房峻，周景文，曾偉主*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 未來(lái)食品科學(xué)中心，江蘇 無(wú)錫，214122)

α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，α-KG)是一種重要的二元羧酸，是三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)和氨基酸代謝過程中關(guān)鍵的中間代謝產(chǎn)物，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)碳氮源的利用速率[1-2]。α-KG廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化妝品等工業(yè)領(lǐng)域，如保健劑、抗氧化劑、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、雜環(huán)類化合物骨架和組織工程藥物載體等產(chǎn)品的生產(chǎn)[3-5]。目前，α-KG的主要生產(chǎn)方法包括化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法以及微生物發(fā)酵法。化學(xué)合成法主要通過琥珀酸和草酸二乙酯經(jīng)多步化學(xué)反應(yīng)合成，但由于產(chǎn)品選擇性低，生產(chǎn)過程中有毒物質(zhì)的使用和副產(chǎn)物的形成等缺點(diǎn)制約了α-KG在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用[6]。酶轉(zhuǎn)化法具有清潔、低污染等優(yōu)勢(shì)，但由于底物成本較高等條件限制，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)仍存在較大困難[7]。近年來(lái)，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)α-KG越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注[8]。

微生物發(fā)酵生產(chǎn)α-KG已有較長(zhǎng)的歷史，研究報(bào)道，很多微生物具有積累α-KG的能力，如石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacterparaffineus)、巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata)和解脂亞洛酵母(Yarrowialipolytica)等[9-10]。其中，Y.lipolytica具有大量合成α-KG的能力，且又是食品安全生產(chǎn)菌株，因而更受研究人員青睞[11]。研究發(fā)現(xiàn)，Y.lipolytica能夠利用乙醇[12]、甘油[13]、菜籽油[14]和纖維素[15]等可再生資源大量積累α-KG。本研究室在前期的工作中篩選得到1株α-KG高產(chǎn)菌株Y.lipolyticaWSH-Z06，在以甘油為唯一碳源時(shí)α-KG的產(chǎn)量為39.2 g/L[16]。又通過代謝工程改造和過程優(yōu)化等手段強(qiáng)化了α-KG的積累[17-18]。但是，應(yīng)用Y.lipolytica發(fā)酵法生產(chǎn)α-KG過程的低生產(chǎn)力仍是制約其工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。

在前期研究過程中，根據(jù)Y.lipolytica合成α-KG過程pH變化的特性，建立了一種α-KG高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，結(jié)合恒溫常壓等離子體誘變獲到了1株產(chǎn)量提高的突變株1-C6[19]?；诖耍狙芯繎?yīng)用甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone，EMS)、亞硝基胍(nitroso-guanidin,NTG)和紫外(ultraviolet,UV)等理化誘變方法對(duì)1-C6進(jìn)行迭代誘變，并對(duì)最終獲得的高產(chǎn)α-KG的Y.lipolytica突變株進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。在發(fā)酵罐水平上考察了轉(zhuǎn)速、通氣量、乙酸鈉(NaAc)和CaCO3添加量對(duì)α-KG積累的影響。通過探索不同的補(bǔ)料發(fā)酵模式，最終建立了一種恒速補(bǔ)料的發(fā)酵模式，強(qiáng)化了α-KG的生產(chǎn)，為實(shí)現(xiàn)利用發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)α-KG提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

解脂亞洛酵母Y.lipolyticaWSH-Z06(保藏號(hào)CCTCCNO：M20714)、1-C6為本研究室在前期的工作中選育[16,19]；2-G4、3-C3和4-E2由本研究獲得。

