滕力群 廖 欣 李 衛(wèi)

苯酚(化學(xué)式為C6H5OH) 屬于弱酸酚類有機(jī)物, 又稱石炭酸, 廣泛應(yīng)用于化工及醫(yī)藥領(lǐng)域,但其又是一種細(xì)胞原漿毒物, 除可導(dǎo)致皮膚燒傷外, 還可經(jīng)呼吸道、 消化道及完整皮膚吸收入血引發(fā)全身中毒［1-2］。 臨床研究顯示, 苯酚燒傷患者除皮膚燒傷外, 尤以腎損傷最為突出, 特別是苯酚燒傷面積在25% TBSA 以上者燒傷早期即可出現(xiàn)嚴(yán)重腎功能損害, 一旦控制不及時(shí), 病死率極高［3-4］。 故有研究學(xué)者主張, 即使患者血肌酐(Serum creatinine, Scr) 正常也應(yīng)及早給予苯酚燒傷患者血液透析治療, 以預(yù)防腎損傷［5］。 然而, 血液透析治療可引發(fā)失衡綜合征、 電解質(zhì)紊亂、 心律失常等并發(fā)癥, 進(jìn)而加重?zé)齻颊咝菘孙L(fēng)險(xiǎn)。 因此, 及早判斷苯酚燒傷患者腎損傷情況至關(guān)重要。

目前, 苯酚燒傷所致急性腎損傷的診斷主要依據(jù)Scr 水平和尿量變化進(jìn)行判斷, 但Scr 水平可受年齡、 性別、 飲食、 運(yùn)動(dòng)等多種因素影響, 尿量變化可受尿路梗阻、 血容量狀態(tài)等因素限制。 另外,血酚含量檢測(cè)有助于評(píng)估病情和指導(dǎo)治療, 但該檢測(cè)方法因受儀器設(shè)備等限制未得到應(yīng)用, 因此探尋更為特異、 敏感的腎損傷標(biāo)志物迫在眉睫。 近年來(lái), 腎損傷分子-1 (kidney injury molecule-1, KIM-1)和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL) 因在腎損傷患者中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài), 被越來(lái)越多的研究學(xué)者關(guān)注。 為進(jìn)一步分析其臨床應(yīng)用價(jià)值, 為苯酚燒傷患者的診療提供參考, 筆者于本研究中動(dòng)態(tài)觀察了苯酚燒傷所致急性腎損傷大鼠血清KIM-1、 NGAL 水平的變化情況, 分析了血清KIM-1、 NGAL 對(duì)苯酚燒傷后腎損傷的早期診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4 周齡健康SPF 級(jí)SD 雄性大鼠48 只, 體重(320 ±18) g, 均購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司, 并飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi), 室溫控制在20 ～25 ℃, 相對(duì)濕度控制在40% ～60%, 每天給予12 h 光照。 本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥物及設(shè)備

苯酚： 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司, 批號(hào)20190214； 水合氯醛： 生工生物工程(上海) 股份有限公司, 批號(hào)20181224； 大鼠KIM-1 試劑盒(批號(hào)5DEQFB3301)、 大鼠NGAL 試劑盒(批號(hào)AR6BHB8901)： 美國(guó)Immunoway 公司； Scr 試劑盒： 南京建成生物工程研究所, 批號(hào)20190325；BOX998 多功能酶標(biāo)儀： 美國(guó)Bio Tek 公司； Multifuge X1 臺(tái)式離心機(jī)： 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司； BH-2 顯微鏡： 日本Olympus 公司。

1.3 模型建立及分組

將48 只SD 大鼠按體重編號(hào)后, 采用SPSS 軟件(種子數(shù)20190421) 將其隨機(jī)分為對(duì)照組6 只、實(shí)驗(yàn)組42 只, 繼而再將實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為7 個(gè)亞組,每組6 只, 分別用于燒傷后15、 45 min 以及2、 4、8、 16、 32 h 的檢測(cè)。 對(duì)照組大鼠僅于10%水合氯醛(0.3 mL/100 g) 腹腔注射麻醉后, 做背部脫毛處理； 實(shí)驗(yàn)組大鼠于背部脫毛處理后予以90%苯酚灼傷2 min, 制作面積為5% TBSA 的苯酚燒傷模型(所有大鼠燒傷模型均制作成功)。

