欒鵬仟，周丹丹，王曉天，陳冉，高士耆，趙浩，黃琛，劉運(yùn)亭，高靜，姜艷軍，2

（1 河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津300130； 2 河北工業(yè)大學(xué)化工節(jié)能過程集成與資源利用國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津300130）

引 言

化學(xué)催化在催化領(lǐng)域一直占據(jù)著主導(dǎo)地位，尤其在精細(xì)化學(xué)品[1-3]、先進(jìn)材料[4-6]、電池[7-9]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，為人類社會(huì)進(jìn)步做出極大的貢獻(xiàn)。然而，化學(xué)催化仍然存在一些不可避免的缺點(diǎn)，如環(huán)境污染、選擇性差、反應(yīng)條件苛刻等。近年來，生物催化以其反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好以及（化學(xué)、區(qū)域和立體）選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)，在一定程度上能夠彌補(bǔ)化學(xué)催化的不足[10-11]。盡管如此，生物催化同樣也存在著許多局限，其中最為突出的是生物催化劑的穩(wěn)定性、催化反應(yīng)的多樣性、重復(fù)使用性等都遠(yuǎn)不如化學(xué)催化劑，并且制備條件復(fù)雜，周期長。將化學(xué)催化與生物催化相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)兩者的優(yōu)勢互補(bǔ)，并用于設(shè)計(jì)全新、精巧的反應(yīng)來合成高附加值產(chǎn)品，逐漸成為新的研究領(lǐng)域[12-13]。自1997 年B?ckvall 等[14]首次將水解酶和金屬催化劑結(jié)合在一起，化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化至今已經(jīng)取得了極大的進(jìn)步。

傳統(tǒng)的化學(xué)-酶催化轉(zhuǎn)化通常是逐步進(jìn)行的，即完成第一步反應(yīng)后需要通過復(fù)雜的分離純化技術(shù)將中間產(chǎn)物從體系中分離，然后才能進(jìn)行接下來的反應(yīng)。這種方式的化學(xué)-酶催化不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且增加了整個(gè)工藝的成本。為解決這些弊端，研究者開發(fā)了一鍋法化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)，所有反應(yīng)均在同一個(gè)容器中進(jìn)行，省略煩瑣的分離純化步驟，從而簡化工藝降低成本[15-17]。

盡管工業(yè)上使用化學(xué)-酶催化轉(zhuǎn)化的實(shí)例正在不斷增長，但其內(nèi)在的復(fù)雜性嚴(yán)重阻礙了這一概念的廣泛應(yīng)用，其中最大的障礙是化學(xué)催化與生物催化的不相容性。這種不相容性包括不同催化劑自身的不相容和催化條件差異導(dǎo)致的不相容。催化劑自身的不相容性主要表現(xiàn)在一鍋法轉(zhuǎn)化中化學(xué)催化劑與酶的直接接觸導(dǎo)致催化劑相互失活。例如，Latham 等[18]在結(jié)合鹵化酶和金屬鈀（Pd）的研究中發(fā)現(xiàn)，酶的氧化還原性和親和力會(huì)嚴(yán)重影響Pd的活性。而反應(yīng)條件的差異性表現(xiàn)得更為明顯，酶催化一般需要在條件較為溫和的水相介質(zhì)中發(fā)生，而大多數(shù)化學(xué)催化劑不僅要在高溫強(qiáng)堿下發(fā)揮作用，而且還需有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)。在這種苛刻的環(huán)境下，大多數(shù)的酶都很難維持原有的催化活性，例如酚酸脫羧酶（PAD）在疏水溶劑中是有活性的，但是長時(shí)間暴露在甲苯溶劑中會(huì)導(dǎo)致其完全失活[19]，而甲苯正是大多數(shù)化學(xué)催化劑較為理想的反應(yīng)介質(zhì)。化學(xué)催化劑和生物催化劑任何一方的失活都將直接導(dǎo)致化學(xué)-酶催化轉(zhuǎn)化的失敗，因此需要發(fā)展有效的策略來應(yīng)對(duì)不同原因?qū)е碌牟幌嗳荨?/p>

基于以上背景，本文總結(jié)了克服化學(xué)催化與酶催化不相容問題的方法和策略，包括時(shí)間分隔和空間分隔策略。另外，還介紹了化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化在手性化合物動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分和藥物分子（或中間體）合成等方面的應(yīng)用。最后，對(duì)未來化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化的發(fā)展方向進(jìn)行展望。

1 化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化構(gòu)建策略

催化條件（如溫度和pH）引起的不相容，決定了兩種催化反應(yīng)不能同時(shí)發(fā)生。因此一般采取時(shí)間分隔的方式，第一步反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)溫度和pH 到下一步反應(yīng)所需的范圍后，再加入催化劑與試劑進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。對(duì)于溶劑帶來的問題可采用兩相體系和非常規(guī)溶劑的方法來解決。催化劑不相容的問題通常采用空間分隔的策略來解決，具體方法包括將不同催化劑各自固定化、制備分隔式集成催化劑或借助高分子膜來分隔催化劑。通過這些手段均可有效實(shí)現(xiàn)不同催化劑的活性中心在空間上的分離，從而避免接觸失活。

1.1 催化條件不相容

1.1.1 時(shí)間分隔（temporal separation） 一鍋化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)分為三類，分別為連續(xù)、并行和協(xié)同反應(yīng)。在反應(yīng)過程中需要調(diào)節(jié)體系溫度、pH、底物濃度等條件的反應(yīng)為典型的連續(xù)反應(yīng)。與其他兩類反應(yīng)相比，連續(xù)反應(yīng)過程需要進(jìn)行額外的操作，譬如添加反應(yīng)組分或調(diào)節(jié)反應(yīng)條件等，使得過程更加煩瑣，但是該方法可以將更多催化條件相差很大的催化劑級(jí)聯(lián)在一起，創(chuàng)造出更多全新的一鍋化學(xué)-酶催化反應(yīng)，因此應(yīng)用最為廣泛。

