任順成，王鳳雯，曹 悅，李林政，潘天義

1.河南工業(yè)大學(xué) 河南省天然色素制備重點實驗室，河南 鄭州 450001 2.河南中大恒源生物科技股份有限公司,河南 漯河 462600

藻藍(lán)色素是一種天然的具有光捕獲功能的水溶性色素蛋白，不僅可以被當(dāng)作天然著色劑應(yīng)用到食品[1]和美容化妝品中[2]，而且因其特殊的營養(yǎng)特性以及生化特性還被廣泛應(yīng)用到醫(yī)療保健(抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗動脈粥樣硬化[5]和保護(hù)腎臟和肝臟的作用[6])以及生化領(lǐng)域(熒光探針[7]、光敏劑[8])中，發(fā)展前景非常廣闊。

藻藍(lán)色素是由脫輔基蛋白(apoprotein)和線性四吡咯化合物藻藍(lán)膽素PCB(phycocyanobilin)通過一個或兩個硫醚鍵共價連接而成的色素蛋白復(fù)合物[9]，廣泛存在于藍(lán)藻中。它能夠吸收550～630 nm的光，最大吸收波長為610～620 nm[10]，分子質(zhì)量為44～260 kDa。藻藍(lán)色素的兩個基本構(gòu)成單元分別為α亞基(2個半胱氨酸和2個甲硫氨酸殘基，12～19 kDa)和β亞基(3個半胱氨酸和5個甲硫氨酸殘基，14～21 kDa)[11]，每種亞基都含有160～180個氨基酸序列[12]。藻藍(lán)色素的α、β亞基易集聚成二聚體αβ單體，αβ單體進(jìn)一步聚集形成環(huán)狀三聚體(αβ)3，兩個三聚體再組裝成六聚體圓盤((αβ)3)2。六聚體為藻藍(lán)色素的主要形式，直徑為11 nm[13]。

藻藍(lán)色素中的藻藍(lán)膽素與載脂蛋白結(jié)合后，將被迫伸展構(gòu)象。藻藍(lán)膽素和蛋白質(zhì)形成的擴(kuò)展雙鍵系統(tǒng)將引起特征光譜變化。如果發(fā)色團(tuán)和蛋白質(zhì)之間的穩(wěn)定鍵丟失，那么發(fā)色團(tuán)將會重新排列成在能量上有利的環(huán)狀構(gòu)象[14]。因藻藍(lán)色素特殊的色素蛋白復(fù)合結(jié)構(gòu)，容易受到周圍基質(zhì)的影響而不穩(wěn)定，由此造成它的使用范圍受到了很大的限制[15]。藻藍(lán)色素的降解取決于蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)，該狀態(tài)受光、溫度、pH值和蛋白質(zhì)濃度等參數(shù)的影響[16]。梁霄等[17]得出藻藍(lán)色素在pH 6.0～7.0、 4～30 ℃、避光條件下相對穩(wěn)定。Wu等[18]研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)色素在100 μmol·m-2·s-1光照強度下比50 μmol·m-2·s-1有著更大的降解率。Zhang等[19]通過向藻藍(lán)色素溶液中添加乳清蛋白,發(fā)現(xiàn)乳清蛋白比豌豆蛋白在藻藍(lán)溶液pH 3.0時更能有效地防止聚集現(xiàn)象的產(chǎn)生。Braga等[20]通過向藻藍(lán)色素中摻入納米纖維并測定其降解速率常數(shù)和半衰期，發(fā)現(xiàn)其在55～75 ℃條件下熱穩(wěn)定性得到提高。關(guān)于藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的系統(tǒng)研究，特別是在添加多種金屬離子以及多酚條件下的穩(wěn)定性研究鮮有報道。因此，作者通過研究藻藍(lán)色素在不同pH值、溫度、光照條件下的穩(wěn)定性，不同濃度的糖、抗氧化劑、金屬離子、十二烷基硫酸鈉(SDS)以及不同種類的多酚對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響，以期為進(jìn)一步改善藻藍(lán)色素的穩(wěn)定性提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藻藍(lán)色素：河南中大恒源生物科技股份有限公司；單寧酸、沒食子酸、綠原酸、兒茶素(純度均>96%)：南京龍源天然多酚合成廠；迷迭香酸(純度>96%)：上海源葉生物有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型酸度計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TDL-5A型離心機(jī)：濟(jì)南賽信機(jī)械有限公司；WSC-S型色差儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；UV-6000PC型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pH值對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

