高標(biāo)，馬凡尼，李相磊

1開(kāi)封市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，河南 開(kāi)封 475000

2河南大學(xué)淮河醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 開(kāi)封 475007

微管相關(guān)蛋白4（microtubule-associated protein 4，MAP4）可表達(dá)于除神經(jīng)外的全身組織，其主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和穩(wěn)定微管[1]。研究表明，MAP4可影響食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲能力，進(jìn)而影響患者預(yù)后[2]。另有研究表明，MAP4與膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲有關(guān)[3]。肺腺癌是一種非小細(xì)胞肺癌，常發(fā)生于女性及不抽煙者中[4]。大部分肺腺癌起源于支氣管黏膜上皮，少數(shù)起源于大支氣管黏液腺[5]。在所有類(lèi)型的肺癌中，肺腺癌的發(fā)病率較低，發(fā)病年齡相對(duì)較小，早期肺腺癌無(wú)明顯的臨床癥狀，腫瘤生長(zhǎng)較為緩慢[6]。肺腺癌的侵襲和遷移是一個(gè)涉及多個(gè)基因的復(fù)雜過(guò)程，目前肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全研究清楚。本研究探討了MAP4對(duì)肺腺癌細(xì)胞遷移、侵襲、增殖、凋亡的影響，旨在為研究肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年8月至2020年8月開(kāi)封市中心醫(yī)院收治的肺腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為肺腺癌；②初診患者；③術(shù)前未接受放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：病歷資料不完整。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究納入66例患者。其中，男51例，女15例；年齡24～80歲；有吸煙史48例；中高分化45例，低分化21例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例。收集肺腺癌患者的肺腺癌組織標(biāo)本66例和癌旁組織標(biāo)本57例。

1.2 細(xì)胞、試劑與儀器

人肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）。DMEM、胎牛血清培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶細(xì)胞消化液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，細(xì)胞凍存液、脂質(zhì)體3000試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，BCA蛋白定量試劑盒、電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、蛋白提取試劑盒、CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海睿安生物科技有限公司，MAP4抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。CO2培養(yǎng)箱、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司，顯微成像系統(tǒng)購(gòu)自日本Nikon公司，UV2000分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)UNICO公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)MAP 4蛋白的表達(dá)情況及結(jié)果判定

將固定好的組織標(biāo)本脫蠟至水，于抗原修復(fù)液中浸泡10 min煮沸，自然冷卻后采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，滴加3%過(guò)氧化氫溶液孵育10 min，PBS沖洗3次，血清封閉10 min，棄血清，一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鏡下觀察。細(xì)胞質(zhì)被染為棕黃色或棕褐色視為陽(yáng)性。采用半定量法進(jìn)行評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)評(píng)分相加，0～3分為陰性，其余為陽(yáng)性。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

采用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度超過(guò)80%時(shí)，采用胰蛋白酶消化，離心棄上清，采用細(xì)胞凍存液重懸，轉(zhuǎn)至無(wú)菌管中，保存于-80℃。向細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC質(zhì)粒和siRNA-MAP4質(zhì)粒作為siNC組和siMAP4組，操作步驟依據(jù)脂質(zhì)體3000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測(cè)MAP 4蛋白表達(dá)

依據(jù)蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），然后轉(zhuǎn)膜，于室溫下采用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h，采用MAP4一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min，采用HRP標(biāo)記的二抗于室溫下孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min，采用ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，采用BandScan 4.0軟件分析條帶灰度。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力

將細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h形成單層細(xì)胞，采用無(wú)菌槍頭進(jìn)行均勻的“一”字劃痕，洗去漂浮細(xì)胞，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，于顯微鏡下觀察24 h和48 h的細(xì)胞遷移情況。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力

采用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞饑餓培養(yǎng)6 h，將Matrigel膠按1∶4的比例稀釋?zhuān)赥ranswell上室中加入40 μl，均勻覆蓋，孵育2 h，消化后離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至 5×105/ml，將 200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室中加入500 μl培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48 h，采用棉簽擦去小室上層的基質(zhì)膠及內(nèi)層細(xì)胞，將小室取出后，倒置風(fēng)干，采用95%乙醇固定5 min，向24孔板中加入500 μl的1%結(jié)晶紫溶液，置入小室，浸膜于其中，室溫放置5 min后取出，PBS清洗后置于載玻片上，封片，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.8 CCK- 8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

將轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×104/ml，吸取100 μl細(xì)胞懸液至96孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每孔加入10 μl CCK-8溶液，混合均勻后，37℃孵育2 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度（optical density，OD）值。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

采用膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘 化丙啶（propidium iodide，PI）雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，收集轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞進(jìn)行重懸，將細(xì)胞密度調(diào)整至 1×106/ml，將100 μl細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至 5 ml流式管中，加入Annexin V-FITC及PI各5 μl，混勻后室溫避光孵育15 min，加入400 μl緩沖液，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織和癌旁組織中MAP 4表達(dá)情況的比較

肺腺癌組織中MAP4的陽(yáng)性表達(dá)率為56.06%（37/66），明顯高于癌旁組織的19.30%（11/57），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.371，P＜0.01）。（圖1）

