湯 悅 朱 葉 姜璟 王 瑞 沈 楨 鄭 珊 陳 功 張崇凡

膽道閉鎖(BA)臨床表現(xiàn)為新生兒期進行性加重的梗阻性黃疸，隨著肝內(nèi)膽汁淤積的加重，患兒逐漸出現(xiàn)肝纖維化、肝衰竭表現(xiàn)，若未經(jīng)及時診治，多數(shù)患兒在2歲以內(nèi)死亡[1]。由于新生兒黃疸病因眾多，快速、準確地診斷和治療BA可改善患兒的預后[2]。

目前新生兒BA篩查手段主要有大便比色卡[3,4]和足跟血片質(zhì)譜膽紅素檢測[5]，BA術(shù)前診斷方法主要為肝穿刺病理活檢和十二指腸引流液，實驗室血清標志物為基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)[6,7]。

2016年起復旦大學附屬兒科醫(yī)院(我院)開始制定BA臨床實踐指南，由我院普外科和臨床指南制作和評價中心組成BA臨床實踐指南工作組，運用GRADE指南制定策略，對BA臨床實踐指南的6個方面選題(篩查、診斷、肝門空腸吻合術(shù)、術(shù)后綜合管理、術(shù)后并發(fā)癥的治療、預防接種)中的26個問題進行系統(tǒng)文獻檢索、篩選和偏倚風險評價，并形成推薦意見。本文針對BA篩查(2項指標)和診斷(4項指標)行系統(tǒng)評價及Meta分析。

1 方法

1.1 文獻檢索策略 文獻檢索策略、BA及非BA診斷金標準、文獻篩選原則、文獻偏倚風險及臨床適用性評價方法已由本研究團隊2020年8月發(fā)表在《基于超聲、肝膽核素顯像和磁共振膽胰管成像影像學檢查診斷BA準確性研究的系統(tǒng)評價和Meta分析》一文中[8]。

提取內(nèi)容包括：(1)文題；(2)發(fā)表年份；(3)國家；(4)研究的納入和排除標準；(5)研究場所；(6)診斷金標準；(7)待測指標，①大便比色卡：大便比色卡版本、收集時間、隨訪方式、觀察人員、回收率；②足跟血片膽紅素：膽紅素及其篩查截斷值，kasai手術(shù)及其月齡；③肝穿刺活檢：標本類型、病理醫(yī)生資質(zhì)，主要觀察指標(6項)：肝內(nèi)膽管增生、肝門部纖維化、肝外膽管梗阻、膽栓、炎性細胞浸潤和膽管板形態(tài)；④十二指腸引流液(3項)：引流液顏色、留置位置、是否同位素顯像及強度；⑤MMP-7：患兒特征、檢測標本類型、診斷試劑盒種類、診斷截斷值；⑥GGT：檢測時間、試劑盒。提取診斷四格表的數(shù)據(jù)。

1.3 文獻偏倚風險和臨床適用性評價 采用QUADAS-2評價工具，從4 個領(lǐng)域的11個條目對納入文獻按” 是”、“否”、“不確定”進行評價。4個領(lǐng)域中≥3個低風險(LR)和高風險(HR) 分別為高質(zhì)量和低質(zhì)量，2個LR和≥1個HR為低質(zhì)量，2個LR和2個不確定(UR) 為中等質(zhì)量，1個LR+3個UR或4個UR 為低質(zhì)量。偏倚風險由姜璟、湯悅和朱葉分別評價，由BA臨床實踐指南工作組審核。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用STATA 14及Revman 5.3軟件進行統(tǒng)計分析。對合并后數(shù)據(jù)采用合并受試者工作特征(SROC)曲線分析，計算曲線下面積(AUC)、合并后的敏感度、特異度，所有結(jié)果均用95%CI表示。異質(zhì)性檢驗采用I2檢驗，I2>50%認為異質(zhì)性較大。發(fā)表偏倚分析采用Deeks法。

