陳德勝，張 晨，宋國瑞，劉子歌，郭鳳英，李 燕

髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)制性脊柱炎合并強(qiáng)直髖、股骨頭無菌性壞死等髖部病變是骨科常見關(guān)節(jié)疾患，臨床上通常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、步態(tài)異常，功能障礙等[1-2]。人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療髖關(guān)節(jié)中晚期病變最為理想的治療方法[3]。而無菌性松動(dòng)導(dǎo)致的假體周圍骨溶解是術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[4]。假體部件互相摩擦不斷磨損從而產(chǎn)生磨損顆粒在骨-假體的界膜組織內(nèi)激活巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致釋放出腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，引起無菌性炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞增殖、成熟、活化，引起假體周圍骨溶解反應(yīng)[5-6]，使得假體松動(dòng)、下沉，因而必須行人工關(guān)節(jié)翻修手術(shù)。磨損顆粒如何引起無菌性炎性反應(yīng)，從而出現(xiàn)假體周圍骨溶解是當(dāng)前有待于研究的熱點(diǎn)。有研究證實(shí)[7]，磨損顆?？梢疬m應(yīng)性免疫反應(yīng)，主要由巨噬細(xì)胞參與的固有免疫反應(yīng)。適應(yīng)性免疫與固有免疫在磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解過程中有重要的參與作用，與巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其趨化因子調(diào)控的信號(hào)通路關(guān)系密切。Toll樣受體(TLR4)與之關(guān)系密切[8]。本文在構(gòu)建鈦顆粒刺激小鼠植骨氣囊誘導(dǎo)骨溶解動(dòng)物模型時(shí)，觀察TLR4抑制劑TAK-242(瑞沙拖維)對于鈦顆粒刺激小鼠植骨氣囊誘導(dǎo)骨溶解的影響，以尋求預(yù)防和延緩無菌性松動(dòng)的方法和手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選用磨損顆粒的鈦顆粒購于美國Alfa Aesar公司，顆粒要求的大小平均直徑小于20 μm。內(nèi)毒素檢測試劑盒購于廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司，TLR4選擇性抑制劑TAK-242(瑞沙拖維)購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，TLR4及TNF-α一抗抗體購于美國Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠體重在28～35 g，10～12周齡，健康狀況良好，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房完成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)審批通過，符合動(dòng)物倫理要求。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 磨損顆粒的內(nèi)毒素去除處理和檢測：鈦顆粒置于烘烤燥箱內(nèi)在180 ℃下焙烤6 h，浸泡于70%乙醇，再離心、沉淀，反復(fù)多次進(jìn)行循環(huán)此操作，加PBS液洗滌、離心、干燥，通過紫外線持續(xù)照射消毒，配制成鈦顆粒懸液放置于4 ℃溫度下。鈦顆粒懸液需經(jīng)過內(nèi)毒素檢測，按照內(nèi)毒素檢測試劑盒說明書的程序進(jìn)行測試后備用。

1.3.2 小鼠air pouch氣囊植骨動(dòng)物模型建立方法：將小鼠腹腔麻醉成功后，小鼠背部消毒備皮，注射2 mL無菌空氣形成氣囊；之后連續(xù)每天向小鼠背部氣囊中注射0.5 mL無菌空氣，至第7天air pouch氣囊形成；另外隨機(jī)選同屬同齡小鼠處死，取出顱骨骨片，分成兩部分，每部分可以做一個(gè)植骨供體。切開氣囊，植入小鼠顱骨骨片，縫合切口。

1.3.3 動(dòng)物模型分組和處理：將60只SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為對照組(A組)、模型組(B組)和TLR4抑制劑組(C組)，每組20只。另選30只SPF級(jí)BALB/c同屬同齡雌性小鼠，作為磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解動(dòng)物模型植骨的供體，每只小鼠可提供兩片用于植骨的顱骨骨片，大小約0.5 cm×0.25 cm×0.1 cm。對照組(A組):植骨后小鼠氣囊內(nèi)立即注射0.1 mL PBS液。每日1次腹腔注射0.1 mL生理鹽水，持續(xù)14d。模型組(B組):植骨后小鼠氣囊內(nèi)立即注射 0.1 mL處理好的鈦顆粒懸液，每日1次腹腔注射0.1 mL生理鹽水，持續(xù)14 d。TLR4抑制劑組(C組)：植骨后小鼠氣囊內(nèi)立即注射 0.1 mL處理好的鈦顆粒懸液，每日1次腹腔注射200 mg/kg TLR4抑制劑 TAK-242，持續(xù)14 d。之后將3組動(dòng)物在同一時(shí)間段處死，取出小鼠顱骨及其囊壁組織(植骨氣囊復(fù)合體)。取出的小鼠顱骨及其囊壁組織經(jīng)12.5% EDTA脫鈣液脫鈣，至少需要2周；經(jīng)自動(dòng)脫水機(jī)處理后進(jìn)行石蠟包埋，制成蠟塊。用切片機(jī)切皮，每片4 μm，撈片到載玻片上。

