李鵬，馬劍，張宏志，王英，王愈，馬艷弘，，李志剛，袁永生

（1.山西農業(yè)大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030801；2.江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.南京福晶農業(yè)科技有限公司，江蘇 南京 210014）

桑葚是桑科落葉喬木桑樹（Morus alba L.）的果實，俗稱桑果、桑棗，是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物[1]，含有豐富的花色苷、多糖、有機酸等生物活性成分[2]，具有黑發(fā)明目、補益肝腎、提升人體免疫力、延緩機體衰老、降低血糖血脂、預防人體動脈硬化、骨骼關節(jié)硬化以及促進新陳代謝等保健功效，被譽為“二十一世紀的最佳保健圣果”[3-4]。

花色苷是一類具有苯并吡喃結構的天然水溶性色素，廣泛存在于有色植物果實、花朵及子葉中[4-5]，可賦予果蔬、花卉等植物藍色、紅色和紫色，因其獨特的結構[6]使其具有抗炎[7]、抗腫瘤[8]、降血糖[9]、保護神經細胞[10]、降血脂[11]等生物學功效?；ㄉ帐巧］刂兄饕氖称饭δ芤蜃樱崛》椒ㄖ饕袩峤岱╗12]、超聲波輔助法[13]、微波輔助法[14]、酶提取法[15]、超臨界萃取法[16]、超高壓輔助提取[17-18]等。其中，超高壓輔助提取技術（ultra-high pressure-assisted extraction，UHP）是利用水或其它流體為媒介，將樣品在100 MPa以上壓力下保持一定時間，促使細胞壁結構破壞、目標產物充分釋放的一種新型提取技術[19]。與其它提取技術相比，超高壓處理時提供給物料的能量相對較低，一般只破壞對生物大分子立體結構有貢獻的氫鍵、離子鍵、疏水鍵等非共價鍵，而對共價鍵沒有影響，具有能耗低、效率高、對生物活性物質影響小等優(yōu)點[19-20]，目前已被應用于多酚[21]、多糖[22]、黃酮等物質的提取，但是超高壓輔助提取桑葚花色苷的研究仍鮮見報道。

本研究以桑葚為原料，花色苷得率為評價指標，在單因素試驗基礎上通過響應面試驗優(yōu)化超高壓輔助提取桑葚花色苷的工藝條件，并評價其體外抗氧化活性，為桑葚及天然色素的深度開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚：句容萬山紅遍生物科技有限公司。

DPPH、抗壞血酸（VC）：上海源葉生物科技有限公司；濃鹽酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀、氯化鉀、過氧化氫（均為分析純）：南京化學試劑股份有限公司；乙醇、乙酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MJ-PB40E253C多功能榨汁機：美的集團股份有限公司；D-Epoch全自動酶標儀：Bio Tek公司；PL303電子天平、FE-20實驗室pH計：梅特勒托利多（上海）有限公司；D-8紫外可見分光光度計：上海奧析科學儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；HPP600MPa超高壓食品處理裝置：包頭科發(fā)高壓科技有限責任公司；TGL-16B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 桑葚花色苷的提取

取解凍打漿后的桑葚果漿10.00 g，按照一定的液料比與一定濃度的酸化乙醇溶液（1mol/LHCl調節(jié)pH 3）混合均勻，無損轉移于聚乙烯袋，充分混勻后封口，置于超高壓食品處理裝置中處理，提取結束后，將樣品置于離心機中以4 500 r/min離心，收集上清液，即為花色苷提取液。

1.3.2 單因素試驗設計

準確稱取桑葚果漿10.00 g，無損轉移至聚乙烯塑料袋中，加入酸化乙醇溶液（pH 3），混勻后封口，置于超高壓食品處理裝置中室溫（25℃）保壓處理10 min，分別考察液料比[6 ∶1、9 ∶1、12 ∶1、15 ∶1、18 ∶1（mL/g）]、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取壓力（100、200、300、400、500 MPa）對花色苷得率的影響。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結果，以乙醇濃度（A）、提取壓力（B）、液料比（C）為試驗因素，以桑葚花色苷得率為響應值（Y），采用Box-Behnken中心組合設計，根據(jù)Design-Expert 8.06軟件優(yōu)化超高壓輔助提取桑葚花色苷的工藝條件。試驗因素與水平編碼表見表1。

表1 因素及水平編碼Table 1 Coded levels for factors used in Box-Behnken design

1.3.4 桑葚花色苷熱提取法

參考文獻[12]，準確稱取10.00 g桑葚果漿于聚乙烯袋中，按照液料比15∶1（mL/g）加入60%乙醇溶液，封口，40℃水浴60 min，提取結束后，將樣品置于離心機中以4 500 r/min離心，收集上清液，將熱提取得到的花色苷得率與超高壓輔助提取得到的花色苷得率進行比較。