González-Sabín 等[20]通過連續(xù)反應(yīng)的方式實(shí)現(xiàn)了釕（Ru）基催化劑和轉(zhuǎn)氨酶（ω-TA）的結(jié)合。如圖1（a）所示，Ru催化的烯丙醇異構(gòu)化在50℃條件下進(jìn)行，而ω-TA 卻不能耐受50℃的高溫條件。此外，在研究中發(fā)現(xiàn)底物烯丙醇對(duì)轉(zhuǎn)氨酶的活性存在一定程度的影響。因此，在化學(xué)催化完成之后，先降低溫度到轉(zhuǎn)氨酶耐受的范圍，將體系稀釋使底物濃度降低從而減小對(duì)酶活的影響，最后再將轉(zhuǎn)氨酶引入體系，進(jìn)行后續(xù)的生物催化。由此可看出采取連續(xù)反應(yīng)的方式進(jìn)行一鍋化學(xué)-酶催化轉(zhuǎn)化可以有效地消除催化條件差異帶來的不相容問題。

金屬催化的C—C 交叉偶聯(lián)反應(yīng)已被公認(rèn)為有機(jī)化學(xué)中形成C—C 鍵最有力和最通用的合成工具之一，如Suzuki、Heck 和Negishi 反應(yīng)。這類反應(yīng)最吸引人的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于其可在水相中進(jìn)行，有利于與生物催化的結(jié)合。Groger 等[21]首次將Pd 催化的Suzuki交叉偶聯(lián)反應(yīng)與醇脫氫酶（ADH）催化的酮還原反應(yīng)相結(jié)合，并成功地在水相中完成了二者的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如圖1（b）所示。在70℃的堿性水溶液中，Pd(PPh3)Cl2催化苯硼酸與對(duì)溴苯乙酮發(fā)生C—C 交叉偶聯(lián)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后無須分離中間產(chǎn)物，待體系溫度降為室溫、調(diào)節(jié)pH 到中性后加入ADH 進(jìn)行后續(xù)的還原反應(yīng)，最終生成一系列手性二芳醇。Garg等[22]用類似的方法在水中級(jí)聯(lián)制備抗阻胺藥物奧非那汀的對(duì)映體。Turner 等[23]開發(fā)了一種一鍋化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，采用了時(shí)間分隔的連續(xù)反應(yīng)方式，最終得到一系列光學(xué)純的N-保護(hù)的非天然L-和D-二芳基丙氨酸衍生物。

除了前面介紹的交叉偶聯(lián)反應(yīng)外，González-Sabín 等[24]采用連續(xù)反應(yīng)的方式成功地在水相中將KRED 催化的不對(duì)稱還原反應(yīng)與金屬催化的炔烴環(huán)異構(gòu)化反應(yīng)相結(jié)合，以較高的產(chǎn)率合成了1,4-二醇、內(nèi)酯、γ-羥基羰基化合物（羧酸、酯和酰胺）等多種對(duì)映體純化合物，如圖2（a）所示。同年該課題組又建立了外消旋醇不對(duì)稱轉(zhuǎn)化為胺的化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化體系[25]，如圖2（b）所示。將有機(jī)催化劑2-氮雜金剛烷-N-氧自由基（AZADO）、氧化劑次氯酸鈉（NaOCl）和轉(zhuǎn)氨酶結(jié)合，在水介質(zhì)中實(shí)現(xiàn)了一鍋氧化-胺化連續(xù)過程。該方法具有寬廣的底物譜，包括傳統(tǒng)的仲醇和空間位阻較大的β-取代環(huán)烷醇。其中高度立體選擇性的不對(duì)稱生物胺化使整個(gè)反應(yīng)過程具有非常高的產(chǎn)率、光學(xué)純度和非對(duì)映選擇性（產(chǎn)率＞90%，ee＞99%，dr＞49∶1）。

化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中催化劑的不相容性及其交叉反應(yīng)性問題頻繁出現(xiàn)，使得大多數(shù)例子都是連續(xù)的一鍋反應(yīng)，而不是真正的并行反應(yīng)。但是連續(xù)反應(yīng)也存在一些局限性，比如反應(yīng)過程中涉及可逆反應(yīng)或極不穩(wěn)定的中間體時(shí)，該方法則不適用。因此，需要發(fā)展其他的策略，以解決這些問題或?qū)崿F(xiàn)更為高效的并行反應(yīng)。

1.1.2 兩相體系 除了溫度和pH 引起的催化條件不相容外，溶劑引起的不相容性同樣不可忽視。絕大多數(shù)化學(xué)催化劑偏好有機(jī)介質(zhì)，在水相中很難正常發(fā)揮催化活性，但幾乎所有的酶對(duì)有機(jī)溶劑是不耐受的。而且，有機(jī)試劑在水相中的溶解度普遍較差，這大大增加了使用水作為反應(yīng)介質(zhì)的難度。因此，研究者利用兩相體系解決溶劑帶來的不相容問題以及底物溶解性問題[26-27]。該體系由兩種互不相溶的液體組成，化學(xué)催化劑溶解在有機(jī)相中，而酶溶解在水相中，從而有效地緩解溶劑帶來的不相容問題。從另一個(gè)角度上考慮，兩相體系在一定程度上也能限制不同催化劑之間的接觸，避免催化劑發(fā)生接觸失活。

圖2 水溶液中化學(xué)-酶催化不對(duì)稱級(jí)聯(lián)合成1,4-二醇、內(nèi)酯、γ-羥基羰基化合物[24（]a）及2-(芐氧基)環(huán)烷胺[25（]b）Fig.2 Chemoenzymatic for the asymmetric synthesis of 1,4-diols,lactones,γ-hydroxy-carbonyl compounds[24](a)and(benzyloxy)cycloalkanamines[25](b)in aqueous medium

