于 芝，吳茜萍，焦華杰，汪 婷，徐卉芳

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是最常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病率隨著年齡的增長而增加[1]。該疾病會影響大多數(shù)65歲以上的人，是老年人行動能力受損的主要肌肉骨骼原因[2]。膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是骨關(guān)節(jié)炎最常見的類型[3]。右美托咪定(DEX)是一種快速作用的-2腎上腺素能受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等多種功效，目前被臨床廣泛應(yīng)用[4-5]，同時DEX兼具有抗炎作用，DEX在KOA的治療具有潛在應(yīng)用價值，但目前尚無相關(guān)文獻報道。為進一步明確右美托咪定在KOA治療中的價值及其機制，筆者設(shè)計了本次研究，旨在為DEX治療KOA的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本次研究于2019年1-12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)完成。人關(guān)節(jié)軟骨細胞購自Scien Cell公司。細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天(C1062S)，蛋白抗體p-Smad3(bs-2225R)購自Bioss公司，蛋白抗體Bcl(12789-1)、Bax(50599-2)、Beclin(11306-1)、TGF-β1(21898-1)、Smad3(25494-1-AP)、P62(18420-1)、LC3(14600-1)以及HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(SA00001-2)購自Proteintech公司。

1.2 軟骨細胞培養(yǎng)：人關(guān)節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)條件：37 ℃培養(yǎng)箱，5% CO2；細胞培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)液+10%FBS+1%雙抗，細胞融合達到70%左右進行傳代。

1.3 細胞實驗分組及處理：取對數(shù)生長期人關(guān)節(jié)軟骨細胞分為正常對照組(n=3)、模型組(n=3)、DEX治療組(n=3)。正常對照組細胞正常培養(yǎng)，不做任何特殊處理；模型細胞加入10 ng/mL脂多糖體外構(gòu)建關(guān)節(jié)炎軟骨細胞炎癥模型[6]；DEX治療組細胞加入0.01 μmol/L DEX，30 min后加入10 ng/mL脂多糖。

1.4 細胞CCK8增殖檢測：3組細胞分別接種于96孔板中，每空104個細胞，每組3個重復(fù)，分別于接種后的24、48、72 h加入10% CCK8工作液，37 ℃孵育2 h 后，酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度值，記錄數(shù)據(jù)。

1.5 細胞凋亡檢測：0.25%胰酶消化，離心(300 g，5 min)，PBS洗滌收集各組細胞，70%乙醇固定30 min，PBS離心洗滌3次，加入凋亡檢測工作液，4 ℃避光反應(yīng)30 min后，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。每組樣本重復(fù)3次。

1.6 Western-blot凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達檢測：0.25%胰酶消化，300 g離心5 min。PBS洗滌收集各組細胞，裂解液裂解細胞，BAC測定總蛋白濃度，在95 ℃ 加熱變性。SDS凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂乳室溫封閉1 h，4 ℃一抗[Bcl(1∶3 000)、Bax(1∶5 000)、LC3(1∶2 000)、P62(1∶5 000)、Beclin(1∶3 000)、Smad3(1∶1 000)、TGF-β1(1∶3 000)]孵育過夜。第二日PBST洗膜后，室溫二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗，1∶10 000)孵育1h，ECL曝光檢測，實驗重復(fù)3次。采用ImageJ軟件對蛋白表達進行相對定量分析。

2 結(jié)果

2.1 3組細胞增殖率檢測情況：CCK83組細胞增殖檢測，模型組隨著時間的增加細胞數(shù)量逐漸減少，模型組72 h 細胞OD值較正常對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=84.50，P<0.05)，而DEX組72 h 細胞OD值較模型組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=28.64，P<0.05)，見表1。

表1 3組細胞不同時間增殖率比較(OD值,

2.2 3組細胞凋亡、自噬檢測：正常對照組細胞凋亡率為(2.10±0.10)%，模型組為(22.30±0.36)%，DEX組為(12.07±0.38)%，3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=32.40，P<0.05)。模型組細胞與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=93.51，P<0.05)；DEX組與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=44.08，P<0.05)；模型組與DEX組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=33.90，P<0.05),見圖1(封三)。

凋亡相關(guān)蛋白表達檢測，模型組與正常對照組比較，抗凋亡蛋白Bcl2蛋白表達下調(diào)，Bax凋亡蛋白表達上調(diào)；DEX組與模型組比較Bcl2表達下調(diào)，而BAX蛋白表達上調(diào)。

自噬相關(guān)蛋白表達檢測，模型組與正常對照組比較，LC3-Ⅱ蛋白、Beclin-1蛋白表達下調(diào)，p62蛋白表達上調(diào)；DEX組與模型組比較，LC3-Ⅱ蛋白、Beclin-1蛋白表達上調(diào)，p62蛋白表達上調(diào)。

2.3 3組細胞TGF-β/Smad通路蛋白表達檢測：Western-blot法檢測3組細胞TGF-β/Smad通路蛋白表達，結(jié)果顯示模型組細胞TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表達較正常對照組表達上調(diào)；DEX組TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表達較模型組表達下調(diào)，見圖2(封三)。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是最常見的關(guān)節(jié)炎，是導(dǎo)致成年患者殘疾的主要原因[7]，其中膝關(guān)節(jié)是受影響最嚴重的關(guān)節(jié)。KOA形態(tài)學(xué)變化以軟骨退行性變、破壞,軟骨下骨硬化、囊變及滑膜炎癥等為主,臨床主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)積液甚至是關(guān)節(jié)功能受限[8]。相關(guān)文獻資料顯示，外傷、炎癥等多種因素導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡、功能障礙是KOA發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[9]，而TGF-β,IGF以及 Wnt 等信號通路在這一過程中起到了重要作用[10]。

細胞自噬和凋亡分別控制細胞內(nèi)的細胞器和蛋白質(zhì)以及有機體內(nèi)細胞的更替，許多應(yīng)激途徑依次誘導(dǎo)細胞自噬和凋亡。自噬是一個高度保守的真核細胞循環(huán)過程，自噬通過細胞質(zhì)、蛋白質(zhì)和大分子的降解以及分解產(chǎn)物的回收利用，正常情況下自噬的基礎(chǔ)水平保證了衰老和受損細胞器的生理更新，在細胞存活和維持中發(fā)揮重要作用，應(yīng)激條件下自噬的激活是細胞層面的適應(yīng)性反應(yīng)，而這一過程的功能障礙導(dǎo)致了許多人類疾病的發(fā)生[11]。細胞自噬與細胞凋亡之間的復(fù)雜相互作用決定了組織損傷的程度和疾病的進展，一般來說，自噬阻斷了細胞凋亡的誘導(dǎo)，而凋亡的激活則阻斷了自噬過程。

本研究通過構(gòu)建軟骨細胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)模型組軟骨細胞凋亡率顯著增加，而細胞自噬受到抑制。Western-blot法進一步檢測發(fā)現(xiàn)，模型組TGF-β1、Smad3及p-Smad3蛋白較對照組表達上調(diào)，表明模型組TGF-β/Smad通路被激活；而DEX組較模型組比較細胞凋亡率下降，細胞自噬水平增加，TGF-β/Smad通路受到抑制，表明DEX通過抑制軟骨細胞TGF-β/Smad信號通路促進細胞自噬而抑制細胞凋亡。

綜上所述，DEX通過下調(diào)TGF-β/Smad信號通路促進人軟骨細胞自噬而抑制炎癥誘導(dǎo)的細胞凋亡，表明DEX在延緩KOA發(fā)展及治療方面具有潛在的應(yīng)用價值。