1.3.5 桑葚花色苷得率的測定

采用pH值示差法測定桑葚花色苷含量[23]，取1.0mL樣品液，分別加入9.0 mL pH 1.0的KCl緩沖液與pH 4.5的乙酸鈉緩沖液，搖勻、避光靜置60 min，分別在520、700 nm處測定吸光值，按照公式（1）計算花色苷得率 Y（mg/g）。

式中：A1為樣品中加入pH 1.0的KCl緩沖液時在520 nm與700 nm處測得的吸光度差值；A2為樣品中加入pH 4.5的乙酸鈉緩沖液時在520 nm與700 nm處測得的吸光度差值；Mr為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量，449.2 g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；V為總體積，mL；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；1為比色皿光程，cm；m 為樣品質量，g。

1.3.6 體外抗氧化能力的測定

1.3.6.1 DPPH·清除能力的測定

參考文獻[24]，準確配制終濃度為0.6 mmol/L的DPPH乙醇溶液。將2 mL DPPH溶液與1 mL不同濃度桑葚花色苷溶液（0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6 mg/mL）混合均勻，避光反應30 min，以同濃度的VC溶液作陽性對照，在517 nm處測定混合液的吸光度A，按照公式（2）計算DPPH自由基清除率。

式中：A1為2 mL DPPH溶液與1 mL樣品液的吸光度；A2為2 mL無水乙醇與1 mL樣品液的吸光度；A0為2 mL DPPH溶液與1 mL無水乙醇的吸光度。

1.3.6.2 羥自由基清除能力的測定

參考文獻[25]，稍作修改，配制2 mg/mL硫酸亞鐵溶液，取硫酸亞鐵溶液1 mL，依次加入1.5 mg/mL水楊酸-乙醇溶液1 mL、不同濃度的花色苷樣品溶液（0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）1 mL、1% 的過氧化氫1 mL，混合均勻，37℃保溫1 h，于526 nm波長處測定其吸光度，以VC為陽性對照，按公式（3）計算羥自由基清除率。

式中：A1為樣品吸光度；A2為無水乙醇溶液代替水楊酸-乙醇溶液的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度。

1.3.6.3 鐵離子還原力測定

參考文獻[26]，以VC為陽性對照，取1 mL不同濃度的樣品液，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后于50℃水浴中保持20 min，迅速冷卻后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，充分混勻后取上清液2.5 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%的氯化鐵溶液，通過測定700 nm處的吸光度，分析鐵離子還原力的強弱，吸光度越高表明還原能力越強。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復3次，試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進行處理，Design-Expert 8.0.6進行響應面設計。

2 結果與分析

2.1 提取工藝單因素試驗結果

2.1.1 提取壓力對桑葚花色苷得率的影響

在液料比為 9 ∶1（mL/g）、保壓時間為 10 min、乙醇濃度為70%（pH 3）條件下，考察提取壓力對花色苷得率的影響，結果見圖1。

圖1 提取壓力對桑葚花色苷得率的影響Fig.1 Effect of extraction pressure on the yield of anthocyanins of mulberry

由圖1可知，壓力在100 MPa～400 MPa范圍內，桑葚花色苷得率隨著壓力的增大而升高。這是由于壓力的增大不僅可以改變細胞膜的構象，使得細胞膜的通透性增加，傳質阻力降低，而且還能增大細胞內外的滲透壓差，提高提取液對花色苷的浸潤速率，進而促進了花色苷得率的提高[27]；當壓力達400 MPa時，花色苷得率最高為（1.87±0.04）mg/g，此時花色苷已經充分溶出，繼續(xù)增大提取壓力，花色苷得率趨于穩(wěn)定。

2.1.2 液料比對桑葚花色苷得率的影響

在提取壓力300 MPa、保壓時間10 min、乙醇濃度70%（pH 3）條件下，考察液料比對桑葚花色苷得率的影響，結果見圖2。

圖2 液料比對桑葚花色苷得率的影響Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on the yield of anthocyanins of mulberry

由圖 2 可知，液料比在 6 ∶1（mL/g）～12 ∶1（mL/g）范圍內，桑葚花色苷得率隨溶劑體積的增加而提高，液料比為 12 ∶1（mL/g）時，花色苷得率最高（1.63±0.02）mg/g，之后花色苷得率趨于穩(wěn)定。在提取過程中，提取液中的花色苷濃度逐漸提高，且液料比越大，二者濃度梯度越大，擴散速率越快，越有利于有效成分的溶出[27]。但進一步提高液料比會因提取液中的花色苷濃度變化較小而趨于平緩，而且還會增大后續(xù)濃縮的難度[28]。