1.1.2 主要試劑

溴甲酚綠、喹哪啶紅，上海生工生物工程有限公司；鹽酸硫胺素、α-KG、丙酮酸(pyruvic acid，PA)，Sigma公司；其他試劑，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，大豆蛋白10，KH2PO41.0，MgSO4·7 H2O 0.5，固體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂，預(yù)篩培養(yǎng)基中加入0.5 g/L溴甲酚綠(過濾除菌)，115 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油100，(NH4)2SO43，KH2PO43，MgSO4·7H2O 1.2，NaCl 0.5，K2HPO40.1，鹽酸硫胺6×10-7(過濾除菌)，115 ℃滅菌15 min。根據(jù)不同發(fā)酵調(diào)控策略，在搖瓶和發(fā)酵罐中加入不同濃度的CaCO3(單獨(dú)滅菌)、無(wú)水NaAc和甘油等。

1.1.4 儀器與設(shè)備

QPix 420微生物篩選系統(tǒng)，美谷分子儀器(上海)有限公司；多孔板培養(yǎng)箱，德國(guó)Heidolph公司；3 L發(fā)酵罐，上海保興生物有限公司;Agilent 1260液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Cytation3全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTec公司；UV-245型紫外-可見分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

多孔板培養(yǎng)：將QPix挑選的菌落接種于250 μL/孔的96淺孔板中，裝液量為160 μL，28 ℃，900 r/min培養(yǎng)18 h(種子培養(yǎng))；將多孔板培養(yǎng)好的種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)接至4.6 mL/孔的48深孔板中，裝液量1 mL，28 ℃，900 r/min培養(yǎng)96 h(發(fā)酵培養(yǎng))。

搖瓶培養(yǎng)：將活化后的種子液以10%的接種量接種至裝有50 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28 ℃，200 r/min分別培養(yǎng)18 h(種子培養(yǎng))和168 h(發(fā)酵培養(yǎng))。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：將活化后的種子液以10%接種量接種于裝有2 L發(fā)酵培養(yǎng)基的 3 L發(fā)酵罐中，28 ℃培養(yǎng)240 h。

1.2.2 誘變方法

EMS誘變：將前期研究得到的突變株1-C6活化，取一定菌液，4 500 r/min離心10 min，生理鹽水洗滌2次。稀釋成菌體濃度為106～107個(gè)/mL的菌懸液，加入EMS溶液，使其終濃度為0～40 μL/mL(原液/稀釋體系，每4 μL 1個(gè)梯度)。28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h后，10 000 r/min離心2 min終止反應(yīng)。生理鹽水洗滌3次并制成合適的稀釋度涂布預(yù)篩平板，每組設(shè)置3個(gè)平行。28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)各平板上的菌落數(shù)，采用OriginPro 2019計(jì)算各處理濃度的致死率。

NTG誘變：將經(jīng)EMS誘變后獲得的高產(chǎn)菌株活化，取一定菌液，4 500 r/min離心10 min，生理鹽水洗滌2次。取一定量菌懸液，加入NTG溶液，使其終濃度為0、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)10 min后，10 000 r/min離心2 min終止反應(yīng)。生理鹽水洗滌3次，并制成合適的稀釋度涂布預(yù)篩平板，每組設(shè)置3個(gè)平行。28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)各平板上的菌落數(shù)，采用OriginPro 2019計(jì)算各處理濃度的致死率。

UV誘變：開啟15 W紫外燈預(yù)熱30 min，將經(jīng)NTG誘變后獲得的高產(chǎn)菌株活化，取一定菌液，4 500 r/min離心10 min，生理鹽水洗滌2次。取5 mL菌懸液加入直徑9 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，距離30 cm進(jìn)行紫外照射，照射時(shí)間分別為0、10、20、30、40、50、60、90、120、150 s。在紅燈下，取照射后的菌懸液，生理鹽水洗滌3次并制成合適的稀釋度涂布預(yù)篩平板，每組設(shè)置3個(gè)平行。28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)各平板上的菌落數(shù)，采用OriginPro 2019計(jì)算各處理時(shí)間的致死率。