分別使用檸檬酸和檸檬酸鈉、碳酸鈉和碳酸氫鈉配置成pH 2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖溶液。稱取9份藻藍(lán)色素分別溶于不同pH值的緩沖溶液中，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0.05%。之后進(jìn)行全波長掃描[16]和色差分析[19]，觀察其特征峰以及L*、a*、b*值的變化。全掃描波長范圍200～800 nm，在色差分析測量前使用校準(zhǔn)白板進(jìn)行色度校準(zhǔn)，定量稱取所測樣品進(jìn)行色差L*、a*、b*值測定，3次平行。

1.3.2 溫度對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

配制7份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的藻藍(lán)色素溶液，置于溫度分別為4、25、35、45、55、65、75 ℃的水浴鍋中進(jìn)行穩(wěn)定性試驗，測其A620 nm，每隔0.5 h測量1次，一共測8次，3次平行，根據(jù)下式計算保存率。

1.3.3 光照對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

用蒸餾水配制4份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的藻藍(lán)溶液，分別置于室外強光、室內(nèi)強光、室內(nèi)弱光、避光條件下進(jìn)行光照穩(wěn)定性試驗，測其A620 nm，每隔1 h測定1次，共測6次，3次平行，計算保存率。

1.3.4 糖對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性影響

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%藻藍(lán)色素溶液以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)均分別為0、2%、4%、6%、8%、10%的葡萄糖溶液、蔗糖溶液、果糖溶液。分別依次吸取5 mL藻藍(lán)溶液和5 mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖溶液、蔗糖溶液以及果糖溶液進(jìn)行混合、搖勻、靜置，每隔24 h進(jìn)行A620 nm測定，測定3次，計算保存率。

1.3.5 金屬離子對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%藻藍(lán)色素溶液以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)均分別為0、2%、4%、6%、8%、10%的氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸銅溶液，分別依次吸取5 mL藻藍(lán)溶液和5 mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸銅溶液，測定A620 nm，計算保存率。

1.3.6 抗氧化劑對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的藻藍(lán)色素溶液以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)均分別為0、2%、4%、6%、8%、10%的抗壞血酸、檸檬酸溶液，分別依次吸取5 mL藻藍(lán)溶液和5 mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的抗壞血酸、檸檬酸溶液，測定A620 nm，計算保存率。

1.3.7 pH 2.5條件下SDS對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

準(zhǔn)確稱取8份藻藍(lán)色素，溶于pH 2.5的檸檬酸鈉緩沖液使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0.05%，再依次添加SDS，使其在溶液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.20%、0.40%，之后進(jìn)行全波長掃描和色差分析。

1.3.8 pH 2.5條件下多酚對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

準(zhǔn)確稱取5份藻藍(lán)色素，溶于pH 2.5的檸檬酸鈉緩沖液使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0.05%，再依次分別添加單寧酸、迷迭香酸、沒食子酸、綠原酸、兒茶素，使其在藻藍(lán)溶液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0.01%，之后進(jìn)行全波長掃描和色差分析。

1.3.9 統(tǒng)計分析

使用SPSS 22統(tǒng)計軟件分析所有數(shù)據(jù), 結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。P<0.05表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