圖1 肺腺癌組織和癌旁組織中MAP 4的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×400）

2.2 兩組肺腺癌細(xì)胞中MAP 4相對(duì)表達(dá)量的比較

siMAP4組肺腺癌細(xì)胞中MAP4的相對(duì)表達(dá)量為（0.29±0.08），低于siNC組肺腺癌細(xì)胞的（0.60±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.723，P＜0.05）。（圖 2）

圖2 Western blot檢測(cè)兩組肺腺癌細(xì)胞中MAP 4的表達(dá)情況

2.3 兩組肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的比較

siMAP4組肺腺癌細(xì)胞的24 h和48 h未遷移區(qū)域分別為（78.25±10.02）%和（62.47±7.26）%，分別明顯高于siNC組肺腺癌細(xì)胞的（43.56±8.31）%和（31.32±4.54）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.616、4.889，P＜0.01）。siMAP4組肺腺癌細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)目為（102±5）個(gè)，明顯少于siNC組肺腺癌細(xì)胞的（210±11）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.481，P＜0.01）。（圖3、圖4）

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組肺腺癌細(xì)胞的遷移能力

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組肺腺癌細(xì)胞的侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×400）

2.4 兩組肺腺癌細(xì)胞增殖能力的比較

轉(zhuǎn)染后1～5天，siMAP4組肺腺癌細(xì)胞的OD450值與同時(shí)間點(diǎn)siNC組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 轉(zhuǎn)染后 1～ 5天兩組肺腺癌細(xì)胞的OD450值（±s）

表1 轉(zhuǎn)染后 1～ 5天兩組肺腺癌細(xì)胞的OD450值（±s）

時(shí)間第1天第2天第3天第4天第5天1.93±0.12 3.56±0.37 4.41±0.32 4.22±0.21 4.19±0.19 1.92±0.11 3.43±0.28 4.27±0.33 4.20±0.23 4.03±0.25 siNC組siMAP4組

2.5 兩組肺腺癌細(xì)胞凋亡情況的比較

siMAP4組肺腺癌細(xì)胞的凋亡率為（34.82±7.65）%，與siNC組肺腺癌細(xì)胞的（39.27±8.34）%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖5）

3 討論

圖5 Annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測(cè)兩組肺腺癌細(xì)胞的凋亡情況

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[7]。非小細(xì)胞肺癌占全部肺癌的80%，其中最常見(jiàn)的是肺腺癌[8]。肺腺癌生長(zhǎng)較慢，但具有較高的浸潤(rùn)性和破壞性，并且極易出現(xiàn)血行轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[9]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)是肺腺癌患者最主要的死亡原因[10]。近年來(lái)隨著醫(yī)療技術(shù)和理念的進(jìn)步，腫瘤的分子靶向治療得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[11]。MAP4屬于微管相關(guān)蛋白（microtubule-associated protein，MAP）家族成員，首先發(fā)現(xiàn)于小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，對(duì)裝配、穩(wěn)定微管具有重要作用[12]。研究表明，下調(diào)MAP4的表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高化療效果[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中MAP4mRNA與stathminmRNA的比值高于正常肺組織，說(shuō)明MAP4對(duì)診斷肺癌具有指示作用[14]。

微管由微管蛋白及微管相關(guān)蛋白組成，是構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要成分之一[15]。微管的功能主要受MAP的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞收縮、運(yùn)動(dòng)及物質(zhì)運(yùn)輸中具有重要作用[16]。由于MAP4可提高微管強(qiáng)度、聚集微管，而微管在細(xì)胞分裂和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程中又具有至關(guān)重要的作用，因此MAP4可能與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲具有一定關(guān)聯(lián)[17]。研究報(bào)道，MAP4水平是檢查前列腺癌及判斷前列腺惡性腫瘤侵襲性的潛在指標(biāo)[18]。還有研究證實(shí)，MAP4與口腔鱗狀細(xì)胞癌的惡性生物學(xué)行為相關(guān)[19]。本研究檢測(cè)了肺腺癌組織和癌旁組織中MAP4的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中MAP4的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，提示MAP4高表達(dá)可能與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

肺腺癌的遷移和侵襲是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程，與多種原癌基因及抑癌基因相關(guān)[20]。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞A549中MAP4的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，下調(diào)MAP4的表達(dá)可抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。這可能是由于MAP4具有調(diào)節(jié)微管的作用，MAP4水平降低導(dǎo)致微管強(qiáng)度減弱，進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞的分裂和運(yùn)動(dòng)能力降低，遷移和侵襲能力受到抑制。CCK-8和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，MAP4表達(dá)水平對(duì)肺腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡無(wú)顯著影響，這可能是因?yàn)镸AP4不參與A549細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)信號(hào)通路的激活。

綜上所述，MAP4在肺腺癌組織中高表達(dá)，MAP4高表達(dá)可提高肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，本研究暫未發(fā)現(xiàn)MAP4對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，但具體機(jī)制還有待更深入的研究。