夏辛珂，張媛娥，雷生姣*，胡彪，陳鈺亭，付彩霞,2

1(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌，443002)2(湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，湖北 宜昌，443000)

柚皮苷(4,5,7-trihydroxy-flavanone7-rhamnoglucoside)是一種天然存在于柑橘中的類黃酮物質(zhì)[1]，柑橘加工過(guò)程中因柚皮苷產(chǎn)生苦味是制約柑橘加工業(yè)發(fā)展的主要問(wèn)題之一[2]。相比膜技術(shù)、吸附法、超臨界CO2脫苦等方法[3-4]，酶法脫苦不僅效果好、無(wú)污染、工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和，而且能增強(qiáng)果汁風(fēng)味、保存果汁營(yíng)養(yǎng)成分[5]。

柚苷酶(EC 3.2.1.40)具有2種糖苷酶(α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶)活性[6]，它先在α-L-鼠李糖苷酶的作用下將柚皮苷水解為普魯寧(柚皮苷苦味的三分之一)和鼠李糖，普魯寧在β-D-葡萄糖苷酶的作用下水解為柚皮素(無(wú)苦味)和葡萄糖，從而實(shí)現(xiàn)脫苦[7]。除此之外，柚苷酶還具有提高果汁質(zhì)量，增強(qiáng)蘆筍汁抗氧化活性，水解糖苷、皂苷，增強(qiáng)葡萄酒香氣，轉(zhuǎn)化類固醇、抗生素等功能[8-11]。

柚苷酶廣泛存在于自然界中[12]，但微生物來(lái)源的酶遠(yuǎn)比動(dòng)植物來(lái)源的更有利[13]，絲狀真菌是柚苷酶的主要生產(chǎn)菌株[14]。然而，由于缺乏安全性、穩(wěn)定性好、產(chǎn)酶活力高的產(chǎn)酶菌株，柚苷酶在我國(guó)工業(yè)生產(chǎn)中至今沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用。因此選育適合工業(yè)化生產(chǎn)的柚苷酶高產(chǎn)優(yōu)良菌株至關(guān)重要。

本研究從腐爛的柚子皮中篩選得到1株產(chǎn)柚苷酶的塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)，采用紫外(ultraviolet irradiation,UV)與常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma,ARTP)復(fù)合誘變技術(shù)，旨在獲得1株柚苷酶高產(chǎn)突變株，并探究其酶解條件。同時(shí)，將突變株發(fā)酵粗酶液脫苦宜昌蜜橘果汁，并對(duì)脫苦前后果汁的理化性質(zhì)進(jìn)行鑒定，探究該突變株產(chǎn)酶在果汁脫苦中的應(yīng)用效果，為柑橘工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

產(chǎn)柚苷酶菌株，從霉變的柚子皮上分離純化獲得。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

本研究使用的所有化學(xué)試劑，均購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

產(chǎn)柚苷酶菌株篩選培養(yǎng)基(g/L)：柚皮粉 10.0，MgSO4·7H2O 5.0，K2HPO45.0，KCl 5.0，F(xiàn)eSO4·5H2O 0.1，瓊脂粉 10.0，pH值自然；

固體培養(yǎng)基(g/L)：MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO41.0，(NH4)2SO41.5，KCl 0.5，KNO31.5，CaCl20.1，酵母提取物 2.0，柚皮苷 2.5，瓊脂粉 10.0，pH值自然；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41.5，K2HPO41.5，(NH4)2SO44.0，ZnSO4·7H2O 0.1，CaCl20.1，酵母提取物1.0，豆粉2.0，蛋白胨2.0，柚皮苷10.0，pH值自然，接種量為10%[15]。

1.3 儀器與設(shè)備

ARTP誘變育種儀，思清源生物科技有限公司；ZW0615062604紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；Waters 2489液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。

1.4 產(chǎn)柚苷酶菌株的篩選

柚子皮置于陰暗潮濕的環(huán)境中3～5 d，取下一塊發(fā)霉的柚子皮，于無(wú)菌生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85% NaCl溶液)中180 r/min，30 ℃振蕩30 min，取菌懸液梯度稀釋后涂布于產(chǎn)柚苷酶菌株篩選培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。待菌落長(zhǎng)出后分離純化，直至得到純種單菌落。