由圖1a可知，藻藍(lán)色素除620 nm處的特征吸收峰外，還有280 nm、350 nm處的吸收峰，分別對應(yīng)芳香族氨基酸、藻藍(lán)膽素。溶液pH<3.0時，在可見光區(qū)出現(xiàn)了兩個峰，并向長波長方向移動;pH>3.0時，只有一個最大吸收峰，并且峰的強度隨著pH值增高先增大后減小;在pH 5.0、6.0時有著比較高的峰值。而在紫外光區(qū)的最大吸收峰強度則正好和可見光區(qū)相反。在圖1b中，Avis/Auv為可見光區(qū)最大吸收峰強度值與紫外光區(qū)最大吸收峰強度之比。(Avis/Auv)>1時，發(fā)色團(tuán)為伸展的構(gòu)象；(Avis/Auv)<1時，發(fā)色團(tuán)為卷曲的構(gòu)象[21]。由圖1b可知，藻藍(lán)色素的Avis/Auv在pH 2.5、3.0時在1附近，而后隨著pH值的增加Avis/Auv先增大后變小，在pH 6.0時達(dá)到最大值。蛋白質(zhì)所處溶液pH值偏酸或偏堿，都會造成蛋白質(zhì)一定程度的變性，因而會對蛋白發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。當(dāng)結(jié)構(gòu)受到破壞時，發(fā)色團(tuán)雖然還結(jié)合在蛋白質(zhì)上，但它是一種更傾向于卷曲或更折疊的構(gòu)象，而天然藻藍(lán)色素發(fā)色團(tuán)的構(gòu)象則是一種更加伸展的構(gòu)象。發(fā)色團(tuán)構(gòu)象的變化會引起π電子系統(tǒng)形狀不同，從而會產(chǎn)生不同的吸收光譜。如圖1c所示，在pH 6.0時b*值最低，說明藻藍(lán)色素溶液在此pH值下藍(lán)色最深；在pH<6.0時，溶液的L*值隨著pH值的降低而增大，說明在偏酸時，溶液的顏色更亮，a*值和b*值也都隨著pH值的降低而增大，說明藻藍(lán)色素在偏酸環(huán)境中更趨于綠色；pH>6.0時，溶液的L*值隨著pH值的增大也增大，說明藻藍(lán)色素溶液在偏堿時更亮，a*值和b*值隨著pH值的增大也增大，說明偏堿環(huán)境不利于藻藍(lán)色素藍(lán)色的呈現(xiàn)。藻藍(lán)色素在不同pH值條件下的實物圖如圖1d所示，在pH 2.5、3.0時，藻藍(lán)色素不僅由藍(lán)色變?yōu)榫G色，而且還有沉淀生成，在偏堿環(huán)境下，也出現(xiàn)了不同程度的褪色。因此，藻藍(lán)色素應(yīng)在pH 4.0～7.0條件下保存。

圖1 pH值對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of pH on the stability of phycocyanin

2.2 溫度對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

由圖2可知，藻藍(lán)色素在4～55 ℃時有著較高的保存率，在高于55 ℃后，保存率開始出現(xiàn)明顯的降低。高溫會導(dǎo)致藻藍(lán)色素中的蛋白質(zhì)變性而使蛋白質(zhì)發(fā)色團(tuán)穩(wěn)定的構(gòu)象受到破壞，因而保存率下降。因此，藻藍(lán)色素應(yīng)低溫保存。

圖2 溫度對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of phycocyanin

2.3 光照對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，在室外強的日曬光照下，藻藍(lán)色素的保存率出現(xiàn)了明顯下降，因此，室外強光對藻藍(lán)色素的破壞作用非常大。光照會破壞藻藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)，從而使與之連接的發(fā)色團(tuán)構(gòu)象不穩(wěn)定而造成藻藍(lán)色素的保存率下降。在室內(nèi)強光、弱光以及避光的條件下，藻藍(lán)色素的保存率相差不大。因此，藻藍(lán)色素應(yīng)避光保存。

圖3 光照對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of light irradiation on the stability of phycocyanin

2.4 糖類對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

糖的添加會使藻藍(lán)色素表面張力增加，糖覆蓋其表面可以一定程度地維持和保護(hù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)[22]。糖在溶液中容易和水發(fā)生水合作用，使溶液的黏性增加，從而降低了晶核的生成速度而保護(hù)了藻藍(lán)色素。如圖4所示，在72 h時，藻藍(lán)色素在3種糖溶液中的保存率均隨糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加先增加而后降低，并分別在6%、4%、6%時達(dá)到最大值。由此可知，糖類的添加會對藻藍(lán)色素的保存率有一定的提高作用，但是過高和過低的濃度均對保存率的提高意義不大。葡萄糖、蔗糖、果糖的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6%、4%、6%。

圖4 糖類對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of sugar on the stability of phycocyanin

2.5 金屬離子對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

由表1可知，金屬離子除Na2SO4之外其他均出現(xiàn)了沉淀，并且顏色變淺，但添加Na2SO4的藻藍(lán)色素溶液藍(lán)色也會逐漸消失。這是由于金屬離子可以與藻藍(lán)色素中的蛋白質(zhì)發(fā)生作用，使其變性，從而出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集交聯(lián)的沉淀[23]。

表1 金屬離子對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響Table 1 Effect of metal ions on the stability of phycocyanin