2 結(jié)果

2.1 文獻檢索結(jié)果 中、英文數(shù)據(jù)庫共檢索到15 435篇文獻，中文2 020篇，英文13 425篇。根據(jù)BA臨床實踐指南文獻篩選過程，最終納入308篇文獻。圖1顯示，新生兒BA篩查：大便比色卡和足跟血片質(zhì)譜膽紅素篩查分別有5篇和1篇文獻進入本文Meta分析；新生兒BA術(shù)前診斷：肝穿刺活檢和十二指引流液分別為10篇和8篇文獻進入本文Meta分析；實驗室血清標志物MMP-7和GGT分別為4篇和14篇文獻進入本文Meta分析。

圖1 文獻篩選流程圖

2.2 納入文獻一般特征

2.2.1 大便比色卡 表1顯示，5篇文獻發(fā)表于2006至2018年；中國3篇(臺灣2篇，大陸1篇)，日本和加拿大各1篇；比色卡不同國家版本不同，中國臺灣2項研究大便比色卡版本較為一致；中國臺灣、日本和加拿大均在1月齡體檢時收集比色卡，中國大陸于生后14 d、30 d、42 d和4個月時體檢時收集大便比色卡；均由新生兒照護者行糞便與大便比色卡對比；中國臺灣1項研究回收率65.2%，1項研究未報告，中國大陸研究回收率92.5%，日本研究回收率84.3%，加拿大研究未報告回收率，金標準診斷BA 146(6～75)例、非BA 93 0750(87 582～421 994)例。

表1 大便比色卡文獻特征

2.2.2 足跟血片質(zhì)譜膽紅素 2020年美國1項多中心的前瞻性基于普查政策的診斷準確性研究，納入出生于美國德克薩斯州14家醫(yī)院的124 385例新生兒，所有新生兒均行足跟血片質(zhì)譜膽紅素篩查BA，篩查陽性新生兒再行金標準診斷[5]。該研究同時進行了1項自身前后對照試驗，比較了在2015年開展足跟血片質(zhì)譜膽紅素篩查試驗前后行Kasai手術(shù)日齡。

2.2.3 肝穿刺活檢 表2顯示，8篇文獻發(fā)表于1993至2016年，亞洲國家5篇(中國大陸及臺灣地區(qū)2篇，伊朗2篇，韓國1篇)，歐洲國家1篇(塞爾維亞)，美洲國家1篇(美國)；經(jīng)皮肝穿刺8篇，其中1篇同時包括手術(shù)楔形標本穿刺；4篇文獻沒有報告病理科醫(yī)生資質(zhì)；肝穿刺6項主要觀察指標無1篇文獻全部報告；金標準診斷BA 388(19～136)例、非BA 375(18～91)例。

2.2.4 十二指腸引流液 表3顯示，7篇文獻發(fā)表于1990至2018年。亞洲國家共5篇(中國大陸及臺灣4篇，日本1篇)，歐洲國家1篇(塞爾維亞)，美洲國家1篇(墨西哥)。無1篇文獻對本文3項十二指腸引流液主要觀察指標全部報告，2篇以顏色+同位素判斷，4篇以顏色判斷，1篇以顏色+膽紅素含量判斷；留置位置：2篇在十二指腸二段，3篇在十二指腸三段，2篇幽門后30 cm,1篇僅描述在十二指腸； 判斷時間4～72 h；金標準診斷BA 470(16～174)例、非BA 625(21～222)例。

表2 肝穿刺文獻特征

表3 十二指腸引流液文獻特征

2.2.5 MMP-7 表4顯示，4篇文獻發(fā)表于2017至2019年；中國3篇，美國1篇；美國檢測人群為確診的BA匹配新生兒肝炎，中國為新生兒至生后150 d黃疸嬰兒；中國2個研究試劑盒為云克隆，診斷截斷值(ng·mL-1)分別為52.8和10.4，另1個研究試劑盒為R&D，診斷截斷值為1.4 ng·mL-1，美國試劑盒為Millplex，未報告診斷截斷值；1篇文獻報告了標本采集于首次就診時，余均未報告；金標準診斷BA 330(35～187)例、非BA 260(35～101)例。