1.5 孢子懸浮液的制備

用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面孢子，裝入含有無(wú)菌玻璃珠的三角瓶中，150 r/min室溫振蕩20 min，無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾，即可得到均勻分散的孢子懸液。用血球計(jì)數(shù)板在電子顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子懸液為所需濃度。

1.6 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將孢子懸液(107個(gè)/mL)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)。每12 h取發(fā)酵液5 mL，5 000 r/min離心20 min，棄上清液。沉淀用蒸餾水反復(fù)沖洗過(guò)濾至濾液澄清，于烘箱中烘至恒重，冷卻稱重。

1.7 酶活的測(cè)定

參照DAVIS[16]的方法。發(fā)酵液離心后上清液即為待測(cè)酶液，向具塞試管中分別加入0.6 mL柚皮苷標(biāo)液(500 μg/mL)、0.3 mL醋酸緩沖溶液(0.2 mol/L pH 4.0)和0.1 mL待測(cè)酶液，60 ℃ 150 r/min振蕩30 min，沸水浴滅活。向滅活后的酶解液中加入4.9 mL 90%(體積分?jǐn)?shù))的一縮二乙二醇溶液和4 mL蒸餾水，40 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，再加入0.1 mL NaOH(4 mol/L)溶液，搖勻，40 ℃水浴10 min，用分光光度計(jì)于420 nm處測(cè)吸光值?？瞻子么姿峋彌_溶液代替待測(cè)酶液，酶活平行測(cè)定3組，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

酶活力定義為：在60 ℃，pH 4.0條件下，1 min鐘消耗1 μg柚皮苷所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，以U計(jì)。

1.8 復(fù)合誘變

1.8.1 紫外誘變

將裝有孢子懸液(107個(gè)/mL)的培養(yǎng)皿放在攪拌器上，將滅菌的轉(zhuǎn)子放入皿中，照射距離為30 cm，照射功率15 W，時(shí)間梯度依次為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 min。照射后，將菌懸液于4 ℃低溫保存2 h，防止其自身修復(fù)[17]。取100 μL低溫保存的菌懸液涂布，30 ℃靜置培養(yǎng)3 d，待長(zhǎng)出單菌落后計(jì)數(shù)，計(jì)算誘變致死率，繪制致死曲線，致死率計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.8.2 ARTP誘變

取1 mL經(jīng)紫外誘變的孢子懸浮液，加入60%(體積分?jǐn)?shù))甘油84 μL，充分混勻。取10 μL混勻后的孢子懸液均勻涂在已灼燒滅菌冷卻的金屬載片上，誘變工作氣體為氦氣，溫度為20 ℃，誘變功率為120 W，氣流量為10 L/min，處理距離為2 mm。孢子懸液分別處理0、1、2、3、4、5、6、7、8 min，然后將金屬載片放入裝有1 mL無(wú)菌生理鹽水的離心管中，振蕩1 min。取誘變后的菌懸液100 μL涂布于固體平板培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)3 d，待長(zhǎng)出單菌落后并計(jì)數(shù)，計(jì)算誘變致死率，繪制致死曲線。

1.9 誘變菌株的篩選

1.9.1 誘變菌株的初篩

待平板中菌落長(zhǎng)出后，觀察菌落周圍是否有透明水解圈的產(chǎn)生，根據(jù)HC值初步判斷誘變菌株產(chǎn)酶活力的大小，HC值計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

1.9.2 誘變菌株的復(fù)篩

將初篩挑選出的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔12 h測(cè)定酶活，驗(yàn)證其搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶活力大小，保留產(chǎn)酶活力較原始菌株有所提升的突變株。

1.9.3 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

將得到的具有較高酶活的突變株傳代5次，測(cè)其酶活，檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性。

