雷萬學(xué)

河南財政金融學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 450046

果膠(pectin) 是一類易溶于水的酸性天然多糖類的高分子化合物，在高等植物的細胞壁中含量豐富，其主要成分為具有較高聚合度的D-半乳糖醛酸，分子內(nèi)各單元之間通過α-1，4糖苷鍵相連，分子中的部分羧基被甲酯化[1]。市場上銷售的果膠通常是以農(nóng)產(chǎn)品廢棄物如蘋果皮、橘子皮、柚子皮、葵花盤等為原料提取得到，在食品、制藥、醫(yī)療、生物工程和環(huán)境保護等行業(yè)中廣泛應(yīng)用，一般用作乳化劑[2]、穩(wěn)定劑[3]、膠凝劑[4]、增稠劑[5]、解毒劑[6]、藥物載體和吸附劑等[7-8]。果膠分子上帶有較多的羥基與羧基，有利于進行物化改性及化學(xué)修飾，從而改善其理化性質(zhì)與功能[9-12]。而研究果膠與季銨鹽的交聯(lián)反應(yīng)，給果膠分子表面固載抗菌基團，有望用于食品包裝和醫(yī)用敷料，為擴大果膠的應(yīng)用范圍開辟新的途徑。作者研究了果膠與二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨的交聯(lián)反應(yīng),得到果膠季銨鹽衍生物(P-OSA)，并對其進行了抗菌性能測定。

1 材料與方法

1.1 測試儀器

傅里葉變換紅外光譜儀：美國 Nicolet公司；AvanceⅢ400 MHz核磁共振波譜儀：瑞士 Bruker公司；納米粒度和Zeta電位儀：英國 Malvern儀器有限公司；掃描電子顯微鏡：美國 FEI公司。

1.2 試劑與材料

二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨(OSA)：美國AEGIS公司；果膠：自制；卵磷脂、吐溫-80等試劑均為分析純。

1.3 菌種與培養(yǎng)基

抗菌實驗中所用的3種菌種均為具有代表性的致病菌：第1種是革蘭氏陰性菌的代表，大腸桿菌Escherichiacoli(8099)；第2種是革蘭氏陽性菌的代表，金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC6538)；第3種為真菌的代表，白色念珠菌Candidaalbicans(ATCC10231)。沙堡氏液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均為青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.4 果膠季銨鹽衍生物的制備

1.4.1 果膠的制備

稱取500 g去蒂的新鮮柑橘皮，水洗晾干，壓榨出橘油。將固體用95%乙醇浸沒1 h，過濾，壓榨濾餅。如此反復(fù)3次，濾液合并后用于提取色素及回收乙醇，橘渣用水漂洗3次后壓榨脫醇。稱取200 g脫醇后的橘渣，加1.8 L水，用鹽酸調(diào)pH值為1.8，水浴加熱至95 ℃水解1 h，壓濾，濾渣用熱水洗滌2次。濾液濃縮后快速冷卻，用等體積的乙醇沉淀，壓濾，濾餅用乙醇充分洗滌3次后，80 ℃真空干燥，粉碎，過100目篩，得到類白色果膠粉[13]。

1.4.2 果膠季銨鹽衍生物的制備

稱量2.00 g自制的果膠粉6份，分別用質(zhì)量分數(shù)為5%、10%、15%、20%、25%、30%OSA的乙醇水溶液在室溫浸沒8 h，過濾，80 ℃真空干燥，置于索氏萃取器中用乙醇于80 ℃萃取24 h，以除去未反應(yīng)的OSA(或以其他分子間的作用力吸附在果膠上的OSA)，干燥，粉碎，過100目篩，得到果膠季銨鹽衍生物(P-OSA)。用微量凱氏定氮儀測定P-OSA的含氮量，計算固載率Y。

式中：N表示P-OSA中氮的質(zhì)量分數(shù)；451.18為OSA的分子量；14.01為氮的原子量。

OSA與果膠反應(yīng)制備果膠季銨鹽衍生物的化學(xué)反應(yīng)分為兩步，其化學(xué)反應(yīng)方程式分別見圖1和圖2。

圖1為OSA與果膠反應(yīng)制備果膠季銨鹽衍生物的化學(xué)反應(yīng)的第1步。OSA在常溫(或加熱)條件下與水發(fā)生水解反應(yīng)，OSA分子中的3個硅甲氧基水解形成相應(yīng)的硅羥基，主要產(chǎn)物為二甲基十八烷基[3-(三羥基硅基)丙基]氯化銨，副產(chǎn)物為甲醇。

圖1 OSA的水解反應(yīng)Fig.1 Hydrolysis reaction of OSA

圖2為OSA與果膠反應(yīng)制備果膠季銨鹽衍生物的化學(xué)反應(yīng)的第2步。在加熱的條件下，二甲基十八烷基[3-(三羥基硅基)丙基]氯化銨分子中的硅羥基與果膠分子中的碳羥基發(fā)生分子間的縮水反應(yīng)，生成果膠季銨鹽衍生物。

圖2 水解后的OSA與果膠的反應(yīng)Fig.2 Reaction between hydrolyzed OSA and pectin

1.5 測試和表征

采用FTIR 紅外光譜儀、AvanceⅢ400 MHz核磁共振波譜儀和 Zeta電位分析儀分別對產(chǎn)物進行紅外、1H NMR和Zeta電位測試。并采用掃描電子顯微鏡觀察產(chǎn)物的形貌結(jié)構(gòu)。