表4 血清MMP-7文獻特征

2.2.6 GGT 表5顯示，15篇文獻發(fā)表于1985至2019年；亞洲國家報告11篇(中國7篇，日本、韓國、伊朗、土耳其各1篇)，美洲3篇(美國、加拿大、墨西哥各1篇)，非洲1篇(埃及)；8篇文獻GGT截斷值≥300 IU·L-1；7篇文獻GGT截斷值<300 IU·L-1；1篇文獻報告(GGT)用Jacob法，1篇文獻報告用Flex試劑盒；金標準診斷BA 1 331(12～590)例、非BA 903(12～191)例。

表5 GGT文獻特征

2.3 文獻偏倚風險評價 圖2顯示，大便比色卡：2篇低風險，3篇中等風險；肝穿刺活檢：高和低風險各5篇；十二指腸引流液：4篇低風險，1篇中等風險，2篇高風險；MMP-7：3篇低風險，1篇中風險；GGT：低和中等風險各6篇，2篇高風險。足跟血片質(zhì)譜膽紅素文獻無偏倚風險。

2.4 文獻適用性評價 圖2顯示，大便比色卡：病例選擇維度3篇高適用性，2篇不確定；待測標準維度均為高適用性；金標準維度均為不確定。肝穿刺活檢：病例選擇維度7篇高適用性，3篇低適用性；待測標準維度5篇高適用性，2篇不確定，3篇低適用性；金標準維度6篇高適用性，1篇不確定，3篇低適用性。十二指腸引流液：病例選擇維度2篇高適用性，3篇不確定，2篇低適用性；待測標準維度4篇高適用性，3篇不確定；金標準維度4篇高適用性，3篇不確定。MMP-7：病例選擇維度均為高適用性，待測標準維度均不確定，金標準均為高適用性。GGT: 病例選擇維度8篇高適用性，2篇不確定，4篇低適用性；待測標準維度13篇高適用性，1篇不確定；金標準維度2篇高適用性，11篇不確定，1篇低適用性。

圖2 文獻偏倚風險和臨床適用性評價

2.5 Meta分析結(jié)果

2.5.1 大便比色卡篩查BA 共納入5項研究，圖3顯示，敏感度84%(95%CI：76%～90%)，I2=0；特異度100%(95%CI：100%～100%)，I2為86.4%；AUC為0.99(95%CI：0.98～1.00)。

2.5.2 足跟血片質(zhì)譜膽紅素篩查BA 出生于美國德克薩斯州14家醫(yī)院的124 385例新生兒，所有新生兒均行足跟血片膽紅素和金標準篩查BA。金標準：隨訪(在德克薩斯州有3家兒童肝病中心集中收治BA病例)和必要時的手術(shù)探查。接受2個階段的不同膽紅素截斷值的篩查；第1階段：生后60 h內(nèi)的膽紅素水平，若大于不同中心正常值范圍的P95即為陽性(因不同中心膽紅素檢測儀器不同)；第2階段：第1階段測定陽性的新生兒2周內(nèi)復測膽紅素水平，較第1階段膽紅素值升高或膽紅素值>10 mg·L-1即為陽性。2個階段的膽紅素篩查敏感度為 100% (95%CI：56.1%～100%),特異度為99.9% (95%CI：99.9%～99.9%),陽性預測值為 5.9% (95%CI：2.6%～12.2%), 陰性預測值為100% (95%CI：100%～100%)。

圖3 大便比色卡篩查BA敏感性和特異性Meta分析

納入德克薩斯州3家兒童肝病中心2015年前未開展足跟血片質(zhì)譜膽紅素篩查時經(jīng)手術(shù)確診并接受Kasai手術(shù)的BA患兒24例。2015年后開展足跟血片質(zhì)譜膽紅素篩查試驗后經(jīng)手術(shù)確診并接受Kasai手術(shù)的BA患兒19例(6例于合作醫(yī)院出生經(jīng)篩查后進一步明確診斷，7例為非合作醫(yī)院出生但經(jīng)足跟血片質(zhì)譜膽紅素篩查后診斷，6例因出現(xiàn)相關(guān)癥狀轉(zhuǎn)診后診斷)，開展篩查前平均手術(shù)日齡為(56±19)d，開展后平均手術(shù)日齡為(36±22)d，兩者差值為19 d(95%CI：7～32 d，P=0.004)。