1.10 柚苷酶酶解條件探究

1.10.1 溫度對(duì)酶解條件影響

將誘變得到的最佳突變株發(fā)酵液離心，取上清液為粗酶液。取5組試管，分別在30、40、50、60、70 ℃條件下酶解，其余步驟同1.7。

1.10.2 pH對(duì)酶解條件影響

取8組試管，分別在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0條件下酶解，其余步驟同1.7。

1.11 突變株發(fā)酵產(chǎn)酶脫苦果汁應(yīng)用

1.11.1 果汁脫苦

采摘的宜昌蜜橘榨汁后，經(jīng)4層紗布過(guò)濾，濾液于5 000 r/min離心15 min，上清液即為待測(cè)果汁。突變株發(fā)酵72 h后于5 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。取10組具塞試管，每組3支平行，分別向其中加入0.5 mL待測(cè)果汁、0.4 mL醋酸緩沖溶液(0.2 mol/L、pH 5.0)和0.1 mL粗酶液，50 ℃ 150 r/min振蕩30 min。每隔15 min取出一組試管沸水浴滅火10 min。剩余柚皮苷含量檢測(cè)采用1.7中的方法。

酶解前后的果汁分別用高相液相色譜分析，驗(yàn)證其柚皮苷剩余量。果汁過(guò) 0.45 μm 有機(jī)濾膜，采用SunFire C18色譜柱((4.6×250) mm，5.0 μm)，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm，梯度洗脫程序?yàn)椋?～1 min，25%～30%A；1～6 min，30%A；6～7 min，30%～35%A；7～12 min，35%A；12～13 min，35%～40%A；13～18 min，40%A；18～19 min，40%～45%A；19～24 min，45%A；24～26 min，45%～58%A；26～50 min，58%A。

1.11.2 果汁理化指標(biāo)檢測(cè)

對(duì)酶解前后的果汁理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定?？扇苄怨绦挝锊捎谜凵鋬x測(cè)定(NYT 2637—2014)，可溶性糖含量采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定(NYT 2742—2015)，根據(jù)GB/T 12456—2008測(cè)定總酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定

從發(fā)霉的柚子皮上篩選到1株產(chǎn)柚苷酶菌株，菌落形態(tài)如圖1所示。該菌菌落呈棉絮狀，初生時(shí)為白色，后逐漸為褐色至黑褐色，有時(shí)會(huì)有液滴產(chǎn)生，菌落反面呈淡黃色。分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，無(wú)色透明，壁平滑，分生孢子頭為近球形，呈輻射狀，呈黑褐色。

a-菌落正面形態(tài)；b-菌落背面形態(tài)；c-顯微鏡下菌絲體形態(tài)；d-顯微鏡下孢子形態(tài)

通過(guò)對(duì)此菌株的 ITS 序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增，獲得了大約 750 bp 的拼接序列。將其在 NCBI 中 BLAST 同源性比對(duì)后，構(gòu)建確定其分類地位的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，可知此菌與塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)的同源性達(dá) 100%，由此將其歸為塔賓曲霉(Genbank 登錄號(hào):MN589840)，屬子囊菌門(mén)，散囊菌綱，散囊菌目，曲霉科，曲霉屬。

圖2 基于 ITS 序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

根據(jù)塔賓曲霉MN589840生長(zhǎng)曲線(圖3)可知，培養(yǎng)時(shí)間24 h時(shí)，菌體質(zhì)量明顯增高，此階段為菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而酶活較低，僅為1.78 U/mL，可能是因?yàn)榇藭r(shí)菌體處于大量繁殖階段，產(chǎn)酶量很少。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，酶活逐漸增高，于96 h時(shí)達(dá)到最高，酶活為13.48 U/mL。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間>96 h時(shí)，酶活開(kāi)始下降，菌體質(zhì)量也顯著下降，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)消耗殆盡，有害代謝物質(zhì)不斷增加，其生長(zhǎng)環(huán)境已經(jīng)不再適合菌體的生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)酶。

圖3 塔賓曲霉 MN589840的生物量及產(chǎn)酶活力隨時(shí)間變化曲線

2.3 誘變菌株選育

2.3.1 紫外誘變致死曲線

所有的生物細(xì)胞都富含核酸和蛋白質(zhì)等紫外線吸收劑，DNA是紫外線誘導(dǎo)損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。紫外輻射造成的DNA損傷主要是環(huán)丁烷-嘧啶二聚體(cyclobutane pyrimidine dimer，CPDs)和6-4光產(chǎn)物(6-4 photoproducts,6-4 PPs)。CPDs的含量最豐富且具細(xì)胞毒性，而6-4 PPs具有潛在的致命性[18]。由圖4可知，隨著誘變的時(shí)間增加，菌株的致死率升高。研究表明，紫外誘變致死率達(dá)到 80%～90% 時(shí)，產(chǎn)生正突變的概率較高[19]。為了便于后期實(shí)驗(yàn)，處理時(shí)間240 s為最佳誘變時(shí)間。