Castagnolo 等[28]開發(fā)了一種由水和異辛烷組成的兩相體系用于一鍋化學(xué)-酶催化合成吡咯，如圖3（a）所示。首先底物和Ru 基催化劑溶于異辛烷中，酶溶于緩沖溶液中。隨著化學(xué)催化的不斷進(jìn)行，生成的中間產(chǎn)物3-吡咯啉不斷地向緩沖溶液中擴(kuò)散，隨即在單胺氧化酶（MAO-N 或6-HDNO）的作用下發(fā)生芳構(gòu)化反應(yīng)，從而在水相中生成吡咯。而且，生成的吡咯又不斷地從水相擴(kuò)散到有機(jī)相中，促進(jìn)了反應(yīng)平衡向產(chǎn)物方向的移動(dòng)，這是該反應(yīng)在溫和條件下高產(chǎn)率地合成吡咯的原因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該兩相體系解決了溶劑引發(fā)的不相容問題，而且還避免了化學(xué)催化劑與酶發(fā)生絡(luò)合作用。最近，該課題組又應(yīng)用該兩相體系，以脂肪族二烯丙基醚為原料，結(jié)合Ru基催化劑催化的烯烴復(fù)分解反應(yīng)和漆酶（laccase）催化的芳構(gòu)化反應(yīng)，通過一鍋法化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化合成了一系列呋喃類化合物[29]，如圖3（b）所示。由異辛烷與緩沖溶液組成的穩(wěn)定的兩相體系還被應(yīng)用于其他一鍋化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中[30-31]。

圖3 兩相體系一鍋化學(xué)-酶催化合成吡咯[28]（a）和呋喃[29]（b）類化合物Fig.3 One-pot chemoenzymatic synthesis pyrroles[28](a)and furans[29](b)compounds though biphasic system

蔗糖磷酸化酶（SP）能夠催化蔗糖可逆地磷酸化為α-D-葡萄糖-1-磷酸和D-果糖，其廣泛的受體特異性被開發(fā)用于葡萄糖向多種受體分子轉(zhuǎn)化，如多元醇、酚類、羥基呋喃酮和二苯乙烯類化合物。然而由于SP 對(duì)這些底物的低親和力(Km＞1 mol/L)，通常情況下需要向體系中加入二甲亞砜或甲醇等助溶劑來提高底物的溶解度。助溶劑的濃度對(duì)反應(yīng)影響很大，濃度過低時(shí)不足以溶解足夠的底物，而濃度過高時(shí)會(huì)直接抑制酶的活性甚至使其失活。Winter 等[32]利用由緩沖溶液和乙酸乙酯組成的兩相體系通過化學(xué)-酶法合成α-D-葡萄糖苷。水相中含有酶和水溶性底物，而疏水性底物則溶解在有機(jī)相中。通過攪拌或搖動(dòng)使這些底物由有機(jī)相轉(zhuǎn)移到水相，并在水相中發(fā)生酶催化轉(zhuǎn)化。通過對(duì)比產(chǎn)物2-O-α-D-葡萄糖苷鄰苯三酚在助溶劑體系和兩相體系中的轉(zhuǎn)化率，發(fā)現(xiàn)后者的轉(zhuǎn)化率提高了5 倍之多，有效地抑制了副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

手性亞砜是一類具有生物活性的重要化合物，其中一些亞砜是市售藥物的活性成分，如奧美拉唑[33]。此外，它們還可作為不對(duì)稱合成中的手性配體、催化劑和構(gòu)建模塊[34]。Mí?ek 等[35]在由緩沖溶液和正癸烷組成的兩相體系中首次開發(fā)了對(duì)手性亞砜進(jìn)行去消旋化反應(yīng)。在該反應(yīng)體系中，酶可以耐受不同的取代基，底物的適用范圍較廣，為合成對(duì)映體純亞砜提供了一條可行的途徑。

PAD 是典型的在有機(jī)溶劑中失活的酶，而且催化的底物在水中溶解度極低。Kara等[36]將PAD的脫羧反應(yīng)與Pd催化的對(duì)羥基苯乙烯氫化反應(yīng)耦合，在由緩沖溶液和正己烷組成的兩相體系中合成4-乙基愈創(chuàng)木酚。然而這種傳統(tǒng)的兩相催化體系存在一個(gè)很明顯的缺陷，反應(yīng)僅發(fā)生在表面積有限的液面之間，導(dǎo)致反應(yīng)速率緩慢。解決這類問題最直接的方法是增大液面之間的接觸面積。Kourist等[37]將PAD 封裝于聚乙烯醇（PVA）/聚乙二醇（PEG）冷凍凝膠中與化學(xué)催化劑催化的烯烴復(fù)分解反應(yīng)級(jí)聯(lián)制備具有強(qiáng)抗氧化活性的4,4′-二羥基二苯乙烯，如圖4（a）所示。封裝后的PAD 不僅可在叔丁基甲醚（MTBE）中正常進(jìn)行催化，而且凝膠還增大了液面的接觸面積。底物從有機(jī)相進(jìn)入水相，催化得到的中間產(chǎn)物重新進(jìn)入有機(jī)相。分離PAD 凝膠后，添加化學(xué)催化劑進(jìn)行后續(xù)的烯烴復(fù)分解反應(yīng)。

