程 峰,竇晉濤,2，張 庸,3,王 祥,4，吳志浩,5

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.腫瘤微環(huán)境研究室;2.麻醉學(xué)院;3.臨床醫(yī)學(xué)院;4.檢驗學(xué)院;5.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

據(jù)統(tǒng)計，肺癌發(fā)病率居所有癌癥之首，是預(yù)后極差的惡性腫瘤，5年生存率僅為19%[1]。盡管化療以及近年來興起的腫瘤免疫治療對肺癌顯示很好的作用[2]，然而肺癌細(xì)胞仍然表現(xiàn)出耐藥現(xiàn)象[3-4]，給肺癌的診療帶來了一定的困難。因此尋找其他的靶點以及開發(fā)新的藥物變得尤為重要。

近年來大量研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群生態(tài)與人體健康密切相關(guān)[5]。尿石素A(Urolithin A)是一種腸道代謝產(chǎn)物。石榴中含有大量的多酚類鞣酸，食用后經(jīng)腸道微生物分解后形成活性產(chǎn)物Urolithin A[6]。Urolithin A具有抗氧化[7]、肌肉重塑[6]、抗炎癥[8]的作用。本研究旨在探究Urolithin A對肺癌細(xì)胞的殺傷作用，為臨床用藥提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(中科院細(xì)胞庫)，Urolithin A(SIGMA)，MTT(Beyotime)，SA-β-gal試劑盒(Beyotime)，膜和胞漿蛋白提取試劑盒(Beyotime)，Laemmli 2×濃縮液(SIGMA)，Annexin V-FITC/PI試劑盒(BD公司);p53抗體，p21抗體，Cleaved PARP抗體，PUMA抗體購自CST公司。p53 shRNA(addgene)。酶標(biāo)儀(BioTek)，垂直電泳儀(Biorad),凝膠成像儀(GE,AI600)，硝化纖維素(NC)膜(GE Healthcare)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)條件：10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%的CO2的培養(yǎng)箱，細(xì)胞均用胰酶消化傳代，實驗處理期均為對數(shù)生長期。

1.2.2 MTT實驗 待A549細(xì)胞生長至對數(shù)期，消化離心，將其接種到96孔板中，放在37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞長滿后，實驗設(shè)置對照組、不同劑量組，每組設(shè)4個復(fù)孔。對照組、不同劑量組的Urolithin A濃度分別為0、2.5、5、10、30、50 μmol/L。48 h后用稀釋后的MTT溶液處理，放置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱孵育4 h。將96孔板拿出，在超凈臺里每孔加入150 μL的DMSO溶液。常溫下，避光，在搖床上孵育15 min。用酶標(biāo)儀在490波長處測每個孔的OD值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 待六孔板中細(xì)胞長至90%時，用無血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓A549細(xì)胞過夜。加入不同濃度(10、20 μmol/L)的Urolithin A處理細(xì)胞24 h。無EDTA的胰酶溶液消化，用PBS懸浮細(xì)胞離心，收集約1×105細(xì)胞。500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞后，加入5 μL的Annexin V-FITC，吹打后再加入5 μL的PI染料混勻。常溫避光15 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 SA-β-gal實驗檢測細(xì)胞衰老 加入不同濃度(5、20 μmol/L)的Urolithin A處理六孔板中的細(xì)胞。24 h后，用細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測。用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞衰老程度。

1.2.5 Western blot實驗 用樣品緩沖液Laemmli 2×濃縮液對細(xì)胞進(jìn)行刮除并收集，用膜和胞漿蛋白提取試劑盒分離總蛋白或膜蛋白濃度。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離每個樣品的蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素(NC)膜并用抗體孵育。這些信號被曝光機曝光成影，用PS軟件截圖分析。

2 結(jié)果

2.1 Urolithin A對A549細(xì)胞增殖的影響 與對照組相比，2.5、5、10、30、50 μmol/L的Urolithin A處理A549細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力均下降(P<0.05)。見圖1。

F=88.95，P=0.000；與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 Urolithin A對A549細(xì)胞凋亡的影響 與對照組相比，10、20 μmol/L的Urolithin A處理24 h后,A549細(xì)胞凋亡數(shù)均增加(P<0.05)。見圖2。

F=29.97，P=0.001；與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 Urolithin A對A549細(xì)胞衰老的影響 10、20 μmol/L的Urolithin A處理24 h后，被SA-β-gal染色的衰老細(xì)胞數(shù)均增加(P<0.05)。見圖3。

F=142.20，P=0.000；與對照組相比，**P<0.01。

2.4 Urolithin A處理A549細(xì)胞對細(xì)胞衰老和凋亡相關(guān)蛋白的影響 2.5、5、10、30、50 μmol/L的Urolithin A處理肺癌A549細(xì)胞12 h后,與對照組相比，Cleaved PARP、p21、PUMA、p53蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，見圖4A。用shRNA敲降p53,相同濃度Urolithin A處理后，Cleaved PARP、p21、PUMA的表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)，見圖4B。