1.4 組織病理學(xué)檢查及KIM-1、 NGAL、 Scr 水平檢測(cè)

分別于燒傷后15、 45 min 以及2、 4、 8、 16、32 h 取相應(yīng)小組大鼠于10%水合氯醛(0.3 mL/100 g) 腹腔注射麻醉后進(jìn)行解剖, 取腎臟組織,依次行石蠟包埋、 切片、 蘇木精-伊紅(hematoxylineosin, HE) 染色后, 顯微鏡下觀察組織病理變化；采集腹主動(dòng)脈血液靜置1 h 后, 3500 r/min 離心10 min, 分離上層血清, 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 檢測(cè)KIM-1、 NGAL 水平, 采用肌氨酸氧化酶法檢測(cè)Scr 水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 多組間比較采用單因素方差分析；KIM-1、 NGAL 水平與腎損傷的相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)性分析； KIM-1、 NGAL、 Scr 水平對(duì)腎損傷的診斷價(jià)值采用受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve, ROC) 進(jìn)行分析, 并進(jìn)一步采用MedCalc 19.1 軟件比較各組P值, R-3.5.3 軟件計(jì)算凈重分類改善度(net reclassification improvement, NRI) 和綜合區(qū)分改善度(integrated discrimination improvement, IDI)； 均以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苯酚燒傷后大鼠臨床表現(xiàn)

苯酚燒傷2 min 內(nèi)大鼠出現(xiàn)全身抽搐及肌束顫動(dòng), 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)大鼠皮膚逐漸由淺紅色變?yōu)樽丶t色, 創(chuàng)面邊界清晰, 質(zhì)地稍韌, 無(wú)水皰形成及表皮脫落(圖1), 并伴有肉眼血尿。

圖1 苯酚燒傷后15 min, 大鼠皮膚呈淺紅色伴少許棕紅色Fig.1 At 15 min postburn,the rat skin was light red with a little brown red in color

2.2 苯酚燒傷后大鼠腎臟病理組織學(xué)變化

苯酚燒傷32 h 內(nèi), 大鼠腎臟組織逐漸出現(xiàn)腎小管空泡樣變性、 蛋白質(zhì)管型、 腎小管擴(kuò)張及腎小管上皮細(xì)胞核固縮壞死(圖2 -5)。

2.3 各組大鼠KIM-1、 NGAL 及Scr 水平對(duì)比

大鼠燒傷后32 h 內(nèi), 血清KIM-1、 NGAL 水平均呈先升高后降低的趨勢(shì), 其中KIM-1 水平于燒傷后15 min 開(kāi)始升高, 8 h 到達(dá)高峰； NGAL 水平于燒傷后2 h 開(kāi)始升高, 16 h 到達(dá)高峰； 而Scr 水平升高不明顯, 詳見(jiàn)表1。

圖2 對(duì)照組大鼠腎臟組織HE 染色圖( ×400)； 圖3 苯酚燒傷后16 h 實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織HE 染色圖見(jiàn)腎小管出現(xiàn)空泡樣變性( ×400)Fig.2 HE staining results of rat renal tissues in the control group ( ×400)； Fig.3 HE staining showed vacuolar degeneration of renal tubules in rat renal tissues at 16 h postburn in the experiment group ( ×400)

圖4 苯酚燒傷后16 h 實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織HE 染色圖見(jiàn)腎小管管腔內(nèi)出現(xiàn)蛋白質(zhì)管型及腎小管擴(kuò)張( ×400)； 圖5 苯酚燒傷后16 h 實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織HE 染色圖見(jiàn)腎小管管腔內(nèi)出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞壞死( ×400)Fig.4 HE staining showed protein cast of renal tubules and tubular dilation in rat renal tissues at 16 h postburn in the experiment group ( ×400)； Fig.5 HE staining showed epidermal cell necrosis in rat renal tubules at 16 h postburn in the experiment group ( ×400)

表1 各組大鼠血清KIM-1、 NGAL、 Scr 水平對(duì)比Table 1 Comparison of serum KIM-1， NGAL and Scr among all groups