如上所述，將酶封裝于“油包水”的結(jié)構(gòu)中可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)相中的酶催化反應(yīng)。與之類似，將化學(xué)催化劑封裝于“水包油”的結(jié)構(gòu)中可以實(shí)現(xiàn)水相中的化學(xué)催化反應(yīng)。TPGS-750-M 表面活性劑在水中可形成內(nèi)部疏水外部親水直徑約50 nm 的球形膠束，內(nèi)部的疏水核由維生素E 組成，可裝載過渡金屬催化劑和親脂底物，如圖4（b）所示。反應(yīng)發(fā)生在這些特制的納米反應(yīng)器內(nèi)部的疏水核心，并且生成的產(chǎn)品在膠束之間可通過水進(jìn)行動(dòng)態(tài)交換，因此存在與酶構(gòu)建級(jí)聯(lián)反應(yīng)的潛力。Lipshutz 等[38]利用TPGS-750-M 形成的膠束實(shí)現(xiàn)了金屬催化反應(yīng)（Pd 催化Heck偶聯(lián)反應(yīng)、Au/Ag催化炔烴水合反應(yīng)和Rh催化1,4-加成反應(yīng)）與生物催化反應(yīng)（ADH 催化還原反應(yīng)）的結(jié)合，合成了一系列光學(xué)純的手性仲醇。其中，金屬催化的有機(jī)反應(yīng)發(fā)生在膠束內(nèi)部，而酶催化發(fā)生在與膠束相容的水介質(zhì)中。這類設(shè)計(jì)可有效地將金屬催化劑限制在有機(jī)相中，從而避免外部水相對(duì)金屬的干擾，同時(shí)也阻斷了酶與有機(jī)相的接觸，使酶能夠一直在水相中維持較高的活性。水中存在的納米膠束不僅可為化學(xué)和生物催化提供反應(yīng)介質(zhì)，而且還可作為底物、產(chǎn)物和催化劑的貯存器，起到降低非競爭性酶抑制的效果。

1.1.3 非常規(guī)溶劑（non-conventional media） 兩相體系在一定程度上可以緩解溶劑帶來的不相容問題，然而低產(chǎn)率和內(nèi)在的復(fù)雜性嚴(yán)重限制了兩相體系在間歇反應(yīng)中的應(yīng)用。近年來，非常規(guī)介質(zhì)的發(fā)展給上述問題帶來了新的解決方案[39]。非常規(guī)介質(zhì)包括：無溶劑過程、超臨界流體（SCFs）、生物質(zhì)衍生溶劑、氟化溶劑、離子液體（ILs）和低共融體（DESs）。本節(jié)將重點(diǎn)介紹非常規(guī)溶劑用于解決一鍋化學(xué)-酶催化過程中溶劑引起不相容問題的研究進(jìn)展。

ILs 是由有機(jī)陽離子和有機(jī)或無機(jī)陰離子組成的低熔點(diǎn)鹽，研究表明ILs 能夠通過產(chǎn)生的微環(huán)境穩(wěn)定不同種類的酶，并起到液體載體的作用。此外，使用ILs 作為反應(yīng)介質(zhì)，在一定程度上能夠增強(qiáng)生物催化劑的對(duì)映選擇性和催化劑活性，并使其具有更高的操作穩(wěn)定性。Schmitzer 等[40]在由含ILs 和水相組成的兩相體系中，實(shí)現(xiàn)了Pd 催化的Suzuki偶聯(lián)與ADH 催化的生物還原反應(yīng)的級(jí)聯(lián)。Suzuki 偶聯(lián)發(fā)生在ILs 相中，ILs 可增強(qiáng)金屬催化劑的催化活性和穩(wěn)定性。生成的中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到水/IL 界面上被ADH 還原，最終以高收率和高對(duì)映選擇性合成了一系列手性二芳醇。

圖4 （a）PAD封裝于PVA/PEG凝膠中用于一鍋化學(xué)-酶催化反應(yīng)[37]；（b）TPGS-750-M在水相中形成的膠束[38]Fig.4 Encapsulate PAD in PVA/PEG for one-pot chemoenzymatic cascade reaction[37]（a）；The designer surfactant TPGS-750-M forms micelles in water[38]（b）

DESs 是由廉價(jià)的生物可降解氫供體和氫受體組成的混合物，作為一種新型綠色溶劑在生物催化、金屬催化、有機(jī)合成和材料化學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。González-Sabín 等[41]首次將DESs 應(yīng)用于酮的不對(duì)稱胺化中。ω-TA 在75%（質(zhì)量）DESs和緩沖液組成的反應(yīng)介質(zhì)中具有很好的穩(wěn)定性。將Pd 催化的Suzuki 交叉偶聯(lián)反應(yīng)與異源外生菌ATA（EX-ωTA）催化的胺化反應(yīng)級(jí)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了在該混合介質(zhì)中合成雙芳胺。DESs 的增溶特性使金屬催化過程中底物的濃度和酶催化過程中中間產(chǎn)物的濃度分別升高至200 mmol/L 和25 mmol/L。與之前的研究相比，DESs的引入提高了產(chǎn)品12%的收率。并且ω-TA 在該混合溶劑中所展現(xiàn)出的超高酶活，無疑突出了生物可再生溶劑的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。Wang等[42]通過在兩相體系中加入DESs，得到了穩(wěn)定的微乳液。由于DESs降低了溶液的表面張力，加之脂肪酶的界面活化表現(xiàn)出的高活性導(dǎo)致產(chǎn)物的合成速率提高了六倍之多。

Capriati 等[43]將Ru 催化的烯丙醇異構(gòu)化與KRED 的不對(duì)稱生物還原進(jìn)行耦合，制備出一系列手性醇化合物。KRED 在由DESs 和緩沖溶液組成的混合溶液中表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性與催化活性，而且研究發(fā)現(xiàn)混合介質(zhì)中DESs 的含量越高，KRED 的對(duì)映選擇性越強(qiáng)，從而所得仲醇的光學(xué)純度越高。同年該課題組又以DESs 和緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì)獲得一組產(chǎn)率高、對(duì)映體純（ee＞99%）的手性雙芳醇[44]。

