康慧芳，喬勇進，劉晨霞,張怡，孫大鵬，仝瀟洋

1(上海市農(nóng)業(yè)科學院,農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海， 201403)2(上海師范大學 生命科學學院，上海， 200235)3(上海農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工工程技術(shù)研究中心，上海， 201403)4(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

葡萄為葡萄科(Vitaceae)葡萄屬植物，落葉藤本，果實營養(yǎng)豐富、味甜多汁、富含香味，集食療價值、醫(yī)用價值[1]、美容價值和商業(yè)價值于一身，深受廣大消費者青睞。然而葡萄是不耐貯藏水果之一，果實皮薄肉軟，采后極易受病原微生物侵染[2]，由此造成了巨大的經(jīng)濟損失。其中，交鏈孢霉腐病是葡萄果實最為突出的采后病害之一，主要致病菌為鏈格菌(Alternariaalternata)，其對生態(tài)環(huán)境的適應能力強，生長繁殖快，嚴重影響寄主的質(zhì)膜透性、酶活性、激素平衡及其他生理代謝過程，從而造成果實大量腐爛[3-4]。

二氧化氯氣體(ClO2)是一種安全高效的氧化性滅菌消毒劑，目前已被眾多國家廣泛應用于食品生產(chǎn)、飲用水、醫(yī)療器械、室內(nèi)污染、公共衛(wèi)生等方面的消毒殺菌[5-9]。目前已有大量研究表明,ClO2可以抑制或滅活細菌或真菌，可用于果蔬的保鮮，而關(guān)于ClO2對鏈格孢菌的研究鮮有報道。

本文將采用不同濃度的ClO2對離體鏈格孢菌和活體鏈格孢菌處理不同的時間，以不做任何處理作為對照處理，探索ClO2對葡萄鏈格孢菌的影響。通過測定與菌體相關(guān)的指標，研究ClO2對鏈格孢菌的抑制作用及抑菌機理，并在葡萄果實上接種驗證，旨在為ClO2在葡萄貯藏保鮮中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用的葡萄品種為“巨峰”，購于上海市奉賢區(qū)嘉園路87號水果店，挑選色澤、大小一致，且無機械損傷、無病蟲害的果實，購買當天裝在水果泡沫箱中運回冷庫預冷并貯藏于(4±0.5)℃的冷庫中。葡萄鏈格孢菌來源于華東師范大學生命科學學院，馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基中,4 ℃冰箱保存。

穩(wěn)定性ClO2溶液(氯酸鹽溶液及檸檬酸顆粒)購于國藥化學試劑有限公司；ClO2母液的配制：取氯酸鹽溶液10.0 mL，加入1.0 g活化劑，反應2 min后加入蒸餾水定容至1 000 mL，即為ClO2母液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

乙酸、無水乙酸鈉、鄰苯二酚、H2O2、愈創(chuàng)木酚、吐溫-80、PDA培養(yǎng)基、無水乙醇、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone, PVPP)、Triton X-100(均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒，南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultrospec 3300pro酶標儀,美國安馬西亞公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋,日本托米公司；CA-1480超凈工作臺,上海上凈凈化設(shè)備有限公司；D37520 Osterode高速冷凍離心機,德國Biofuge公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱,上海益恒實驗儀器有限公司；打漿機,廣東美的生活電器制造有限公司；SPX-250 B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XB-K-25血球計數(shù)板,上海求精生化儀器有限公司；IX71-A21PH倒置顯微鏡,日本奧林巴斯有限公司；GT-903泵吸式二氧化氯檢測儀,深圳市科爾諾電子科技有限公司;CRR-001高精度配氣儀,北京康爾興科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 孢子懸浮液的制備

采用LACHHAB等[10]的方法，將鏈格孢菌接種在PDA培養(yǎng)基上，在環(huán)境為(25±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d待菌絲長出，再用直徑為0.6 cm的打孔器在培養(yǎng)皿邊緣補位取5個菌碟置于加入10 mL含0.05%(體積分數(shù))吐溫-80無菌水的50 mL小燒杯中, 充分攪拌10 min洗孢子，經(jīng)雙層紗布過濾至另一個離心管中，再加入5 mL無菌水，用紅血球計數(shù)板計數(shù)，用無菌水將菌懸液中孢子濃度調(diào)整至1×106個/mL，備用。