2.3.2 ARTP誘變致死曲線

ARTP產(chǎn)生的多種均勻分布的高活性粒子作用于DNA鏈，迫使細(xì)胞啟動(dòng)高容錯(cuò)水平的SOS修復(fù)機(jī)制，在修復(fù)過(guò)程中產(chǎn)生多種失配位點(diǎn)，造成基因突變。ARTP接近室溫，可以避免微生物因高溫造成熱損傷，且操作過(guò)程無(wú)毒性和有害物質(zhì)參與，在生物誘變育種中具有廣闊的應(yīng)用前景[20-21]。

由圖4可知，ARTP誘變時(shí)間與塔賓曲霉的致死率存在著顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系。低劑量時(shí)，菌株細(xì)胞受到大量的活性粒子注入，致死率急劇上升。隨著誘變時(shí)間增加，細(xì)胞修復(fù)機(jī)制和修復(fù)酶被激活，單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的致死率降低。繼續(xù)加大劑量，細(xì)胞損傷無(wú)法恢復(fù)，致死率再次急劇上升。研究表明，這種現(xiàn)象稱為雙鞍延遲規(guī)律，與微生物的修復(fù)機(jī)制有關(guān)，是傳統(tǒng)誘變不具備的特點(diǎn)[22]。為了方便后期篩選，本實(shí)驗(yàn)選擇致死率達(dá)98%，處理時(shí)間300 s為最佳誘變時(shí)間。

圖4 UV誘變和ARTP誘變對(duì)塔賓曲霉的致死曲線

2.3.3 紫外-ARTP復(fù)合誘變

微生物誘變育種作為最實(shí)用、有效的育種策略之一而被廣泛應(yīng)用[23]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于產(chǎn)柚苷酶菌株誘變育種的報(bào)道并不多見(jiàn)。李耀等[24]將黑曲霉M53經(jīng)紫外-LiCl復(fù)合誘變，選育出1株產(chǎn)柚苷酶突變株 M53-7，其酶活較原始菌株提高了42.77%。朱運(yùn)平等[19]以米曲霉 11250為出發(fā)菌株，采用紫外-NaNO2復(fù)合誘變選育出1株產(chǎn)柚苷酶突變菌株 UN2，其發(fā)酵酶活是原始菌株的2.3倍。ARTP作為一種新型誘變工具，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、安全、高效、環(huán)境友好等特點(diǎn)[25]。至今，仍沒(méi)有ARTP與傳統(tǒng)誘變相結(jié)合，誘變產(chǎn)柚苷酶菌株的報(bào)道。復(fù)合誘變由于包含多種誘變方式，可以產(chǎn)生多種突變類型，避免因單一誘變產(chǎn)生的誘變飽和效應(yīng)[26]。本研究將塔賓曲霉 MN589840經(jīng)紫外-ARTP復(fù)合誘變，最終得到6株突變株。由表1可知，突變株 UA13酶活最高，是原始菌株的3.06倍。

表1 紫外-ARTP 復(fù)合誘變結(jié)果

2.4 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

將突變株UA13連續(xù)傳代5次(表2)具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

表2 突變株UA13遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

2.5 柚苷酶酶解條件探究

2.5.1 溫度對(duì)酶解作用的影響

溫度對(duì)酶活的影響主要分為2個(gè)階段。當(dāng)溫度升高時(shí)，反應(yīng)速度加快，酶活升高；當(dāng)溫度持續(xù)升高，超過(guò)柚苷酶的熱穩(wěn)定性范圍，酶原有結(jié)構(gòu)遭到破壞，使其活力降低。如圖5所示，酶解溫度在30～40 ℃時(shí)，酶活逐步增大；40～50 ℃具有較好酶活，50 ℃時(shí)酶活最高；當(dāng)酶解溫度>50 ℃時(shí)，酶活迅速降低，溫度達(dá)到70 ℃，酶活幾乎完全喪失。此試驗(yàn)表明，該柚苷酶最適酶解溫度為40～50 ℃。酶解溫度過(guò)低，不能完全激活酶活，柚苷酶無(wú)法完全達(dá)到其活力；而溫度過(guò)高，會(huì)使酶蛋白變性，喪失其活力。