2.5.3 肝穿刺活檢診斷BA 共納入8項研究，圖4顯示，敏感度96% (95%CI：92%～98%)，I2=64.2%；特異度96%(95%CI：92%～97%)，I2=13.4%；AUC為0.98(95%CI：0.96～0.99)。

圖4 肝穿刺活檢診斷BA敏感性和特異性Meta分析

2.5.4 十二指腸引流液診斷BA 共納入7項研究，圖5顯示，敏感度96%(95%CI： 92%～96%)，I2=34. 8%；特異度86%(95%CI：79%～91%)，I2=80.2%；AUC為0.97(95%CI：0.96～0.98)。

圖5 MMP-7診斷BA敏感性和特異性Meta分析

2.5.5 MMP-7診斷BA 共納入4項研究，圖6顯示，敏感度96%(95%CI：93%～98%)，I2=0%；特異度91%(95%CI：85%～95%)，I2=56.7%；AUC為0.97(95%CI：0.95～0.98)。

圖6 十二指腸引流液診斷BA敏感性和特異性Meta分析

2.5.6 GGT診斷BA 納入15項研究，圖7顯示，敏感度81%(95%CI：71%～88%)，I2=87.1%；特異度79%(95%CI：72%～85%)，I2=72.3%；AUC為0.87(95%CI：0.83～0.86)；Deeks發(fā)表偏倚檢驗P=0.40，提示發(fā)表偏倚較小。

圖7 GGT診斷BA敏感性和特異性Meta分析

3 討論

大便比色卡篩查項目最早由1987年在日本發(fā)起[39]，已經(jīng)在中國臺灣、日本、加拿大等廣泛應(yīng)用[3,10,12,40]，在中國大陸也得到了一定推廣[11]。本文針對大便比色卡目前的臨床應(yīng)用，對已發(fā)表的文獻進行系統(tǒng)綜述及Meta分析，結(jié)果提示大便比色卡具有良好的特異度(100%，95%CI：100%～100%)，敏感度(84%，95%CI：76%～90%)尚不夠理想。大便比色卡成本低[41]，是目前以為理想的篩查手段，然而，對一種廣泛應(yīng)用的篩查方式而言，大便比色卡仍有諸多改良空間，其診斷的準確性依賴于患兒父母的依從性、醫(yī)護人員的認識程度以及比色卡的設(shè)計等環(huán)節(jié)。利用手機APP、小程序等多元化的大便比色卡模式也正逐漸興起。大便比色卡隨著簡便、成本低廉的篩查方式仍不斷出現(xiàn)，會得到更進一步的推廣。

近年來，通過新生兒足跟血質(zhì)譜檢測膽紅素水平對BA進行早期篩查正逐漸受到各中心的重視，有研究發(fā)現(xiàn)通過該方法可以在生后60～96 h發(fā)現(xiàn)潛在的BA患兒[42]。本研究納入的1篇文獻提示采用足跟血片質(zhì)譜篩查BA敏感度100.0%(95%CI：56.1%～100.0%)，特異度99.9%(95%CI：99.9%～99.9%)。其敏感度置信區(qū)間較大，提示本研究研究結(jié)果尚不穩(wěn)健，可能由于該疾病患病率低、樣本量仍較小有關(guān)，盡管該研究具有較好的臨床應(yīng)用前景與價值，目前需要多中心、大范圍的臨床研究進一步證實該結(jié)果。

肝穿刺活檢在診斷新生兒梗阻性黃疸中有著不可替代的作用，并在一些國家作為診療常規(guī)進行使用。本文Meta分析結(jié)果顯示，肝穿刺活檢對BA進行診斷，合并后敏感度96% (95%CI：91%～98%)，特異度96%(95%CI：92%～97%)，擬合SROC曲線后AUC為0.98(95%CI：0.97～0.99)，具有很高的診斷價值。目前也有學者對病理標準化診斷工具進行了深入探索，期望進一步提高肝穿刺活檢診斷的準確性。然而，肝穿刺活檢作為創(chuàng)傷性檢查，具有一定風險，且病理診斷依賴于病理科醫(yī)生的水平，部分患兒需反復穿刺。