2.6 抗氧化劑對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，隨著抗氧化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，藻藍(lán)色素的保存率急劇下降，這可能是藻藍(lán)蛋白中的活潑基團(tuán)如—COOH、—NH2等和抗氧化劑發(fā)生了作用，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)色團(tuán)構(gòu)象被破壞，造成色素保存率下降。

圖5 抗氧化劑對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of antioxidants on the stability of phycocyanin

2.7 在pH 2.5下SDS對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

由圖6a可知，在pH 2.5下空白組的藻藍(lán)溶液最大吸收峰強度明顯低于含有SDS的藻藍(lán)溶液，在SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%時出現(xiàn)了最高峰值。最高峰值從高到低對應(yīng)的SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.20%、0.10%、0.08%、0.40%、0.06%、0.04%、0.01%、0.02%。在化學(xué)變性的條件下，蛋白質(zhì)發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)將會受到影響，致使光譜性質(zhì)發(fā)生變化[24]。

由圖6b可知，添加SDS的藻藍(lán)溶液和空白相比，b*值有著很明顯的變化，當(dāng)SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)<0.06%時，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，L*值整體出現(xiàn)降低，a*值則先出現(xiàn)升高而后又降低，b*值則逐漸降低；當(dāng)SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)>0.06%時，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，L*值先降低之后又升高再降低，a*值先增大而后又減小，b*值趨于平緩。因此，SDS的添加對藻藍(lán)色素在酸性條件下的穩(wěn)定性有促進(jìn)作用。b*值的變化非常明顯，這可能是在添加SDS之后，藻藍(lán)色素會被包埋在由SDS形成的陰離子膠束中，從而在一定程度上避免了外界的酸性破壞。因此，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%的SDS對提高藻藍(lán)溶液在pH 2.5下的穩(wěn)定性有積極作用。

2.8 在pH 2.5下多酚對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響

多酚對藻藍(lán)色素的作用，會使其功能結(jié)構(gòu)特性和營養(yǎng)特性發(fā)生一定程度的改變[25]。由圖7a可知，在添加單寧酸的藻藍(lán)色素溶液全波長掃描分析中，在可見光區(qū)只有一個最大吸收峰，且強度最高，這可能與單寧酸和藻藍(lán)色素的結(jié)合相對較強有關(guān)。其他4種多酚與空白相比峰形沒有太大變化。從圖7b來看，多酚的添加對提高藻藍(lán)色素溶液在pH 2.5下的穩(wěn)定性并不顯著。分別添加不同多酚的藻藍(lán)色素溶液的L*值基本沒有發(fā)生明顯變化，a*值在兒茶素中出現(xiàn)最低值，b*值在單寧酸中最大，其余則變化不明顯。這可能與藻藍(lán)蛋白在偏酸的環(huán)境下變性影響了與多酚的絡(luò)合有關(guān)。因此，5種多酚未明顯改善藻藍(lán)色素在pH 2.5下的穩(wěn)定性。

圖6 在pH 2.5下SDS對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of SDS on the stability of phycocyanin at pH 2.5

圖7 在pH 2.5下多酚對藻藍(lán)色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of polyphenols on the stability of phycocyanin at pH 2.5

3 結(jié)論

藻藍(lán)色素在pH 4.0～7.0時能夠使發(fā)色團(tuán)蛋白質(zhì)構(gòu)象保持穩(wěn)定而顯示亮藍(lán)色，而在偏酸或偏堿時，藍(lán)色則轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，且在pH 2.5～3.0產(chǎn)生沉淀。溫度低于55 ℃以及避光保存時，色素保存率比較高。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、6%、6%的蔗糖、葡萄糖、果糖對藻藍(lán)色素在常溫下的穩(wěn)定性有促進(jìn)作用。氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸銅溶液均會使藻藍(lán)色素溶液產(chǎn)生沉淀，硫酸鈉雖不會使藻藍(lán)色素溶液產(chǎn)生沉淀，但會使藻藍(lán)溶液藍(lán)色完全喪失。抗壞血酸、檸檬酸均會使藻藍(lán)色素保存率下降。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%的SDS能顯著提高藻藍(lán)溶液在pH 2.5下的穩(wěn)定性，且藻藍(lán)色素溶液無沉淀生成。5種多酚的添加沒有明顯改善藻藍(lán)色素溶液在pH 2.5下的穩(wěn)定性。