1.6 抗菌實驗

在3個250 mL 無菌錐形瓶中分別加入0.5 g 所制備的P-OSA(Y=15.64%)及90 mL無菌水，再各加入10 mL濃度為108cfu·mL-1的菌懸液，置入20 ℃恒溫水浴振蕩器中，控制轉(zhuǎn)速200 r/min，時間分別為5、15、30 min時，在相應(yīng)的錐形瓶中分別加入中和劑，再繼續(xù)振蕩作用10 min，分別將作用后的菌懸液各取0.5 mL，用10倍的梯度進行稀釋后，進行活菌計數(shù)實驗，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時間為48 h，計算原菌液的含菌數(shù)與實驗樣品溶液的存活菌數(shù)以及殺菌率[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 果膠和P-OSA紅外光譜分析

在常溫下，果膠和P-OSA的紅外光譜如圖3所示。

圖3 果膠(a)和P-OSA(b)的紅外譜圖Fig.3 FTIR spectra of pectin(a) and P-OSA(b)

2.2 果膠、OSA和P-OSA的1H NMR分析

果膠、OSA和P-OSA的1H NMR如圖4所示。

圖4 OSA(a)、果膠(b)和P-OSA(c)的1H NMRFig.4 1H NMR spectra of OSA(a), pectin(b) and P-OSA(c)

由圖4可知，在P-OSA的波譜中，除了出現(xiàn)果膠上的質(zhì)子共振峰外，還出現(xiàn)了OSA側(cè)鏈上的質(zhì)子共振峰，在δ0.88～0.91處出現(xiàn)了甲基(N+—C1～C17—CH3)的質(zhì)子共振峰，在δ1.29～1.39處出現(xiàn)了亞甲基[N+—C—C—(CH2)15—C]的質(zhì)子共振峰，在δ1.80～1.90處出現(xiàn)了亞甲基(N+—C—CH2—C—)的質(zhì)子共振峰，在δ3.11處出現(xiàn)了與氮相連接的甲基(N+—CH3)的質(zhì)子共振峰等，而且，在P-OSA波譜中OSA分子中的硅甲氧基的質(zhì)子共振峰(δ2.87，Si—O—CH3)已經(jīng)消失，這表明OSA已經(jīng)固載到果膠上，得到了目標產(chǎn)物P-OSA。

2.3 Zeta電位分析

溶液pH值對果膠和P-OSA的Zeta電位的影響見圖5。從圖5可以看出，果膠的零電位pH值較低，pH≈3.4，當溶液的pH <3.4 時，果膠的表面帶正電荷；當溶液的pH >3.4時，果膠的表面帶負電荷，而且，隨著溶液pH值的增加，果膠Zeta電位的絕對值也相應(yīng)增大。從圖5同樣可以發(fā)現(xiàn)，果膠季銨鹽衍生物P-OSA的零電位pH值較高，pH≈8.2，而且其表面所帶電荷隨溶液pH值的改變而變化的規(guī)律與果膠的情況類似。

由圖5可以看出，由于果膠的零電位在pH 3.4附近，在水溶液中帶負電荷，而且隨pH值的增大其負電荷增加。而P-OSA的零電位在pH 8.2附近，在水溶液中帶正電荷，這是由于P-OSA的表面固載了季銨鹽陽離子。

圖5 果膠和P-OSA的Zeta電位Fig.5 Zeta potential of pectin and P-OSA

2.4 SEM結(jié)果與分析

果膠與P-OSA的SEM照片如圖6所示。

圖6 果膠和P-OSA的SEM照片F(xiàn)ig.6 SEM characterization of pectin and P-OSA

從圖6可以看出，果膠與P-OSA兩個樣品中都存在較多的微孔，P-OSA的微孔大小及分布與果膠的相比沒有顯著差別，這說明在季銨鹽和果膠進行化學(xué)反應(yīng)形成果膠季銨鹽衍生物P-OSA的反應(yīng)過程中，沒有對果膠的外觀、形貌等方面產(chǎn)生顯著影響。

2.5 抗菌效果

通過懸菌定量實驗可以發(fā)現(xiàn)，果膠季銨鹽衍生物P-OSA分別和白色念珠菌、金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌接觸不同的時間，其殺菌效果亦不相同，具體情況見表1。

表1 P-OSA與實驗菌接觸不同時間的殺菌率Table 1 Bactericidal rate of P-OSA in contact with experimental microorganisms at different time

通過表1可以發(fā)現(xiàn)：所制備的樣品P-OSA的抗菌效果與作用時間呈正相關(guān)。隨著P-OSA分別與3種實驗微生物作用時間的延長，其殺菌率也隨之相應(yīng)提高，當作用時間為30 min時，P-OSA對3種實驗微生物的殺菌率均達到了99.99%。其中，當接觸時間≤15 min時，P-OSA對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌效果較好，而對白色念珠菌的抗菌效果稍差。這是由于P-OSA中帶正電荷的季銨基團容易與帶負電荷的細菌細胞膜結(jié)合，并對其進行干擾破壞，使胞內(nèi)物質(zhì)泄漏導(dǎo)致菌體死亡[15]。

3 結(jié)論

二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨通過化學(xué)鍵可以固載到果膠表面，制備果膠季銨鹽衍生物；果膠的零電位pH≈3.4，所制備的果膠季銨鹽衍生物的零電位pH≈8.2，季銨基團的引入導(dǎo)致其零電位顯著提高；抗菌實驗結(jié)果表明，所制備的果膠季銨鹽衍生物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及白色念珠菌均有良好的殺菌作用，接觸15 min的殺菌率分別為99.97%、99.99%和98.96%，接觸30 min的殺菌率均為99.99%。