MMP-7作為一種肝星形細胞分泌的蛋白酶，在以往的研究中被認為是一種與BA患兒肝臟纖維化相關(guān)的血清標志物，并在實驗中證實與膽管上皮損傷有關(guān)[25]。相較GGT，MMP-7診斷BA的靈敏度、特異度更高[7]。本文Meta分析納入文獻質(zhì)量好，臨床應(yīng)用風險小，具有良好的診斷效用。然而，目前對于診斷BA的截斷值尚未統(tǒng)一(1.43～52.85 ng·mL-1)，且納入的人群、接受檢測時的年齡、采血的方式、采用的試劑盒的品種等因素存在差異，因此針對MMP-7的臨床應(yīng)用仍需要更大規(guī)模的研究。

十二指腸引流液在部分中心作為常規(guī)診斷手段，本文Meta分析將肉眼觀察十二指腸引流液顏色作為觀察指標合并后敏感度96%(95%CI： 92%～96%)，特異度86%(95%CI：79%～91%)，具有一定的診斷價值。部分研究為了提高十二指腸引流液診斷準確性對該方法進行了改進，如對引流液進行膽汁酸檢測、采用同位素等方式，報道可提高診斷靈敏度，然而結(jié)果較為分散。在臨床上，十二指腸引流液檢查由于觀察引流液所耗費時間較長(通常24～48 h)，會人為延長BA患兒的診斷過程；此外，由于在放置、觀察十二指腸引流管的過程中，患兒需經(jīng)歷插胃管至十二指腸、禁食等，部分患兒難以耐受，因而對于十二指腸引流液在BA診療過程中的地位需要更深入的探討。

對于臨床考慮新生兒梗阻性黃疸患兒，血清學檢查是必不可少的環(huán)節(jié)，以往研究認為高GGT血癥與BA存在聯(lián)系，本文Meta分析納入的15篇文獻合并后，提示GGT診斷BA的敏感度為81%(95%CI：73%～88%)，特異度79%(95%CI：72%～84%)。以不同的截斷值作為亞組進行分析，發(fā)現(xiàn)截斷值改變對曲線下面積并無明顯影響。盡管GGT在臨床有著廣泛應(yīng)用，單純以患兒GGT的水平對BA進行診斷存在一定局限性，其敏感度與特異度較其他常用診斷方法并不理想，但作為最基本的檢查方法，仍有一定參考價值。

作為BA的篩查項目和術(shù)前診斷項目，除MMP-7外，各項目均提示異質(zhì)性明顯。大便比色卡研究中，不同比色卡的設(shè)計形式、回收時間等可能會對陽性與陰性的判別造成影響；GGT、MMP-7的研究中，接受檢測的人群、檢測時的年齡、采血的方式、檢測試劑、檢測方法不同，均可導致結(jié)果存在差異；十二指腸引流液不同研究對陽性結(jié)果的判別方法(肉眼判斷或檢測引流液中標志物的水平)存在較大差異，從而引入了異質(zhì)性；肝穿刺活檢中，活檢的方法、病理科醫(yī)生的主觀判斷對結(jié)果的影響較大。此外，研究中納入的BA和非BA的比例存在差異，尤其是大便比色卡篩查，納入的人群較大，放大了大便比色卡的診斷特異性，在合并結(jié)果時會導致偏倚。

綜上所述，鑒于大便比色卡的篩查的無創(chuàng)性、便捷性和經(jīng)濟性，新生兒期采用大便比色卡行BA篩查有較好的篩查效應(yīng)。新生兒足跟血片質(zhì)譜膽紅素篩查膽道閉鎖仍需更大范圍的臨床研究；血清學標志物MMP-7、肝穿刺活檢及十二指腸引流液檢查均具有診斷價值，但MMP-7檢測方法較為精準快捷；GGT診斷BA的價值有限，其截斷值仍需進一步探究。