1.3.2 實驗處理

1.3.2.1 實驗原理

ClO2處理葡萄鏈格孢菌的離體菌和活體菌的操作原理如下：將ClO2母液配制好倒置于透明塑料箱中密封放置一段時間，待氣體大量產(chǎn)生時接通塑料管道，將氣體緩慢輸入配氣儀，并通過調(diào)節(jié)配氣比例,輸出連續(xù)、穩(wěn)定的標準氣體濃度，并將氣體輸入到含有鏈格孢菌菌懸液的PDA培養(yǎng)基或者接種了鏈格孢菌葡萄的密閉塑料箱中，同時塑料箱的另一端用塑料管連接ClO2測定儀，當測定儀達到所需濃度時頃刻關(guān)閉配氣儀并啟動計時表。操作過程均在超凈工作臺進行，且操作前用75%(體積分數(shù))酒精將塑料箱、高精度配氣儀及ClO2測定儀擦拭3遍，后于超凈工作臺紫外殺菌過夜。另外在實驗前要根據(jù)所需氣體濃度，不斷嘗試并設(shè)定可短時間內(nèi)達到該氣體濃度的配氣比例為正式試驗做準備。ClO2濃度計算如公式(1)所示，公式(1)由深圳市科爾諾電子科技有限公司提供。

ClO2濃度=配氣儀顯示值(ppm)×67.46×22.4

(1)

式中：ClO2濃度單位為mg/m3，1 mg/m3=1 μg/L；67.46為ClO2分子質(zhì)量；22.4為特定系數(shù)。

1.3.2.2 離體實驗

取20 μL菌懸液滴在PDA培養(yǎng)基中心，室溫條件下放置4 h后放入消毒特制密閉箱中，在室溫(25±1)℃、空氣濕度為85%的條件下通入ClO2，使箱內(nèi)ClO2濃度分別達到1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 μg/L，且處理時間分別為10、20、30 min,然后置于(25±1)℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以不做任何處理作為對照處理，每天測定1組數(shù)據(jù)，直至對照組(CK組)菌落長滿培養(yǎng)皿。以6個培養(yǎng)皿為1個處理，每個處理設(shè)計3個重復。

1.3.2.3 活體接種實驗

選擇外觀整齊、無病蟲害和機械損傷的番茄果實，用自來水將果面沖洗干凈，然后用0.2%(體積分數(shù))的次氯酸鈉溶液浸泡2 min，接著用75%(體積分數(shù))酒精浸泡1 min，再用無菌水沖洗3次，晾干后用無菌剪刀剪下葡萄果實(保留果梗)后，用直徑2 mm的滅菌接種針在果實赤道部刺傷(深度3 mm)，滴入10 μL的菌懸液，室溫條件(20±1)℃下放置在上述特制密閉箱中4 h后，分別用3.0、6.0、9.0 μg/L的ClO2處理30 min，以在密閉箱中不通入ClO2為對照處理。每2 d測定1組數(shù)據(jù)，第10天時測定其落果率、果梗腐爛率以及失重率3項指標。每個處理組取200粒葡萄，設(shè)置3個重復。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 ClO2對鏈格孢菌菌絲生長的抑制作用

用十字交叉法統(tǒng)計每天鏈格孢菌的菌落直徑(cm)，用第6天時的菌落直徑來計算菌絲生長抑制率。菌落生長抑制率計算如公式(2)所示：

菌落生長抑制率/%

(2)

1.3.3.2 鏈格孢菌菌絲狀態(tài)倒置顯微鏡觀察

分別在PDA培養(yǎng)基中滴入20 μL濃度為1×106個/mL的鏈格孢菌菌懸液，超凈工作臺放置4 h后通入質(zhì)量濃度為1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 μg/L的ClO2處理10、20、30 min，不做任何處理設(shè)為對照組(CK組)，放置在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后用無菌刀在中央位置取2 cm×2 cm×2 cm的培養(yǎng)基小塊，制成玻片在倒置顯微鏡下觀察并拍照，每個玻片取不同的7個視野觀察并拍照，每組設(shè)置3個重復。

1.3.3.3 ClO2對鏈格孢菌芽管伸長的抑制作用

將離體菌如1.3.3.2處理，25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察并用顯微鏡上的測量尺測量每組芽管的長度(μm)并記錄，計算芽管生長抑制率。芽管生長抑制率計算如公式(3)所示：