表1 各組大鼠血清KIM-1、 NGAL、 Scr 水平對(duì)比Table 1 Comparison of serum KIM-1， NGAL and Scr among all groups

注： KIM-1 為腎損傷分子-1, NGAL 為中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白, Scr 為血肌酐； 與對(duì)照組對(duì)比, aP ＜0.05； 與15 min 組對(duì)比,bP ＜0.05； 與45 min 組對(duì)比, cP ＜0.05； 與2 h 組對(duì)比, dP ＜0.05； 與4 h 組對(duì)比, eP ＜0.05； 與8 h 組對(duì)比, fP ＜0.05； 與16 h 組對(duì)比,gP ＜0.05Note： KIM-1 is kidney injury molecule-1, NGAL is neutrophil gelatinase-associated lipocalin, Scr is serum creatinine.aP ＜0.05 as compared with the control group； bP ＜0.05 as compared with the 15 min group； cP ＜0.05 as compared with the 45 min group； dP ＜0.05 as compared with the 2 h group； eP ＜0.05 as compared with the 4 h group； fP ＜0.05 as compared with the 8 h group； gP ＜0.05 as compared with the 16 h group

組別Group只數(shù)Number of rats KIM-1 (pg/mL) NGAL (pg/mL) Scr (μmol/L)對(duì)照組Control group 6 12.91 ±2.53 1788.32 ±101.38 49.83 ±7.76 15 min 組15 min group 6 30.47 ±3.93a 1755.49 ±180.05 53.00 ±5.55 45 min 組45 min group 6 34.10 ±2.21ab 1688.86 ±177.08 62.00 ±8.53ab 2 h 組2 h group 6 41.11 ±4.40abc 2620.85 ±163.87abc 53.17 ±9.20 4 h 組4 h group 6 38.00 ±2.88abc 2683.57 ±140.34abc 60.17 ±9.74a 8 h 組8 h group 6 63.16 ±2.74abcde 3448.33 ±167.48abcde 58.50 ±5.82 16 h 組16 h group 6 38.81 ±1.98abcf 3858.43 ±331.59abcdef 53.67 ±7.34 32 h 組32 h group 6 30.21 ±3.04acdefg 3120.57 ±94.72abcdefg 54.17 ±6.85 F 值F value 125.723 122.510 1.749 P 值P value ＜0.001 ＜0.001 0.125

2.4 KIM-1、 NGAL 水平與早期腎損傷的相關(guān)性分析

Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示, KIM-1、NGAL 水平與早期腎損傷具有顯著相關(guān)性 (r ＝0.664、 0.730, P 均＜0.001)。

2.5 KIM-1、 NGAL、 Scr 水平對(duì)早期腎損傷的診斷價(jià)值

以病理組織學(xué)檢查結(jié)果中出現(xiàn)“腎小管壞死”作為金標(biāo)準(zhǔn), 繪制KIM-1、 NGAL、 Scr 的ROC 曲線。 結(jié)果顯示, 燒傷32 h 內(nèi)大鼠血清KIM-1、NGAL 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)診斷早期腎損傷具有顯著優(yōu)勢(shì)(表2 -4、 圖6)。

表2 血清KIM-1、 NGAL、 Scr 水平在大鼠早期腎損傷中的診斷價(jià)值Table 2 Values of serum KIM-1， NGAL and Scr in diagnosing early renal injury of rats

表3 血清KIM-1、 NGAL、 Scr 診斷大鼠早期腎損傷的AUC 對(duì)比Table 3 Comparison of AUC of serum KIM-1， NGAL and Scr in diagnosing early renal injury of rats

表4 血清KIM-1、 NGAL、 Scr 診斷大鼠早期腎損傷的NRI、 IDI 對(duì)比Table 4 Comparison of NRI and IDI of serum KIM-1，NGAL and Scr in diagnosing early renal injury of rats

圖6 血清KIM-1、 NGAL、 Scr 水平在大鼠早期腎損傷診斷中的ROC 曲線Fig.6 ROC curve of serum KIM-1, NGAL and Scr levels in diagnosing early renal injury of rats