1.2.3 篩選方法

根據(jù)前期研究建立的高通量篩選方法進(jìn)行篩選，篩選過程包括預(yù)篩、初篩和復(fù)篩[19]。

預(yù)篩：將誘變處理后的菌懸液稀釋至一定濃度，涂布于含有溴甲酚綠的預(yù)篩固體平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，采用QPix420微生物篩選系統(tǒng)挑取生長(zhǎng)快，變色圈(由藍(lán)變黃)與菌落直徑之比較大的菌株。

初篩：將預(yù)篩過程挑選出的菌株接種至多孔板中，28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，以10%的接種量將種子培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至48深孔板，培養(yǎng)96 h。離心，取200 μL上清液于96孔板中，每孔加入喹哪啶紅指示劑，反應(yīng)30 min。酶標(biāo)儀測(cè)定520 nm可見光下的吸光值。以當(dāng)次誘變處理的出發(fā)菌株為對(duì)照，挑選高產(chǎn)突變菌株。

復(fù)篩：挑取初篩產(chǎn)量較高的菌株，擴(kuò)培后轉(zhuǎn)接至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)168 h，測(cè)定發(fā)酵液中的α-KG、副產(chǎn)物PA的含量。

1.2.4 致死率的計(jì)算

致死率的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A，對(duì)照平板上的平均菌落數(shù)；S，誘變處理后平板上的平均菌落數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞干重的測(cè)定

參考文獻(xiàn)進(jìn)行細(xì)胞干重(dry cell weight，DCW)的測(cè)定，準(zhǔn)確吸取1 mL發(fā)酵液于50 mL容量瓶，加入15 mL 2 mol/L HCl與發(fā)酵液中的CaCO3充分反應(yīng)，用去離子水定容后混合均勻，在570 nm處測(cè)定OD值，根據(jù) OD570∶細(xì)胞干重(g/L)=1∶0.223計(jì)算細(xì)胞干重[16]。

1.2.6 α-KG、PA和甘油的測(cè)定

參考文獻(xiàn)利用Agilent 1260高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)測(cè)定，色譜條件：色譜柱Aminex HPX-87H ion exchange column，流動(dòng)相 5 mmol/L H2SO4，流速 0.6 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量 10 μL，紫外檢測(cè)器(波長(zhǎng)210 nm)用于檢測(cè)α-KG和PA，示差折光檢測(cè)器用于檢測(cè)甘油[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS、NTG和UV迭代誘變獲取α-KG高產(chǎn)菌株

應(yīng)用EMS、NTG和UV等對(duì)菌株1-C6進(jìn)行迭代誘變處理，后一次誘變以前一次誘變后得到的高產(chǎn)菌為出發(fā)菌株。首先將1-C6進(jìn)行EMS誘變，由圖1可知，低濃度的EMS對(duì)菌體致死效果不明顯，而當(dāng)濃度增加至16 μL/mL后，致死率隨著誘變劑濃度的增加不斷升高(圖1-A)。研究報(bào)道，應(yīng)用常規(guī)理化誘變方法進(jìn)行誘變處理，通常在致死率為70%～80%時(shí)正突變效果比較明顯[21-22]。選擇以終濃度為24 μL/mL的EMS對(duì)1-C6進(jìn)行誘變處理。經(jīng)預(yù)篩和初篩，獲得9株α-KG產(chǎn)量提高的突變株，繼續(xù)進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，結(jié)果如圖1-D所示。EMS誘變對(duì)菌株積累α-KG能力的提高不顯著，其中，2-G4相比出發(fā)菌株1-C6，α-KG的產(chǎn)量提高了9.7%，副產(chǎn)物PA的含量基本一致。