芽管伸長抑制率/%

(3)

1.3.3.4 ClO2對鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用

將上述培養(yǎng)6 d后的鏈格孢菌用直徑為0.6 cm的打孔器在培養(yǎng)皿邊緣取3個菌碟，無菌水洗孢子并用托馬計數(shù)池進行計數(shù)，每組處理重復3次，通過公式(4)計算孢子萌發(fā)抑制率：

(4)

1.3.3.5 ClO2體對葡萄果實病害和貯藏品質(zhì)的影響

每3 d統(tǒng)計病斑直徑及病斑率，病斑直徑采用十字交叉法，取平均值；病斑直徑若>0.5 mm,則確定為發(fā)病，發(fā)病率計算如公式(5)所示：

(5)

1.3.3.6 抗性酶活力的測定

過氧化物酶(peroxidase，POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定；多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性采用鄰苯二酚比色法測定；MDA含量、CAT、SOD活性采用試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)運用Excel 2007和 Origin 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析,P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ClO2對鏈格孢菌菌絲體的影響

由表1可知，與對照組相比，各濃度ClO2處理對鏈格孢菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用，且隨著ClO2濃度的增加及時間的延長，對鏈格孢菌菌絲生長的抑制效果也逐漸增強，其中9.0 μg/L ClO2處理組的抑制率顯著大于其他各組(P<0.05)，培養(yǎng)第6天, 9.0 μg/L ClO2處理10 min和20 min時菌絲抑制率分別達到50.13%和84.88%，而9.0 μg/L ClO2處理30 min的培養(yǎng)皿從第1天～第6天，均未見菌絲長出，可能在滴取孢子懸浮液后并進行氣體處理時，9.0 μg/L ClO2在30 min內(nèi)將鏈格孢菌的孢子全部殺死，因此在培養(yǎng)過程中，沒有孢子可以萌發(fā)乃至長出菌絲。

表1 ClO2對鏈格孢菌菌落生長的抑制作用

2.2 ClO2對鏈格孢菌芽管伸長的抑制作用

由圖1可知，滴有鏈格孢菌孢子液的培養(yǎng)皿經(jīng)不同濃度ClO2處理并培養(yǎng)24 h后，與對照組相比，ClO2處理對鏈格孢菌芽管伸長均有不同程度的抑制作用。隨著ClO2濃度的增加和時間的延長，芽管伸長抑制率基本呈上升趨勢，其中9.0 μg/L ClO2處理10 min時，芽管伸長抑制率高達87.59%，顯著高于其他各組(P<0.05)，而9.0 μg/L ClO2處理20、30 min時均未有孢子萌發(fā)，未見芽管伸長。

2.3 ClO2對鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用

如圖2所示，培養(yǎng)皿經(jīng)不同濃度ClO2處理并在28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d后，經(jīng)0.05%(體積分數(shù))吐溫-80和無菌水清洗并觀察計算，發(fā)現(xiàn)ClO2處理組對鏈格孢菌孢子萌發(fā)均有不同程度的抑制作用，且鏈格孢菌孢子萌發(fā)抑制率和ClO2濃度以及處理時間基本成正比，ClO2濃度越大，處理時間越長，鏈格孢菌的孢子萌發(fā)抑制率越大，其中9.0 μg/L ClO2處理20 min，抑制率高達96.67%，顯著高于其他處理組(P<0.05)，而9.0 μg/L ClO2處理30 min時，6 d內(nèi)均未見菌絲生長，鏈格孢菌孢子萌發(fā)抑制率是100%。

圖1 ClO2對鏈格孢菌芽管伸長的抑制作用

圖2 ClO2對鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抑制效果

2.4 ClO2對鏈格孢菌菌絲形態(tài)的影響

如圖3所示，與對照組相比，經(jīng)ClO2處理培養(yǎng)的鏈格孢菌菌絲密集程度顯著下降，且ClO2處理組的菌絲表面粗糙且出現(xiàn)溝壑。而對照組的菌絲相當密集，有很多孢子在菌絲間長出，邊緣菌絲稀疏處可以觀察到菌絲表面光滑，緊密環(huán)繞。由此說明ClO2處理對鏈格孢菌孢子有一定失活效果，且對菌絲造成了很大損傷，高濃度可能會造成菌絲斷鏈。