3 討論

苯酚作為一種重要的化工原料, 目前其市場(chǎng)已進(jìn)入高速發(fā)展期, 與此同時(shí)其在生產(chǎn)、 儲(chǔ)存、 應(yīng)用過(guò)程中因泄漏而導(dǎo)致的皮膚燒傷發(fā)病率也隨之上升［6］。 苯酚可造成全身多器官功能受損, 其中腎損傷是苯酚燒傷患者最為突出的并發(fā)癥之一, 可明顯增加患者的病死率, 因此給予苯酚燒傷患者科學(xué)有效的腎損傷防控對(duì)提高患者預(yù)后具有重要意義［5］。然而, 目前對(duì)苯酚燒傷患者腎損傷的診療均無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

KIM-1 是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白, 屬于免疫球蛋白超家族中的一員。 相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),KIM-1在正常腎組織中幾乎不表達(dá), 但在缺血性或中毒性腎損傷的近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)卻呈高表達(dá)狀態(tài)［7］。 生理狀態(tài)下, NGAL 在肝、 腎、 肺、 胃和結(jié)腸中表達(dá)水平極低, 但當(dāng)各臟器組織上皮細(xì)胞受損時(shí)其表達(dá)量明顯升高, 特別是在缺血性或中毒性腎損傷的腎小管升支粗段能大量分泌入血, 且由于近端腎小管重吸收功能降低, 其在尿液中的水平也隨之上升［8］。 本實(shí)驗(yàn)參考既往的實(shí)驗(yàn)研究［9-10］, 最終確定建立燒傷模型的燒傷面積為5%、 作用時(shí)間為2 min, 所有大鼠皮膚均成功建立Ⅱ度燒傷創(chuàng)面且無(wú)大鼠死亡。 實(shí)驗(yàn)中大鼠皮膚在苯酚燒傷后逐漸出現(xiàn)較明顯的腎臟病理組織學(xué)改變, 且相較于Scr,血清KIM-1 及NGAL 水平變化較早且較明顯, 與腎損傷存在顯著相關(guān)性。 進(jìn)一步經(jīng)ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn), 苯酚燒傷32 h 內(nèi), 血清KIM-1、 NGAL 水平對(duì)診斷腎損傷具有較高的敏感度與特異度, 且兩者間無(wú)明顯差異, 特別是兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)診斷腎損傷具有重要意義。 NRI 和IDI 是近年新興起的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo), 與AUC 相比, 能夠提供更多的增量信息［11］。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析NRI 和IDI 發(fā)現(xiàn), 相較于Scr, KIM-1 和NGAL 對(duì)苯酚燒傷所致大鼠早期腎損傷的診斷效能有改善趨勢(shì), 且NGAL 及兩者聯(lián)合診斷的IDI 結(jié)果更顯著, 與AUC 對(duì)比的結(jié)果相一致?？梢?jiàn), KIM-1、 NGAL 有助于提高腎損傷早期診斷的敏感性和特異性。 KIM-1 可通過(guò)p38 絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路促進(jìn)生長(zhǎng)因子產(chǎn)生而參與腎小管上皮細(xì)胞的去分化和增殖過(guò)程［12］； NGAL 可通過(guò)鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)參與調(diào)節(jié)鐵敏感基因而誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化, 且可通過(guò)清除氧自由基參與腎損傷的修復(fù)［13］, 這可能是兩者在腎損傷大鼠中高表達(dá)的主要原因。 另外, 基于本研究中血清KIM-1、NGAL 表達(dá)水平及病理表現(xiàn)的變化情況, 猜測(cè)苯酚通過(guò)皮膚吸收后經(jīng)腎臟代謝時(shí)直接損傷腎小管上皮細(xì)胞導(dǎo)致其濾過(guò)屏障受損, 同時(shí)因紅細(xì)胞碎片、 血紅蛋白沉淀堵塞造成缺血、 缺氧等進(jìn)一步加重腎損傷, 甚至導(dǎo)致急性腎功能衰竭可能是苯酚燒傷所致腎損傷的主要發(fā)病機(jī)制, 值得進(jìn)一步深入研究探討。

綜上所述, 血清KIM-1 及NGAL 能夠較早反應(yīng)苯酚燒傷后的腎功能變化, 與腎損傷程度密切相關(guān), 對(duì)早期診斷腎損傷具有較高的敏感度和特異度, 可為臨床上苯酚燒傷患者早期腎損傷的防治提供依據(jù)。