繼續(xù)對(duì)菌株2-G4進(jìn)行NTG處理，NTG對(duì)菌體致死效率高，NTG終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，致死率達(dá)58.9%，質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)致死率為97.3%，當(dāng)質(zhì)量濃度增加至0.3 mg/mL時(shí)致死率達(dá)100%(圖1-B)。選取終質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL的NTG對(duì)2-G4進(jìn)行誘變處理。經(jīng)預(yù)篩和初篩，獲得6株高產(chǎn)突變株，繼續(xù)進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，結(jié)果如圖1-E所示。NTG誘變效果明顯，突變菌株產(chǎn)量明顯增加，其中，相對(duì)出發(fā)菌株2-G4，菌株3-C3積累α-KG的量提高了33.5%，副產(chǎn)物PA含量基本一致。

繼續(xù)對(duì)菌株3-C3進(jìn)行UV處理，UV致死效果明顯，處理10 s時(shí)菌株致死率達(dá)65.1%，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)致死率增加，處理40 s時(shí)致死率達(dá)90.4%。繼續(xù)延長(zhǎng)處理時(shí)間，致死率呈先降低后升高的趨勢(shì)，但導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因仍有待進(jìn)一步研究(圖1-C)。選用20～40 s作為UV誘變的處理時(shí)間。經(jīng)預(yù)篩和初篩，獲得7株高產(chǎn)突變菌株，繼續(xù)進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，結(jié)果如圖1-F所示?？傮w來(lái)說(shuō)，UV誘變效果不顯著，α-KG的產(chǎn)量?jī)H有少量提高。相比出發(fā)菌株3-G3，菌株4-E2生產(chǎn)α-KG的量提高了10.6%，PA的含量提高了9.1%；菌株4-G12生產(chǎn)α-KG的量提高了10.7%，PA的量提高了5.1%。

為了驗(yàn)證突變菌株的遺產(chǎn)穩(wěn)定性，對(duì)經(jīng)EMS、NTG和UV迭代處理后獲得的高產(chǎn)菌株4-E2和4-G12進(jìn)行連續(xù)傳代10次，選取第5代和第10代進(jìn)行搖瓶(帶擋板)發(fā)酵，檢測(cè)突變菌株的發(fā)酵特性，以野生菌株Y.lipolyticaWSH-Z06和出發(fā)菌株1-C6為對(duì)照，結(jié)果如表1所示。傳代至第5代時(shí)，突變體4-E2和4-G12發(fā)酵積累α-KG的量分別為29.30、23.66 g/L。傳至第10代時(shí)，4-E2生產(chǎn)的α-KG產(chǎn)量與第5代的產(chǎn)量相當(dāng)，而4-G12的產(chǎn)量為22.41 g/L，僅為4-E2菌株的69.6%。最終，相比野生菌株Y.lipolyticaWSH-Z06，4-E2積累α-KG的量提高了134.0%；相比出發(fā)菌株1-C6，4-E2積累的α-KG量提高了56.7%。

表1 高產(chǎn)突變菌株的遺產(chǎn)穩(wěn)定性檢測(cè) 單位：g/L

A-EMS誘變致死曲線;B-NTG誘變致死曲線;C-UV誘變致死曲線;D-EMS誘變后搖瓶復(fù)篩;E-NTG誘變后搖瓶復(fù)篩;F-UV誘變后搖瓶復(fù)篩

2.2 攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)比對(duì)α-KG產(chǎn)量的影響

溶氧水平在發(fā)酵法生產(chǎn)α-KG過程中是一個(gè)重要的參數(shù)，由于在實(shí)驗(yàn)室水平的發(fā)酵罐上準(zhǔn)確控制溶氧水平比較困難，而攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)比是影響溶氧水平的2個(gè)重要參數(shù)。本研究通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)比，考察二者對(duì)菌株4-E2積累α-KG的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，選取2種攪拌轉(zhuǎn)速(400、600 r/min)和2種通氣比(1.5、2.0 L/min)進(jìn)行研究[17]。當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min，比較通風(fēng)比分別為1.5 L/min(圖2-A)和2.0 L/min(圖2-B)發(fā)現(xiàn)，低通風(fēng)比適合發(fā)酵前期菌體的生長(zhǎng)和α-KG的積累，高通風(fēng)比適合穩(wěn)定期發(fā)酵生產(chǎn)α-KG。于是，選擇采用兩階段控制通風(fēng)比策略(400 r/min，初始通氣量1.5 L/min，穩(wěn)定期后通氣量調(diào)整為2.0 L/min)進(jìn)行探索。采用兩段控制通風(fēng)比策略，α-KG產(chǎn)量提高至47.02 g/L，副產(chǎn)物PA含量降低至11.45 g/L(圖2-C)。當(dāng)適當(dāng)增加攪拌轉(zhuǎn)速至600 r/min時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌體生長(zhǎng)速度變快，發(fā)酵后期細(xì)胞利用PA轉(zhuǎn)化為α-KG的速度也有所加快，發(fā)酵168 h，α-KG的產(chǎn)量提高至52.53 g/L(圖2-D)。