1.3.4 蘇木素-伊紅(H-E)染色：切片先后置入不同濃度的二甲苯、無水乙醇及酒精中浸泡，之后用蒸餾水洗滌；加蘇木素染色，自來水沖洗，鹽酸酒精分化，自來水沖洗，用0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗；置入伊紅染液染色；置入不同濃度酒精、無水乙醇及二甲苯脫水透明；中性樹膠封片。

1.3.5 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：將切片二甲苯脫蠟后，依次經(jīng)過不同濃度乙醇脫水，雙蒸水沖洗；丙酮溶液固定，雙蒸水沖洗；放入暗盒內(nèi)，加入新鮮配制 TRAP 染液，37 ℃水浴鍋避光孵育 1 h；雙蒸水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，中性樹膠封片。

1.3.6 免疫組織化學(xué)染色：切片在68 ℃中烤2 h 后入不同濃度二甲苯、無水乙醇浸泡，自來水、蒸餾水沖洗；3% H2O2孵育，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液煮沸予抗原修復(fù)，滴加羊血清于玻片封閉，PBS液沖洗，滴加一抗(TLR4，TNF-α)孵育，4 ℃ 過夜，PBS沖洗，滴加酶標(biāo)二抗，37 ℃ 孵育，PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白稀釋液，37 ℃ 孵育，滴加DAB液靜置數(shù)分鐘，置于顯微鏡下觀察顯色，適時(shí)終止，沖洗，蘇木素液復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，碳酸鋰返藍(lán)，不同濃度的乙醇、二甲苯浸泡，中性樹脂封片。3組免疫組化染色切片通過顯微鏡下觀察結(jié)果并進(jìn)行圖像采集，每張免疫組化切片隨機(jī)選取5個(gè)表達(dá)的高倍鏡(10×40)視野，需確保每張圖像的位置以及背景亮度一致。將采集圖像運(yùn)用Image-Pro軟件進(jìn)行分析，確定統(tǒng)一的測定標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算分析后得到平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1 蘇木素-伊紅(H-E)染色：H-E染色結(jié)果，對照組中未見鈦顆粒浸潤，植骨氣囊復(fù)合體周圍組織見少量的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等，炎癥反應(yīng)不明顯，植骨塊骨面平滑且光整；模型組植骨氣囊復(fù)合體的囊壁增厚，周圍鈦顆粒浸潤，有中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等浸潤，炎性反應(yīng)顯著，植骨塊表面存在侵蝕，骨面不光整，部分有缺損表現(xiàn)。TLR4抑制劑組亦有鈦顆粒浸潤，植骨氣囊復(fù)合體周圍氣囊組織厚度與模型組比相對較薄，周圍有少量炎性細(xì)胞，植骨骨塊表面侵蝕反應(yīng)減輕，比較平整。

2.2 抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)：對照組見少量的TRAP染色陽性細(xì)胞，染色較淺，陽性染色面積?。荒Ｐ徒MTRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)目比較多，陽性染色面較大，而且染色深；TLR4抑制劑組TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)目與模型組比較少(圖1,目錄后)。TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)，模型組TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)目(18.105±1.641)個(gè)顯著高于對照組(8.278±0.9515)個(gè)(P<0.05)，而TLR4抑制劑組TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)目(13.102±1.532)個(gè)相對于模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)目比較

2.3 小鼠氣囊組織中TLR4免疫組織化學(xué)染色：對照組植骨氣囊復(fù)合體周圍囊壁組織中可見TLR4染色陽性細(xì)胞，陽性染色相對較淺；模型組植骨氣囊復(fù)合體周圍囊壁組織中可TLR4染色陽性細(xì)胞數(shù)目多，陽性表達(dá)比較高；而TLR4抑制劑組中TLR4染色陽性細(xì)胞數(shù)目及陽性表達(dá)與模型組相比而言都減少(圖2，目錄后)。模型組TLR4陽性表達(dá)(0.113±0.010)顯著高于對照組(0.042±0.012)(P<0.05)，而TLR4抑制劑組TLR4陽性表達(dá)(0.069±0.012)相對于模型組(P<0.05)顯著減少，見表2。

表2 3組TLR4免疫組化表達(dá)比較

2.4 小鼠氣囊組織中TNF-α免疫組織化學(xué)染色：對照組中可見少量的TNF-α染色陽性細(xì)胞，陽性染色較淺；而模型組TNF-α染色陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增多，陽性表達(dá)較高；TLR4抑制劑組中TNF-α染色陽性細(xì)胞數(shù)目及陽性表達(dá)均較少(圖3-圖4，目錄后)。

3組免疫組化結(jié)果運(yùn)用Image-Pro軟件進(jìn)行分析后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下，模型組TNF-α陽性表達(dá)(0.131±0.204)顯著高于對照組(0.033±0.112)(P<0.05)，而TLR4抑制劑組TNF-α陽性表達(dá)(0.080±0.085)相對于模型組(P<0.05)顯著減少，見表3。