A-對照處理;B-9.0 μg/L ClO2處理-10 min

2.5 ClO2對葡萄果實發(fā)病率的影響

如圖4所示，各組葡萄接種鏈格孢菌后逐漸開始染病，接種第2天～第8天，ClO2處理組的果實發(fā)病率顯著低于對照組(P<0.05)，接種第10天，CK組和3.0 μg/L ClO2處理組發(fā)病率均達到100%，而9.0 μg/L ClO2處理30 min時僅為47.71%，顯著低于其他各組(P<0.05)，綜上說明質(zhì)量濃度為9.0 μg/L的ClO2處理30 min能顯著降低葡萄采后交鏈孢霉腐病的發(fā)病率。

圖4 ClO2對葡萄發(fā)病率的影響

2.6 ClO2對葡萄果實中MDA含量的影響

如圖5所示，接種鏈格孢菌后，葡萄果實內(nèi)的MDA含量均呈上升趨勢，這是由于果實損傷導致。經(jīng)ClO2處理的果實MDA含量均低于對照處理，從第2天開始，9.0 μg/L ClO2處理30 min時果實中的MDA含量均顯著低于其他各組(p<0.05)，貯藏至第10天，9.0 μg/L 30 min處理組的MDA含量僅為 9.84 nmol/g，低于對照組4.83 nmol/g。說明經(jīng)質(zhì)量濃度為9.0 μg/L的ClO2處理葡萄能有效減緩果實內(nèi)部自由基對細胞膜的損傷。

2.7 ClO2體對葡萄果實中POD和PPO活性的影響

由圖6-A可知，葡萄接種鏈格孢菌后，貯藏期間各組果實的POD活性均呈先上升后下降的趨勢，對照組和9.0 μg/L ClO230 min處理組的POD活性在貯藏第4天達到高峰，而6.0 μg/L和9.0 μg/L ClO230 min處理組的POD活性均在第6天才達到高峰，且后者POD活性峰值顯著大于前者(P<0.01)，9.0 μg/L ClO230 min處理組的POD活性值顯著大于其他各組(P<0.05)，貯藏至第10天，該處理組的POD活性值為0.45 U/g，是對照組的2.14倍，說明9.0 μg/L ClO230 min 處理組能促使果實保持較高的POD活性。

由圖6-B可知，各組果實中的PPO活性均在上升和下降中來回波動，前4 d貯藏期間，各組果實的PPO活性值基本趨于下降趨勢，其中9.0 μg/L ClO230 min 處理組的PPO活性顯著大于其他各組(P<0.01)，第4天開始，各組PPO活性值均逐漸上升，第8天，9.0 μg/L ClO2處理組達到了最大值，PPO活性值為3.81 U/g，是對照組的3.97倍，接著出現(xiàn)下降趨勢，但貯藏至第10天，9.0 μg/L ClO2處理組的PPO活性值依然居于首位，達到 2.61 U/g。綜上說明經(jīng)質(zhì)量濃度為9.0 μg/L的ClO2處理能夠更快的誘導果實PPO活力的上升，并促使PPO活力保持較高水平。

A-POD活性；B-PPO活性

2.8 ClO2對葡萄果實中 CAT和SOD活性的影響

SOD是漿果中普遍存在的抗氧化酶類，它能將超氧陰離子歧化為H2O2和O2，從而起到清除活性氧、維持活性氧平衡、保護膜結(jié)構(gòu)的作用[11-12]。如圖7-A所示，接種鏈格孢菌后，各組果實SOD活性均呈先下降后上升，后期回降的趨勢，而9.0 μg/L ClO230 min 處理組的活性值一直顯著高于其他各組(P<0.05)。貯藏前6 d，各組SOD活性值均呈下降趨勢，其中9.0 μg/L ClO230 min 處理組的活性值一直居于首位，第8天，各組SOD活性值均出現(xiàn)峰值，其中9.0 μg/L ClO230 min 處理組的SOD活性值最高，為43.86 U/g，是對照組的1.37倍。貯藏至第10天，9.0 μg/L ClO230 min 處理組的SOD活性值依然居于首位，為33.89 U/g，顯著高于其他各組(P<0.01)。綜上說明果實經(jīng)質(zhì)量濃度為9.0 μg/L的ClO2處理30 min時能保持較高的SOD活性。