2.3 NaAc添加量對(duì)α-KG產(chǎn)量的影響

研究報(bào)道，在培養(yǎng)基中添加適量的NaAc能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A的合成，較高濃度的乙酰輔酶A可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)TCA循環(huán)中草酰乙酸向檸檬酸的轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)α-KG的積累[23]。因此，考察了在培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaAc，搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-A所示。當(dāng)NaAc質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)，α-KG產(chǎn)量與不加NaAc時(shí)相當(dāng)；當(dāng)質(zhì)量濃度為6 g/L時(shí)，α-KG產(chǎn)量達(dá)到19.44 g/L，此時(shí)PA的量為3.64 g/L。隨著NaAc濃度的增加，α-KG產(chǎn)量緩慢增加，PA的含量增加變快。綜合考慮，NaAc的最佳添加量為6 g/L。在3 L發(fā)酵罐上對(duì)搖瓶發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)α-KG的最高產(chǎn)量與不加NaAc時(shí)(圖2-D)相當(dāng)，但NaAc的加入加快了菌體對(duì)PA的利用速率(圖3-B)。可見，NaAc的加入能加快后期菌體對(duì)PA的利用，縮短發(fā)酵周期，從而提高生產(chǎn)力。

2.4 CaCO3添加量對(duì)α-KG產(chǎn)量的影響

A-400 r/min，通氣量1.5 L/min;B-400 r/min，通氣量2.0 L/min;C-400 r/min，初始通氣量1.5 L/min，穩(wěn)定期后調(diào)整至2.0 L/min;D-600 r/min初始通氣量1.5 L/min，穩(wěn)定期后調(diào)整至2.0 L/min

A-搖瓶上的情況;B-發(fā)酵罐上的情況

A-搖瓶上的情況;B-發(fā)酵罐上的情況

2.5 補(bǔ)料發(fā)酵模式的探索

在攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min、兩階段控制通風(fēng)比、NaAc添加量6 g/L和CaCO3添加量10 g/L的基礎(chǔ)上，進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵的探索。研究了3種不同的補(bǔ)料策略：(1)一次性補(bǔ)料，當(dāng)pH開始反彈時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，84 h時(shí)一次性補(bǔ)入甘油100 g，即50 g/L(圖5-A)；(2)多節(jié)點(diǎn)補(bǔ)料，當(dāng)pH開始反彈時(shí)(84 h)開始補(bǔ)料，補(bǔ)入10 g/L。96、108、120、132 h時(shí)以10 g/L各補(bǔ)一次，共補(bǔ)入甘油100 g，即50 g/L(圖5-B)；(3)恒速連續(xù)補(bǔ)料，60 h時(shí)開始補(bǔ)料，以10 g/L每12 h的速度補(bǔ)入底物甘油，120 h時(shí)停止補(bǔ)料，共補(bǔ)入甘油100 g，即50 g/L(圖5-C)。由圖5可知，PA的產(chǎn)量均在144 h達(dá)到最大值，其中，在一次性補(bǔ)料過程中PA的產(chǎn)量最高。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，α-KG不斷積累，發(fā)酵結(jié)束后，3種補(bǔ)料策略中α-KG的最高產(chǎn)量均在75 g/L左右，恒速連續(xù)補(bǔ)料策略中達(dá)到最高產(chǎn)量75.86 g/L的時(shí)間提前至204 h。但是，恒速補(bǔ)料發(fā)酵過程中α-KG的產(chǎn)量達(dá)到最大值后，菌株不再轉(zhuǎn)化PA生成α-KG，α-KG和PA的含量均開始降低，這可能是由于發(fā)酵后期菌株活力不夠所導(dǎo)致。后期可針對(duì)這一現(xiàn)象展開研究，進(jìn)一步強(qiáng)化菌株積累α-KG的能力。