A.F=57.30，P=0.000；F=28.92，P=0.000；F=20.30，P=0.000；F=44.00，P=0.000；與Urolithin A(0 μmol/L)相比，*P<0.05，**P<0.01；B.t1=4.086，t2=5.824，t3=3.326，t4=11.910，P1=0.015，P2=0.028，P3=0.029，P4=0.000；t1=9.216，t2=7.140，t3=4.501，t4=11.800，P1=0.001，P2=0.019，P3=0.011，P4=0.000；t1=7.547，t2=3.391，t3=4.096，t4=14.460，P1=0.002，P2=0.028，P3=0.015，P4=0.000；相同濃度Urolithin A，敲降p53與未敲降相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.5 Urolithin A通過p53抑制A549細(xì)胞的增殖 MTT實驗結(jié)果顯示，shRNA敲低p53能減弱Urolithin A對A549細(xì)胞引起的增殖抑制(P<0.05)(圖5A)。同時，用不同濃度的Urolithin A處理肺癌細(xì)胞H1299(p53缺失型)，低濃度組(2.5、5 μmol/L)對細(xì)胞增殖無影響(P>0.05)，高濃度組(10、30、50 μmol/L)對H1299細(xì)胞有輕微抑制作用(P<0.05)(圖5B)。

A.F=82.19，P=0.000；Urolithin A(10 μmol/L)+shp53組與單用Urolithin A(10 μmol/L)組相比，**P<0.01；B.F=48.33，P=0.000；與Urolithin A(0 μmol/L)相比，**P<0.01。

3 討論

近年來，肺癌的治療手段呈現(xiàn)多樣化發(fā)展，尤其比較盛行的PD1/PD-L1療法，對晚期肺癌的生存率有很大的延長效應(yīng)，但是總體存活率低，預(yù)后不良依然嚴(yán)重。因此尋找新藥和靶標(biāo)顯得尤為重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，Urolithin A能夠抑制A549細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)和SA-β-gal實驗證明了Urolithin A能夠促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡和衰老。然而Urolithin A究竟通過什么信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡和衰老，具體的分子機制還不是很清楚，值得我們深入探討。

細(xì)胞凋亡是比較常見的細(xì)胞程序性死亡方式，受基因調(diào)控。PARP是一種DNA修復(fù)酶，參與DNA修復(fù)工作。一般來說，PARP蛋白被Caspase蛋白切割成Cleaved PARP是細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志[9]。通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)Urolithin A能夠上調(diào)Cleaved PARP的水平，進(jìn)一步證明Urolithin A處理A549細(xì)胞，促使其發(fā)生凋亡。在50%的癌癥中，最常見的突變之一是腫瘤抑制基因TP53，包括其功能的喪失或獲得[10]。由于其抑癌活性，轉(zhuǎn)錄因子p53被認(rèn)為是基因組的守護(hù)者或看護(hù)者。p53可調(diào)控細(xì)胞周期阻滯[11]、凋亡[12]和DNA修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)[13]。PUMA是p53的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，它能誘導(dǎo)大部分癌癥細(xì)胞的凋亡。PUMA是Bcl-2家族的成員之一，具有一個“BH3-only”結(jié)構(gòu)域。PUMA位于線粒體中，并觸發(fā)線粒體功能障礙介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。它通過Bax/Bak對抗BCL-XL和MCL-1的功能[14]。細(xì)胞衰老也是由基因控制的一種生物學(xué)現(xiàn)象，相應(yīng)的，細(xì)胞衰老的分子機制有很多種。p53-p21是比較經(jīng)典的細(xì)胞衰老調(diào)控通路[15]，p53的主要靶基因是p21，將導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G1/S期。因此我們猜想Urolithin A是否通過p53介導(dǎo)了A549細(xì)胞的凋亡和衰老？

肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549遺傳背景為野生型p53，而本研究發(fā)現(xiàn)Uroltihin A能夠上調(diào)p53蛋白的表達(dá)，且有濃度依賴性。再次通過Western blot實驗顯示，Urolithin A也能使轉(zhuǎn)錄因子p53下游基因p21、PUMA的表達(dá)上調(diào)。原因可能為Urolithin A通過p53介導(dǎo)了下游p21、PUMA的表達(dá)。用p53的shRNA沉默抑癌基因p53，再用Urolithin A處理，下游基因p21、PUMA明顯下調(diào)。MTT實驗結(jié)果顯示，shRNA敲低p53能減弱Urolithin A對A549細(xì)胞引起的增殖抑制，同時Urolithin A對p53缺失型肺癌細(xì)胞H1299不敏感，這更一步證明了，p53介導(dǎo)了p21和PUMA的上調(diào),且p53是Urolithin A引起A549細(xì)胞發(fā)生凋亡和衰老的關(guān)鍵因子。

雖然本研究結(jié)果證明了Urolithin A能夠抑制A549細(xì)胞增殖，并且從細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老兩方面進(jìn)行了研究，但是仍有部分分子機制沒有探究清楚。①Urolithin A如何上調(diào)p53蛋白的表達(dá),直接還是間接？②還需要構(gòu)建p53、p21、PUMA等基因表達(dá)載體，來使Urolithin A-p53-p21/PUMA通路的研究更加有說服力。同時，通過裸鼠成瘤實驗在活體水平上來檢測是否有意義也有待于進(jìn)一步驗證。