2.1.3 乙醇濃度對桑葚花色苷得率的影響

在液料比 9 ∶1（mL/g）、提取壓力 300 MPa、保壓時間10 min條件下，考察乙醇濃度對花色苷得率的影響，結果見圖3。

圖3 乙醇濃度對桑葚花色苷得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of anthocyanins of mulberry

由圖3可知，桑葚花色苷得率隨著乙醇濃度的提高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當乙醇濃度為70%時，花色苷得率最高（1.53±0.03）mg/g。可見較高濃度的乙醇溶液有利于花色苷的溶出；當乙醇濃度高于70%時，花色苷得率反而降低。這是由于一方面醇溶性、親脂性等雜質的溶出量增大，與花色苷形成競爭，使花色苷得率降低；另一方面，較高濃度的乙醇溶液也可能會使細胞中的蛋白質變性凝固堵塞組織微孔，阻礙花色苷的溶出[29-30]。

2.2 桑葚花色苷提取條件的響應面優(yōu)化結果與分析

2.2.1 響應面試驗設計及結果分析

在單因素試驗基礎上，應用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken進行試驗設計，以乙醇濃度（A）、提取壓力（B）、液料比（C）3個因素為自變量，以花色苷得率（Y）為因變量，優(yōu)化超高壓輔助提取桑葚花色苷的提取條件，其試驗設計與結果見表2。方差分析結果見表3。

表2 響應面試驗設計及試驗結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 模型和回歸系數(shù)顯著性檢驗Table 3 Significance test of the fitted model and its regression coefficients

續(xù)表3 模型和回歸系數(shù)顯著性檢驗Continue table 3 Significance test of the fitted model and its regression coefficients

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到桑葚花色苷得率Y對各因素二次回歸方程為：Y=0.077A+0.14B+0.026C-0.035AB-0.020AC+0.018BC-0.077A2-0.21B2-0.095C2+1.96。

由表3可知，模型極顯著（p＜0.000 1），失擬項不顯著（p=0.116 4＞0.05），模型決定系數(shù) R2=0.997 9，調整決定系數(shù)R2Adj=0.994 2。表明模型與試驗值擬合性良好，試驗誤差較小，試驗精密度高，各因素與桑葚花色苷得率之間具有高度相關性[31]，可以對桑葚花色苷得率進行準確預測和分析。由表3還可知，3個因素對響應值的影響程度大小依次為B＞A＞C，因素A、B、C對桑葚花色苷得率的影響極顯著（p＜0.01），AB、AC、BC 以及 A2、B2、C2對花色苷得率的影響也顯著（p＜0.05 或 p＜0.01）。

2.2.2 響應面分析與優(yōu)化

各因素間交互作用對桑葚花色苷得率影響的響應面圖見圖4。

圖 4顯示，乙醇濃度（A）、提取壓力（B）、液料比（C）3個因素中，任意2個因素交互作用的響應面都存在最高點，曲面越陡峭則表明因素對花色苷得率影響越大，反之則較小[32]。兩因素間的響應面曲面坡度陡峭，表明其交互作用對桑葚花色苷得率的影響也較為顯著。這與模型方程的各項方差分析結果一致。

圖4 因素間交互作用對桑葚花色苷得率的影響Fig.4 Effect of interaction between factors on the yield of anthocyanins of mulberry

2.2.3 驗證試驗

通過Design-Expert軟件對回歸方程進行優(yōu)化，得到桑葚花色苷最佳提取條件為：乙醇濃度74.19%、提取壓力 429.52 MPa、液料比 12.37 ∶1（mL/g），在此條件下桑葚花色苷得率的預測值為1.99 mg/g。為了方便操作，修正提取條件為：乙醇濃度75%、提取壓力430 MPa、液料比12∶1（mL/g），在此條件下驗證模型的有效性，并與傳統(tǒng)熱提取法進行比較，3次重復試驗表明，傳統(tǒng)熱提取法所得桑葚花色苷得率為（1.37±0.03）mg/g，超高壓輔助提取法所得花色苷實測值得率為（1.97±0.02）mg/g，與預測理論值接近，說明超高壓輔助提取法顯著優(yōu)于傳統(tǒng)熱提取法，所得模型的擬合程度較好，可以較好地預測提取條件與桑葚花色苷得率的關系。