1.2 催化劑自身不相容

除了不同催化條件引起的不相容，催化劑自身不相容也是建立化學(xué)-酶催化體系時(shí)常見的障礙。解決此類問題最常用的方法是將催化劑空間分隔（space separation），阻斷活性中心在空間上的接觸?？臻g分隔的方法分為：獨(dú)立固定化催化劑、分隔式集成催化劑和膜分隔。本節(jié)將對(duì)近年來研究者通過制備各種先進(jìn)材料應(yīng)用于化學(xué)-酶催化反應(yīng)中解決催化劑自身不相容問題的研究進(jìn)行詳細(xì)介紹。

1.2.1 獨(dú)立固定化催化劑 將化學(xué)-酶催化反應(yīng)中的某一種催化劑采用固定化技術(shù)固定于載體中，將其限制在載體內(nèi)部。同時(shí)借助載體上的孔阻止另一種催化劑進(jìn)入載體內(nèi)部，使二者在空間上無法接觸。載體的選擇對(duì)催化劑的性能有著至關(guān)重要的影響。一般來說，載體的選取需要遵循以下幾個(gè)原則：（1）比表面積大，有足夠的空間容納催化劑；（2）穩(wěn)定性高，不僅要具有很高的機(jī)械穩(wěn)定性以免材料塌陷，還要具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性避免在反應(yīng)過程中引發(fā)副反應(yīng)；（3）制備過程簡單；（4）環(huán)保無毒；（5）成本低廉。

介孔硅基材料[45-46]憑借著高穩(wěn)定性、低毒性和高比表面積等優(yōu)勢在眾多材料中脫穎而出。Inagaki等[47]在研究中發(fā)現(xiàn)Rh 配合物與牛血清白蛋白（BSA）的直接接觸會(huì)嚴(yán)重影響Rh 的活性。于是他們將Rh 配合物固定于聯(lián)吡啶基周期性介孔有機(jī)二氧化硅（BPy-PMO）中，介孔的存在使蛋白質(zhì)無法進(jìn)入BPy-PMO 內(nèi)部與Rh 接觸。隨后將Rh@PMO 與馬肝醇脫氫酶（HLADH）結(jié)合，用于合成(S)-4-苯基-2-丁酮。由于避免了催化劑的失活，產(chǎn)品具有較高的轉(zhuǎn)化率和對(duì)映選擇性，并且Rh@PMO在2-環(huán)己烯-1-酮轉(zhuǎn)移加氫反應(yīng)中表現(xiàn)出較高的催化活性和對(duì)酶的耐受性。類似地，Akai 等[48]將制備的氧化釩催化劑固定在孔徑為3 nm 的介孔二氧化硅（MPS）中得到V-MPS。MPS 有效地將化學(xué)催化位點(diǎn)與酶催化位點(diǎn)分隔開，使兩種催化劑能夠在同一介質(zhì)中相容。

將有機(jī)金屬催化劑包埋在蛋白質(zhì)支架中制備人工金屬酶被認(rèn)為是解決催化劑接觸失活的有效方法。金屬催化劑被限制在宿主蛋白內(nèi)部，有效地避免了與外部其他酶的接觸。Ward 等[49]將金屬復(fù)合物[Cp*Ir(Biot-p-L)Cl]包埋到鏈霉親和素（Sav）中制備出人工轉(zhuǎn)移氫化酶（ATHase）。ATHase 保留了貴金屬的催化活性，并且與天然酶具有良好的相容性。為了證明該方法的通用性，該課題組成功地將ATHase與三種不同的天然酶結(jié)合，設(shè)計(jì)了一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。該課題組利用這一策略還制備出了具有原位再生NADH 能力[50]和依賴NAD(P)H[51]的人工金屬酶，并應(yīng)用于不同的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

然而單獨(dú)固定某一類催化劑存在一定的隱患，因?yàn)楣潭ê蟮拇呋瘎╇y免會(huì)發(fā)生泄漏，泄漏的催化劑同樣存在使另一種催化劑失活的可能。將兩類催化劑分別固定于不同載體上，不僅可同時(shí)提升兩種催化劑的穩(wěn)定性，還可借助載體對(duì)催化劑的保護(hù)作用消除催化劑泄漏所帶來的隱患。理論上，對(duì)于分隔催化劑活性中心的效果而言，將兩種催化劑分別固定在不同載體上是更優(yōu)的選擇。

金 屬 有 機(jī) 骨 架（metal-organic frameworks，MOFs）以其可調(diào)的孔道結(jié)構(gòu)、高比表面積和大孔隙率等優(yōu)勢近年來受到了研究者們的廣泛關(guān)注[52-53]。Li 等[54]將Pd 固 定 于MIL-101 中，同 時(shí) 還 制 備 了CalB-CLEAs 交聯(lián)酶聚集體，利用二者開發(fā)了一種高效的化學(xué)-酶催化體系用于1-苯乙胺的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分。該過程采用微波輻射技術(shù)不僅加快了外消旋速率，還降低了反應(yīng)溫度。固定化后的催化劑具有超高的轉(zhuǎn)化率和對(duì)映選擇性，而且重復(fù)使用9次后仍可維持很高的活性。Groger 等[55]將化學(xué)和生物催化劑分別固定于不同的高吸水性樹脂上，用于合成1,3-二醇。

1.2.2 分隔式集成催化劑 集成催化劑一般分為兩類，一類需要載體作為媒介，將酶與金屬共同固定于載體上；另一類則無須載體直接通過生物結(jié)合的方式將金屬連接在酶表面的氨基酸殘基上。無論是生物結(jié)合法還是簡單無差別的共固定方法都無法滿足催化劑空間分隔的目的，因?yàn)樵谥苽溥^程中不同催化劑就已經(jīng)發(fā)生接觸失活。將不同的催化劑有差別地固定在同一載體的不同位置上制備分隔式集成催化劑，才能有效地杜絕催化劑發(fā)生接觸失活。分隔式集成催化劑的另一大優(yōu)勢是在避免催化劑活性中心接觸的前提下，大大縮短了活性中心的距離，從而提高中間產(chǎn)物的局部濃度，加快反應(yīng)速率并且使反應(yīng)平衡向產(chǎn)物的方向移動(dòng)。制備具有空間分隔催化劑能力的先進(jìn)納米材料是該策略的前提條件。在過去的幾十年中，納米材料領(lǐng)域的迅速發(fā)展使得研究者可以制備出所需的載體并對(duì)其可進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控。制備分隔式集成催化劑一般需要將固定化酶和固定化金屬的方法結(jié)合起來，前者一般有物理吸附、共價(jià)交聯(lián)和包埋法；后者有共價(jià)交聯(lián)和前體原位生長法。

