)位于23-33AA，同時(shí)用TMHMM軟件預(yù)測(cè)出Tyr p 5蛋白不存在跨膜螺旋區(qū)，如果去除信號(hào)肽序列，其活性部位相對(duì)分子質(zhì)量為13770.91Da。本研究結(jié)果為了解Tyr p 5分子生物學(xué)功能提供理論依據(jù)，為Tyr p 5蛋白的研究增添新的資料。

將獲得的Tyr p 5氨基酸序列輸入NCBI網(wǎng)站上的Blastp工具中以搜索蜱螨類同源序列的第5組分，整理成FASTA格式，用DNAMAN5.2.2軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)并計(jì)算其相似度和覆蓋率，結(jié)果表明腐食酪螨與棉蘭皺皮螨過(guò)敏原第5組分相似率為52.68%。同時(shí)使用其Mega_X_10.0.5軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹，其結(jié)果表明腐食酪螨與棉蘭皺皮螨聚成一簇。棉蘭皺皮螨屬于粉螨科、皺皮螨屬的儲(chǔ)藏物螨類，在臺(tái)灣地區(qū)是僅次于腐食酪螨的重要儲(chǔ)藏食品害螨，其分子進(jìn)化樹結(jié)果與現(xiàn)有的形態(tài)學(xué)分類系統(tǒng)一致。

綜上所述，本項(xiàng)研究成功地實(shí)現(xiàn)了腐食酪螨過(guò)敏原Tyr p 5的原核表達(dá)，通過(guò)生物信息學(xué)分析初步揭示了Tyr p 5及其編碼的蛋白產(chǎn)物的基本特性，表明其具有重要的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步生產(chǎn)基因工程過(guò)敏原應(yīng)用于臨床診斷奠定了基礎(chǔ)。