2.3 桑葚花色苷抗氧化活性分析

2.3.1 對DPPH自由基的清除作用

桑葚花色苷的DPPH自由基清除率如圖5所示。

不同質量濃度的花色苷均具有一定的DPPH自由基清除能力，在0.01 mg/mL～0.10 mg/mL濃度范圍內時，花色苷和VC的DPPH自由基清除率隨著質量濃度的增加而增加，且花色苷的DPPH自由基清除率高于同濃度的VC，當花色苷質量濃度為0.10 mg/mL時，DPPH自由基清除率達（93.60±2.28）%，高于同濃度VC的DPPH自由基清除率（91.30±1.64）%；桑葚花色苷與VC質量濃度高于0.10 mg/mL時，二者對DPPH自由基的清除率趨于平緩。另外，VC的IC50為0.055 mg/mL，而桑葚花色苷的IC50為0.026 mg/mL，是VC的0.47倍，表明桑葚花色苷對DPPH自由基的清除能力優(yōu)于VC。

圖5 桑葚花色苷對DPPH自由基的清除率Fig.5 DPPH radical scavenging rates of anthocyanins of mulberry

2.3.2 對羥自由基的清除作用

桑葚花色苷對羥自由基的清除能力見圖6。

圖6 桑葚花色苷對羥自由基的清除能力Fig.6 Hydroxyl radical scavenging rates of anthocyanins of mulberry

由圖6可知，桑葚花色苷質量濃度對羥自由基清除能力呈現(xiàn)一定的量效關系。在0.02 mg/mL～0.2 mg/mL濃度范圍內，桑葚花色苷對羥自由基的清除能力隨著樣品濃度的增大逐漸增強，且強于同濃度的VC；當桑葚花色苷與VC的質量濃度高于0.2 mg/mL時，花色苷對羥自由基的清除能力趨于平緩，而VC對羥自由基的清除能力繼續(xù)增大，并且高于同濃度的桑葚花色苷。其中，VC的IC50為0.344 mg/mL，桑葚花色苷為0.406 mg/mL，是VC的1.18倍。當濃度為0.8 mg/mL時，桑葚花色苷對羥自由基的清除能力達到最大值為（51.12±1.85）%，低于同質量濃度VC對羥自由基的清除能力（63.68±1.12）%。因此，桑葚花色苷對羥自由基具有較強的清除能力。

2.3.3 鐵離子還原力

桑葚花色苷對鐵離子的還原能力見圖7。

圖7 桑葚花色苷對鐵離子的還原能力Fig.7 Reducing ability to iron ions of anthocyanins of mulberry

由圖7可知，在所設質量濃度范圍內，桑葚花色苷的還原力隨著質量濃度的增大先增強后趨于平緩，且強于同濃度VC溶液的鐵離子還原能力。當質量濃度為0.8 mg/mL時，吸光度從0.42±0.024升高到 1.72±0.035，與同質量濃度VC溶液的鐵還原力1.48±0.031相比，提高了16.22%，表明桑葚花色苷對鐵離子的還原能力明顯高于陽性對照VC對鐵離子的還原能力[33]。

3 結論

超高壓輔助提取技術是近年快速發(fā)展的可用于活性物質提取的新技術，與熱提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法等相比，能夠有效地避免因熱效應引起的活性成分結構變化、損失以及生物活性的降低，也降低了傳統(tǒng)提取時間過長而導致的熱敏性物質的損失[34]。本研究以桑葚為原料，采用超高壓輔助法提取桑葚中的花色苷，在單因素試驗基礎上通過響應面分析法，確定了超高壓輔助提取桑葚花色苷的最佳工藝條件為：提取壓力 430 MPa、液料比 12 ∶1（mL/g）、乙醇濃度75%，在此條件下桑葚花色苷得率為（1.97±0.02）mg/g。各因素對桑葚花色苷提取效果影響的主次順序為：提取壓力＞乙醇濃度＞液料比；與傳統(tǒng)熱提取法對比發(fā)現(xiàn)，超高壓輔助提取花色苷得率提高了43.80%，時間縮短了6倍。體外抗氧化試驗表明桑葚花色苷具有較強的抗氧化活性，在一定的濃度范圍內，花色苷質量濃度與抗氧化活性呈現(xiàn)出良好的量效關系。其中，桑葚花色苷對DPPH自由基與羥基自由基的IC50分別為0.026、0.406 mg/mL，分別是VC的0.47倍、1.18倍。本研究結果為天然色素的高效提取提供了一種有效的手段，同時為開發(fā)具有功能活性的食品添加劑提供了理論基礎。