Jiang 等[56]制備了一種以PtPd 雙金屬為核、介孔多巴胺為殼的核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒。首先，將Pt和Pd的前體同F(xiàn)127 充分地溶解于水中。然后向混合液中滴加多巴胺溶液，多巴胺有足夠的還原力將前體還原成金屬顆粒同時(shí)自聚形成聚多巴胺（PDA）殼層包裹在金屬外表面。去除模板后得到PdPt@PDA 納米顆粒。隨后，采用共價(jià)結(jié)合法將酶固定于PDA 外表面得到分隔式集成催化劑，如圖5 所示。多巴胺殼層有效地將酶與雙金屬核分隔開，避免了催化劑之間的接觸失活現(xiàn)象。介孔結(jié)構(gòu)顯著地提高了傳質(zhì)和催化劑的利用率，進(jìn)而加強(qiáng)了級(jí)聯(lián)反應(yīng)的協(xié)同催化能力。該集成催化劑不僅可以實(shí)現(xiàn)一系列伯胺的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分（收率高達(dá)99%，光學(xué)純度高達(dá)98%），還可以將有機(jī)磷農(nóng)藥級(jí)聯(lián)降解為低毒的對(duì)氨基苯酚。Prasad 等[57]制備了類似的金屬核-殼-酶結(jié)構(gòu)的分隔式集成催化劑。以Au納米顆粒為核、氧化硅為殼層制備Au@mSiO2，將葡萄糖苷酶接枝到載體的外表面用于化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)，同樣取得了不錯(cuò)的效果。

圖5 PdPt@PDA@CalB的制備過程[56]Fig.5 Formation process of PdPt@PDA@CalB [56]

Wu 等[58]將Pd 納米粒子（NPs）和CalB 分步負(fù)載到功能化介孔氧化硅納米顆粒不同位置。首先，利用前體原位生長法將Pd NPs 固定于MSN 上得到Pd-MSN。為了提高集成催化劑在有機(jī)溶劑中的溶解性，改變顆粒的親疏水性，采用長鏈烷烴修飾載體，進(jìn)而得到疏水性的Pd-mMSN。最后通過疏水相互作用將酶固定于載體上得到CalB@Pd@mMSN。該方法不僅為催化劑的循環(huán)利用提供了多相載體，而且還避免了催化劑之間的相互失活。通過表面烷基化修飾后，雙功能催化劑可以分散在8 種有機(jī)溶劑中，因此所制備的催化劑在甲苯中合成己酸芐酯具有優(yōu)異的催化性能。Qi 等[59]將Pd 原位生長在MOFs 的孔道結(jié)構(gòu)內(nèi)，隨后通過與月桂酸進(jìn)行配體交換改變其在有機(jī)溶劑的分散性，最后將CalB 等酶固定于不同于Pd 的其他位置上。所制備的催化劑在苯甲醛和己酸乙酯合成己酸芐酯的過程中表現(xiàn)出優(yōu)異的催化活性。

除了單一孔徑材料之外，多級(jí)孔材料很好地契合了空間分隔催化劑的需求。Yang 等[60]構(gòu)建了一種多級(jí)孔硅基蛋黃殼@殼結(jié)構(gòu)用于空間分隔Pd NPs與CalB。首先，采用前體原位還原法將Pd NPs 固定于氨基修飾的介孔氧化硅納米微球上得到Pd/NH2-MSN。隨后采用有機(jī)硅輔助刻蝕技術(shù)制備蛋黃殼結(jié)構(gòu)的Pd/NH2-MSN@BTME。通過雙向分層方法，微球被具有大孔的介孔氧化硅殼包裹。最后采用吸附法將CalB 固定于大孔介孔孔道中，而不會(huì)進(jìn)入固定Pd NPs 的小孔中。該結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)不僅實(shí)現(xiàn)了兩種催化功能在一個(gè)納米反應(yīng)器中的固定化，而且還實(shí)現(xiàn)了不同催化活性位點(diǎn)的空間分隔。

細(xì)胞膜作為天然的“載體”，也為制備分隔式集成催化劑提供了一種可行的策略。細(xì)胞膜不僅可以為酶提供最佳的內(nèi)部環(huán)境避免其受到包括化學(xué)催化劑在內(nèi)的外界影響，而且利用整個(gè)細(xì)胞進(jìn)行催化直接省略了材料制備、分離純化酶和固定化酶的過程，僅需將化學(xué)催化劑固定在細(xì)胞表面即可。Lloyd 等[61]通過生物還原的方法將Pd NPs 固定在可過表達(dá)重組單胺氧化酶（MAO-N-D5）的大腸桿菌表面，用于合成對(duì)映體純的手性胺類化合物。該研究首次報(bào)道了全細(xì)胞生物金屬集成催化劑用于一鍋多步反應(yīng)，提供了一種可擴(kuò)展和高度靈活的平臺(tái)技術(shù)。受到該研究的啟發(fā)，研究者們基于全細(xì)胞開發(fā)了一系列集成催化劑用于一鍋化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)[62-65]。

圖6 利用PDMS套管分隔催化劑活性位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)Wacker氧化和酶還原反應(yīng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[66]Fig.6 Site-isolation of catalysts using a PDMS thimble for the combination of a Wacker oxidation and an enzymatic reduction[66]