CAT 是果實后熟衰老中的保護性酶類，它能催化果蔬體內(nèi)積累的H2O2分解，從而減少H2O2對果蔬組織造成的傷害[13-14]。由圖7-B可知，夏黑葡萄接種鏈格孢菌后，各組果實CAT活性均在下降與上升的趨勢之間波動，貯藏第6天，各組CAT活性達到了峰值，其中9.0 μg/L ClO230 min處理組的CAT活性值顯著高于其他各組(P<0.01)，第6天開始各組CAT活性值開始下降，其中9.0 μg/L ClO230 min處理組下降速度相對比較緩慢，而第8天后開始上升，貯藏到第10天，9.0 μg/L ClO230 min處理組的CAT活性值依然居于首位，值為2.69 U/g，高于對照組0.96 U/g。由此表明，應用9.0 μg/L的ClO2處理夏黑葡萄30 min，能夠有效減緩H2O2的清除效率，延緩CAT活性的降低。

A-SOD活性；B-CAT活性

3 討論

研究不同濃度ClO2對離體鏈格孢菌的抑制效果，結(jié)果表明ClO2濃度越大，處理時間越長，抑制效果越好。韋明肯等[15]研究發(fā)現(xiàn)ClO2可以氧化氨基酸使蛋白質(zhì)變性，進而對果蔬起到殺菌消毒的作用。本實驗采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法測定了不同濃度ClO2對鏈格孢菌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著ClO2濃度的增大和時間的延長，離體鏈格孢菌的抑制效果越來越好，9.0 μg/L的ClO2處理離體菌10 min時，芽管伸長抑制率為87.58%，孢子萌發(fā)抑制率為88.33%，菌落生長抑制率高達50.13%，各項指標都顯著高于其他各組(P<0.05)，且在高倍顯微鏡下觀察，鏈格孢菌菌絲內(nèi)部細胞質(zhì)凝集，菌絲空洞化、發(fā)黑變粗、萎縮，而9.0 μg/L的ClO2處理30 min時，整個培養(yǎng)期間都未見菌絲長出。由此可見在起初處理時間內(nèi)，9.0 μg/L的ClO2殺死了鏈格孢菌的孢子，導致后期沒有孢子萌發(fā)乃至菌絲長出。

病原菌侵染葡萄漿果后，SOD、CAT、POD以及電子傳遞相關(guān)的PPO等組成了一個有效的活性氧自由基清除系統(tǒng)，能有效維持自由基在植物體內(nèi)產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡，保持膜結(jié)構(gòu)的完整性，增強果實抵抗病害的能力[16-17]。9.0 μg/L ClO2密閉熏蒸接種后的葡萄果實30 min，能夠在貯藏期間有效保持較高的PPO和POD活性，貯藏到第10天，PPO活性值是對照組的1.67倍，POD活性值是對照組的2.10倍。研究結(jié)果與集賢等[18]研究ClO2溶液對接種灰霉菌的采后葡萄進行處理，可增強果實抗性這一結(jié)果類似。且9.0 μg/L ClO2處理組能夠有效減緩果實內(nèi)部自由基對細胞膜的損傷，這一結(jié)果與前面果實貯藏期間能保持較好的抗氧化性結(jié)果相互對應。另外，9.0 μg/L ClO2處理組可以有效抑制果實CAT活性的降低和果實腐爛率的升高，貯藏到第10天，CAT活性值高于對照組0.96 U/g。同時，9.0 μg/L ClO2處理組還能夠保持較高的SOD活性，對抗與阻斷因氧自由基對果實細胞造成的損害，并及時修復果實受損細胞，延緩交鏈孢霉腐病對漿果的損害。

4 結(jié)論

ClO2能夠有效抑制離體鏈格孢菌的菌絲生長、芽管伸長以及孢子萌發(fā)，并對鏈格孢菌菌絲造成損傷，且ClO2濃度越高，處理時間越長，抑菌效果越好。當鏈格孢菌的孢子濃度為1×106個/mL時，9.0 μg/L ClO2處理30 min可完全抑制孢子的萌發(fā)。

ClO2處理降低了接種鏈格孢菌葡萄果的發(fā)病率，減少了果實內(nèi)MDA含量的積累，維持了較高的PPO和POD活性，且CAT和SOD活性在接種病原菌后一直保持顯著高于對照組的水平，有效維持自由基在植物體內(nèi)產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡，增強果實抵抗鏈格孢菌的侵染能力，其中效果最好的處理組是9.0 μg/L ClO2處理30 min。