A-一次性補(bǔ)料;B-多節(jié)點(diǎn)補(bǔ)料;C-恒速連續(xù)補(bǔ)料

3 討論

α-KG是一種重要的具有多功能的有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于食品、制藥、日化和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。目前，通過代謝工程改造和發(fā)酵過程優(yōu)化等在一定水平上強(qiáng)化了α-KG的生產(chǎn)，但實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)仍存在一定難度。本研究基于前期建立的高通量篩選方法，應(yīng)用EMS、NTG和UV等誘變方法對(duì)α-KG高產(chǎn)菌株1-C6進(jìn)行迭代誘變，篩選獲得了1株產(chǎn)量明顯提高的突變株4-E2。在3 L發(fā)酵罐上對(duì)攪拌轉(zhuǎn)速、通風(fēng)比、NaAc和CaCO3添加量等條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)補(bǔ)料發(fā)酵模式進(jìn)行了探索。最終，在較高轉(zhuǎn)速兩階段控制通風(fēng)比(600 r/min，初始為1.5 L/min，pH值降低至3.5后調(diào)節(jié)至2.0 L/min)、NaAc添加量6 g/L和CaCO3添加量10 g/L條件下，應(yīng)用恒速連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵模式，發(fā)酵204 h菌株4-E2積累α-KG的量達(dá)75.86 g/L，產(chǎn)物得率為0.51 g/g。相比于分批發(fā)酵，α-KG產(chǎn)量提高了44.4%。

本研究基于高通量篩選技術(shù)和傳統(tǒng)誘變育種方法，并應(yīng)用發(fā)酵過程優(yōu)化強(qiáng)化了Y.lipolytica積累α-KG的能力，但與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道的利用可再生能源積累α-KG的菌株仍然存在一些差距。KAMZOLOVA等以Y.lipolyticaVKM Y—2412為出發(fā)菌株，利用乙醇為碳源可積累172 g/L的α-KG，得率為0.70 g/g[25]。HOLZ等以Y.lipolyticaH222-S4 (JMP6) T5為出發(fā)菌株，應(yīng)用菜籽油發(fā)酵生產(chǎn)獲得126 g/L的α-KG，得率為1.20 g/g[26]。當(dāng)以甘油為底物時(shí)，YOVKOVA等應(yīng)用Y.lipolyticaH355A (PYC1-IDP1)發(fā)酵獲得180 g/L的α-KG，得率為0.36 g/g[27]。近年來(lái)，針對(duì)解脂亞洛酵母的基因編輯方法日趨成熟，代謝調(diào)控機(jī)制日趨清晰[28-29]。在后續(xù)研究中，通過代謝組學(xué)分析細(xì)胞內(nèi)中間代謝途徑的代謝通量，結(jié)合代謝工程手段定向調(diào)控胞內(nèi)物質(zhì)流向，以及基于理性調(diào)控的精準(zhǔn)補(bǔ)料發(fā)酵策略，有望進(jìn)一步提高α-KG的積累量。本研究相關(guān)誘變、過程優(yōu)化和補(bǔ)料模式等對(duì)利用解脂亞洛酵母生產(chǎn)α-KG的放大實(shí)驗(yàn)和工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的參考意義。