1.2.3 膜分隔（membrane-base separation） 膜分隔技術(shù)是將兩種催化劑分別限制在膜的兩側(cè)，選取合適的膜材料限制催化劑的通過，達(dá)到催化劑空間分隔的目的。Groger 等[66]在結(jié)合CuCl2/PdCl2催化的苯乙烯Wacker 反應(yīng)和ADH 催化的還原反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)銅鹽對(duì)ADH 有著強(qiáng)烈的抑制作用。聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜可以很好地將化學(xué)催化與酶催化分隔開，從而避免了化學(xué)催化劑對(duì)酶的損害。如圖6 所示，在PDMS 套管內(nèi)部進(jìn)行Wacker 氧化，中間產(chǎn)物在膜內(nèi)的濃度不斷升高，逐漸向膜外擴(kuò)散，而化學(xué)催化劑不會(huì)擴(kuò)散到膜外而是被限制在膜內(nèi)。擴(kuò)散到膜外的中間產(chǎn)物被ADH 還原，從而使反應(yīng)平衡向產(chǎn)物的方向移動(dòng)，并且ADH 同樣限制在膜外。通過該策略在水相中將苯乙烯成功地轉(zhuǎn)化為1-苯乙醇（ee98%～99%）。

Latham 等[18]同樣采用PDMS 膜分隔技術(shù)將催化劑的活性位點(diǎn)有效地分離，并且將酶制備成交聯(lián)酶聚集體增大酶的體積，使酶能夠被嚴(yán)格地限制在膜的一側(cè)。隨后PDMS 膜分隔技術(shù)還被用于更多的化學(xué)-酶催化體系[67-68]乃至多酶體系[69]，證實(shí)了該方法的通用性。

1.3 小結(jié)

本節(jié)介紹了時(shí)間和空間分隔等手段解決一鍋化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中常見的催化條件和催化劑本身的不相容問題，部分實(shí)例見表1。催化條件主要包括溫度、pH、底物濃度和溶劑的不相容。溫度與pH 的不相容通常采用連續(xù)反應(yīng)的方式來解決；底物濃度對(duì)催化劑的影響需添加溶劑進(jìn)行稀釋；而溶劑帶來的問題可借助兩相體系和非常規(guī)溶劑加以規(guī)避。催化劑本身的不相容需要采用制備分隔式集成催化劑和膜分隔的方法將催化劑的活性中心在空間上分隔。這些方法是互補(bǔ)的，在解決實(shí)際問題時(shí)可選取兩種乃至更多的方法以達(dá)到最優(yōu)的效果。

表1 克服化學(xué)-酶催化不相容性的實(shí)例Table 1 Examples of overcoming chemoenzymatic incompatibility

2 化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化的應(yīng)用

2.1 動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分

胺類和醇類等化合物的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分（DKR）是化學(xué)-酶催化反應(yīng)應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域之一[70-71]。它由酶催化動(dòng)力學(xué)拆分（KR）和金屬催化原位消旋化反應(yīng)組成，理論產(chǎn)率為100%，克服了傳統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)拆分產(chǎn)率最高只有50%的局限。對(duì)映體純胺類和醇類化合物是重要的合成原料，廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、食品添加劑、香料和醫(yī)藥等化工產(chǎn)品的生產(chǎn)。

脂肪酶具有優(yōu)異的對(duì)映選擇性、通用性和良好的疏水活性，常被用于手性醇和胺的動(dòng)力學(xué)拆分。Jiang 等[56]制備的雙金屬- 酶集成催化劑PdPt@PDA@CalB 完成了一系列胺衍生物的DKR 反應(yīng)，并取到了很高的收率與對(duì)映選擇性，如圖7 所示。同樣地，B?ckvall 等[72]將Pd 和CalB 共固定于硅基泡沫中用于對(duì)伯胺的DKR 反應(yīng)，與游離的催化劑相比，固定后的催化劑反應(yīng)效率和轉(zhuǎn)化數(shù)更高。Ge等[73]還對(duì)比了不同種類Pd-CalB 催化劑用于動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分1-苯乙胺的催化能力。

與胺類化合物相比，催化醇類DKR 反應(yīng)的催化劑種類更為廣泛，如V、Al、Ir 等金屬配合物，最為常用的是Ru配合物。B?ckvall 等[74]對(duì)此進(jìn)行了大量研究，Ru 基配合物與不同類型的酶結(jié)合用于脂肪醇、丙烯醇、氯乙醇、二醇、高烯丙醇和N-雜環(huán)1,2-氨基醇的DKR過程。Nolan等[75]報(bào)道新型陽離子Ru配合物用于催化仲醇的消旋化（該過程避免了強(qiáng)堿的使用），與脂肪酶結(jié)合用于一系列伯醇的拆分。此外，Akai 等發(fā)現(xiàn)釩絡(luò)合物[VO(OSiPh3)3]與各種脂肪酶結(jié)合，可用于鏈狀[76]和環(huán)狀[77]烯丙基伯醇的DKR 反應(yīng)。隨后他們還制備了一種新型的固定化金屬催化劑（V-MPD）[48]，用于苯甲醇、雜環(huán)芳烴和炔丙醇的DKR反應(yīng)，如圖7所示。

除了醇類和胺類的DKR 外，脂肪酶還與堿催化劑或過渡金屬催化劑偶聯(lián)用于合成更復(fù)雜的化合物。Ramstrom等[78]通過堿催化的半硫代縮醛形成反應(yīng)和CalB 催化的分子內(nèi)酯化反應(yīng)合成了一系列手性1,3-硫氧雜五元環(huán)化合物，最終產(chǎn)物具有良好的轉(zhuǎn)化率和對(duì)映體純度，如圖7 所示。該課題組將CalB 與一個(gè)動(dòng)態(tài)的多米諾酮加成環(huán)化反應(yīng)進(jìn)行耦合[79]，合成了一系列新的摻雜N、O和S的六元雜環(huán)。