表3 3組TNF-α免疫組化表達(dá)比較

3 討論

假體周圍骨溶解導(dǎo)致的無菌性松動(dòng)是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體松動(dòng)、下沉、失敗最主要的影響因素。因此，患者常需要經(jīng)歷多次反復(fù)人工關(guān)節(jié)翻修手術(shù)，給患者個(gè)人造成嚴(yán)重的痛苦，也給社會(huì)帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9]。目前研究表明[5]，磨損顆粒刺激人工關(guān)節(jié)的界膜組織巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等會(huì)引起一系列無菌性炎性反應(yīng)的生物學(xué)改變，激活破骨細(xì)胞，出現(xiàn)假體周圍骨溶解的人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)。

參與上述病理改變的破骨細(xì)胞分化、增值、成熟由多個(gè)信號(hào)通路如 NF-κB、ERK、JNK、p38MAPK、PI3K/AKT 等參與，通過單一或者協(xié)同作用來調(diào)控破骨細(xì)胞骨溶解作用。而Toll樣受體(TLR)或其他模式識(shí)別受體信號(hào)通路可以介導(dǎo)活化的NF-κB、ERK、JNK、p38MAPK信號(hào)通路而調(diào)控?zé)o菌性炎性反應(yīng)[10]。

TLR是一種最早被提出能識(shí)別細(xì)菌和其他病原體分子相關(guān)的一種模式識(shí)別受體(PRR)，被用來識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMP)以及損傷相關(guān)分子模式(DAMP)，在宿主防御入侵的病原體過程中有關(guān)鍵性作用[11]。TLR是所有PRR中最具特征的代表。TLR屬于I型跨膜糖蛋白(type I transmembrance protein)，能識(shí)別病原微生物進(jìn)化中保守分子，如脂多糖、肽聚糖、病原微生物等的核酸。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)有TLR1～10，10個(gè)TLR受體。TLR2和TLR4的配體能識(shí)別大部分革蘭氏菌相關(guān)的配體，包含了絕大多數(shù)對人體致病的微生物類別，在人體TLR家族中最為重要[12]。TLR4 是第一個(gè)被識(shí)別的Toll樣受體，可以特異性識(shí)別并結(jié)合革蘭陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖，從而激活核因子κB(NF-κB)，進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α、IL-6 等炎性因子的激活，引起一系列內(nèi)源性免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織器官損傷。人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后各關(guān)節(jié)部件之間摩擦產(chǎn)生的磨損微粒能夠通過髓樣分化蛋白88(MyD88)依賴途徑激活巨噬細(xì)胞表面的TLR，啟動(dòng)活化的NF-κB信號(hào)通路等從而釋放各種促炎因子，激活破骨細(xì)胞分化成熟，從而造成骨代謝的失衡，導(dǎo)致骨溶解的形成[13-14]。TLR在人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)的發(fā)病過程中有著極其重要的作用。此外，TNF-α是機(jī)體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵炎性介質(zhì)，當(dāng)磨損顆粒刺激巨噬細(xì)胞后，TNF-α協(xié)同巨噬細(xì)胞釋放多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生及釋放，發(fā)揮“級(jí)聯(lián)放大”的作用，在整個(gè)炎癥反應(yīng)中，TNF-α有著重要的始動(dòng)作用[15]。此外，作為炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子，TNF-α也能激活TLR2和TLR4，并進(jìn)一步促進(jìn)釋放多種炎性因子[16]。

本實(shí)驗(yàn)是在小鼠磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解模型基礎(chǔ)上，選用TLR4抑制劑TAK-242作用于該動(dòng)物模型。病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，TLR4抑制劑TAK-242可以減輕鈦顆粒刺激小鼠入air pouch植骨氣囊中炎性反應(yīng)；TRAP染色結(jié)果也證實(shí)，TLR4抑制劑TAK-242可以減少鈦顆粒刺激后破骨樣細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)目及陽性表達(dá)范圍。這些組織形態(tài)學(xué)改變表明：通過下調(diào)TLR信號(hào)通路，磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解模型中的炎性因子數(shù)目減少，炎性反應(yīng)在一定程度上得到了減輕。在免疫組化中TLR4抑制劑TAK-242作用下植骨氣囊復(fù)合體中TLR4和TNF-α的陽性表達(dá)明顯降低，說明下調(diào)TLR信號(hào)通路，可使活化的NF-κB信號(hào)通路等作用降低，也進(jìn)一步減少了促炎性因子的釋放，影響了破骨細(xì)胞分化成熟，使得骨溶解的作用減弱。與此同時(shí)，經(jīng)下調(diào)TLR信號(hào)通路，TNF-α協(xié)同巨噬細(xì)胞釋放多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生及釋放的作用也受到抑制，同時(shí)TNF-α對TLR2和TLR4激活作用減弱，釋放多種炎性因子作用也相應(yīng)減弱。

綜上所述，TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在無菌性炎性骨溶解中發(fā)揮了重要作用。通過對TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的MyD88依賴途徑的調(diào)控，可能對NF-κB信號(hào)通路等激活作用減弱，阻止了炎性因子釋放，抑制破骨細(xì)胞分化成熟，從而延緩炎性骨溶解發(fā)生、發(fā)展。