圖5 溫度對(duì)酶解作用的影響

2.5.2 pH對(duì)酶解作用的影響

pH對(duì)酶活的影響主要存在2個(gè)方面。(1)pH對(duì)酶的穩(wěn)定性有一定影響。若反應(yīng)體系的pH使酶產(chǎn)生不穩(wěn)定性，則會(huì)影響到酶解反應(yīng)。(2)酶對(duì)底物柚皮苷具有最適pH范圍。當(dāng)pH處于該范圍內(nèi)，酶對(duì)底物可以發(fā)揮最大作用。如圖6所示，柚苷酶活力隨pH的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)pH在3.0～5.0時(shí)，酶活隨著pH的增大而增大；pH為5.0時(shí)，酶活處于峰值；pH>5.0后，反應(yīng)體系pH不利于酶解，酶活迅速下降。

圖6 pH對(duì)酶解作用的影響

2.6 突變株發(fā)酵產(chǎn)酶脫苦蜜橘果汁

果汁中柚皮苷含量隨水解時(shí)間變化如圖7所示。柚皮苷苦閾值(人們能感覺(jué)到苦味的最低質(zhì)量濃度)約為30 μg/mL[27]，當(dāng)酶解約50 min時(shí)，果汁中柚皮苷含量低于苦閾值；當(dāng)酶解時(shí)間>75 min時(shí)，果汁中僅剩下少量柚皮苷。與圖8-b對(duì)比，圖8-c中的柚皮苷大量降低。因此，突變株UA13能夠產(chǎn)生柚苷酶且該酶具有高效水解果汁中柚皮苷的能力。

圖7 柚皮苷含量隨酶解時(shí)間的變化情況

a-柚皮苷標(biāo)品;b-脫苦前柚皮苷含量色譜圖;c-脫苦后柚皮苷含量色譜圖

2.7 果汁脫苦理化指標(biāo)鑒定

蜜橘果汁經(jīng)粗酶液脫苦后理化指標(biāo)變化結(jié)果如表3所示?？扇苄怨绦挝?、蔗糖和總酸含量均有下降。

酶解時(shí)，加熱過(guò)程會(huì)使果汁總酸、總糖及可溶性固形物含量降低。果汁中，含有可揮發(fā)性酸，加熱促使其揮發(fā)，致使含量降低。而果汁中含有多種淀粉、纖維素等大分子糖類，在加熱過(guò)程中加速運(yùn)動(dòng)，使其相互碰撞進(jìn)而沉淀，導(dǎo)致總糖含量降低。果汁中含有大量的果膠等大分子顆粒物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，柚苷酶中的α-L-鼠李糖苷酶主要作用于末端鼠李糖鍵，可將果膠的α-(1，4)鼠李糖苷鍵水解，從而引起總糖含量減少[28]。

固酸比(可溶性固形物和總酸之比)和糖酸比(總糖和總酸含量之比)是判斷果汁風(fēng)味的重要指標(biāo)。脫苦過(guò)程雖然會(huì)降低果汁中可溶性固形物、總糖和總酸含量，但其固酸比和糖酸比均有提高。因此，該酶具有提高果汁風(fēng)味的能力。

表3 宜昌蜜橘脫苦前后理化指標(biāo)的測(cè)定

3 結(jié)論

本研究從腐爛的柚子皮上篩選出1株產(chǎn)柚苷酶菌株，經(jīng)鑒定為塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)MN589840，其搖瓶發(fā)酵酶活為13.475 U/mL。經(jīng)紫外-ARTP復(fù)合誘變，最終得到1株柚苷酶高產(chǎn)突變株 UA13，其搖瓶發(fā)酵酶活可達(dá)41.524 U/mL，是原始菌株的3.06倍。連續(xù)傳代5次后，具有遺傳穩(wěn)定性。對(duì)突變株UA13產(chǎn)酶酶解條件進(jìn)行探究得知，該酶酶解最適溫度為40～50 ℃，最適pH值為5.0。用突變株UA13發(fā)酵粗酶液脫苦宜昌蜜橘果汁，結(jié)果顯示，該酶能有效水解果汁中的柚皮苷，且具有一定提高果汁品質(zhì)的能力。因此，該菌具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，可為后期實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。