2.2 藥物中間體的不對(duì)稱合成

圖7 PdPt@PDA[56]，V-MPD與CalB[48]和4-甲基嗎啉與CalB[78]動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分的產(chǎn)物譜Fig.7 Scope of DKR systems involving PdPt@PDA[56],V-MPD and CalB[48],and 4-methylmorpholine and CalB[78]

表2 化學(xué)-酶催化制備的手性藥物與中間體Table 2 Chemoenzymatic catalyzed preparation of chiral drugs and intermediates

目前市售的藥物有一半以上是手性化合物，化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化在手性藥物中間體的合成領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用?；瘜W(xué)-酶催化合成藥物的典型例子包括西他列汀、辛古拉和立普妥的制備，其中立普妥是迄今為止最為暢銷的藥物之一。Garg等[22]通過將Ni 催化的Suzuki 交叉偶聯(lián)反應(yīng)和KRED 進(jìn)行偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了在一鍋水介質(zhì)中將胺類化合物轉(zhuǎn)化成手性醇，結(jié)合后續(xù)的烷基化反應(yīng)成功制備了抗阻胺藥物奧芬那君。整個(gè)反應(yīng)均在水相中進(jìn)行，合成的產(chǎn)物不僅形成了新的C—C 鍵，而且還將其中一個(gè)參與反應(yīng)的C 原子變?yōu)槭中蕴?，省略了?fù)雜的逆合成步驟。

Hollmann 等[80]將ADH 催化還原反應(yīng)和Pd 催化的氫化反應(yīng)結(jié)合，由此制備的2-氨基-1-芳基乙醇衍生物是合成抗炎、抗病毒或抗腫瘤藥物的重要中間體。利用該化學(xué)-酶催化成功合成的藥物活性成分(S)-替巴胺是一種天然的苯甲酰胺衍生物，具有抗病毒（HIV）活性，進(jìn)一步突出了該反應(yīng)的合成價(jià)值。Gotor-Fernández 等[81]將金屬催化的烯丙基苯Wacker-Tsuji 氧化反應(yīng)與ω-TA 催化的生物還原反應(yīng)相結(jié)合，在水介質(zhì)中獲得了9 種具有光學(xué)活性的1-芳基-2-胺衍生物，其轉(zhuǎn)化率高達(dá)92%，對(duì)映體過量高達(dá)99%。該類化合物是合成苯丙胺類手性藥物的中間體。Xu 等[82]以環(huán)氧水解酶催化消旋的α-萘基縮水甘油醚拆分為關(guān)鍵步驟，通過后續(xù)的化學(xué)轉(zhuǎn)化合成了具有生物活性的普萘洛爾（一種典型的β 受體阻滯劑）。該藥物可用于治療心絞痛和心律不齊等疾病。

Berglund 等[83]開發(fā)出一種制備抗抑郁藥舍曲林的化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化方法。KRED 催化外消旋四氫萘酮的生物還原，以出色的光學(xué)純度和非對(duì)映選擇性（ee＞99%，dr＞99∶1）合成(S,S)-醇。隨后利用次氯酸鈉作為氧化劑和2-氮雜金剛烷氮氧化物（AZADO）作為有機(jī)催化劑，將生成的(S,S)-醇氧化為對(duì)映體(S)-酮，得到舍曲林的重要手性前體。該課題組[84]通過化學(xué)-酶法利用ω-TA和KRED設(shè)計(jì)了兩種合成路徑，均成功合成了能激活甲狀旁腺中的鈣受體，從而降低甲狀旁腺素(PTH)分泌的西那卡塞。通過化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化合成的手性藥物和手性藥物中間體還有很多，表2 對(duì)其中的一些典型案例進(jìn)行了總結(jié)，并介紹了藥物的適應(yīng)癥。

3 結(jié) 論

本文重點(diǎn)介紹了克服化學(xué)-酶催化過程中催化條件和催化劑不相容的策略，并對(duì)化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)匯總。采用時(shí)間分隔的連續(xù)反應(yīng)模式、多相催化和非常規(guī)介質(zhì)解決催化條件的不相容性；制備獨(dú)立固定化催化劑、分隔式集成催化劑和借助膜分隔技術(shù)在空間上分離催化劑活性位點(diǎn)，通過避免催化劑接觸失活解決催化劑之間的不相容性。這些方法充當(dāng)了銜接化學(xué)催化與酶催化之間的橋梁。盡管如此，發(fā)展更為簡單通用的方法仍然十分迫切，這對(duì)級(jí)聯(lián)催化體系的發(fā)展起著關(guān)鍵性作用。今后，借助酶定向進(jìn)化等技術(shù)對(duì)酶進(jìn)行強(qiáng)化，使酶具有更強(qiáng)的抗逆性和更廣的反應(yīng)性，可以大大增加酶與化學(xué)催化劑結(jié)合的機(jī)會(huì)，甚至使酶完全替代化學(xué)催化劑，使多酶體系取代化學(xué)-酶催化體系。另一方面，化學(xué)催化劑也將不斷發(fā)展，如在水相中的穩(wěn)定性更好，反應(yīng)條件更溫和，選擇性更高等。目前用于化學(xué)-酶級(jí)聯(lián)催化的化學(xué)催化劑大多數(shù)為貴金屬，例如用于動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分的Ru 和Pd，在實(shí)際應(yīng)用中開發(fā)廉價(jià)高效且綠色環(huán)保的催化劑是今后的工作重點(diǎn)。蛋白質(zhì)工程、材料科學(xué)以及合成生物學(xué)等不同研究領(lǐng)域的發(fā)展和交叉融合將進(jìn)一步推動(dòng)化學(xué)催化與生物催化的結(jié)合，級(jí)聯(lián)催化的反應(yīng)類型將不斷增加，實(shí)用性會(huì)更強(qiáng)，而且將越來越多地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。