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基于二氧化錳納米片實現(xiàn)let-7a向癌細胞的可視化遞送及其體外抗癌研究

2021-01-30 05:31楊強強張廣智吳芳芳范書華于淑嫻
關(guān)鍵詞:癌基因探針存活率

楊強強,張廣智,吳芳芳,范書華,于淑嫻,洪 敏

(聊城大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,山東 聊城 252059)

0 引言

目前,癌癥成為導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一。迄今為止,尚未發(fā)現(xiàn)特別有效的治療和預(yù)防方法。傳統(tǒng)的癌癥治療主要以外科手術(shù)、放射性治療及化學(xué)療法為主,但存在不良反應(yīng),療效不彰,無法根治等缺點。目前,對于攻克癌癥,其治療關(guān)鍵是早期診斷和精準(zhǔn)化個性治療。隨著不少“癌基因”和“抑癌基因”的相繼發(fā)現(xiàn),腫瘤基因治療前景樂觀?;驒z測(即分子靶標(biāo)檢測)是以研究疾病發(fā)生、發(fā)展過程中細胞分子生物學(xué)上的差異為基礎(chǔ),篩選和鑒定與疾病密切相關(guān)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子作為藥物作用的靶點,通過靶向給藥實現(xiàn)有效的靶向治療及個體化精準(zhǔn)醫(yī)療。腫瘤分子靶標(biāo)的出現(xiàn)使得靶標(biāo)基因藥物能夠針對癌細胞本身進行治療,不會對正常細胞產(chǎn)生重大傷害,緩解患者病痛的同時更帶給他們生的希望。自腫瘤基因治療技術(shù)應(yīng)用以來,治療效果十分顯著,得到了越來越多的癌癥患者的認可,成為非常有前途的個體化治療方法[1]。

MicroRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為20-24個核苷酸的非編碼單鏈小RNA,其參與多種重要細胞活動的調(diào)控,如細胞增殖、分化、凋亡等[2]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA的表達與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),其既可以充當(dāng)抑癌基因(如microRNA-21)[3,4],又可以充當(dāng)癌基因(如let-7a)[5,6]。通過基因技術(shù),下調(diào)癌細胞內(nèi)過表達的癌基因,或上調(diào)低表達的抑癌基因,都被證明能有效誘導(dǎo)癌細胞凋亡[7,8],因此,被認為是非常有潛在價值的癌癥治療方法。

目前制約基因療法的主要問題是核酸序列的高效輸送問題,傳統(tǒng)方法主要是以病毒為載體進行輸送,但由于病毒本身的毒副作用及潛在的免疫原性和致瘤性等問題,限制了其在該領(lǐng)域的應(yīng)用。例如,以病毒為載體包裹 microRNA轉(zhuǎn)染進入癌細胞,進行功能性缺失或恢復(fù),研究上調(diào)或下調(diào)microRNA的表達對癌癥的治療作用[9]。該方法的優(yōu)勢是可以長期穩(wěn)定恢復(fù)或降低 microRNA 的表達水平,沉默腫瘤中活化的靶向癌基因,從而起到治療腫瘤的作用。但是該方法在殺傷腫瘤細胞的同時也會感染正常的細胞。同時,病毒載體轉(zhuǎn)染進細胞時會隨機插入正常宿主細胞 DNA,破壞一些基因信號通路,從而導(dǎo)致原癌基因活化。另外,因為外源病毒引入,還會誘發(fā)機體免疫反應(yīng),進而對機體的安全性產(chǎn)生較大影響[10]。因此,輸送核酸藥物的非病毒載體,主要包括脂質(zhì)體、陽離子多聚體、碳納米材料、以及金屬納米顆粒等,成為基因藥物遞送的更好選擇[11]。為了促進該領(lǐng)域的發(fā)展,研究者們試圖利用一些新穎材料來解決當(dāng)前藥物載體的一些不足,比如制備復(fù)雜、載藥量低、容易泄露等問題。近年來,新開發(fā)的一種制備簡單、低成本、低毒性的二維納米材料——二氧化錳納米片(MnO2nanosheets,MnO2NSs)[12],被人們廣泛使用。一方面,其對單鏈 DNA或RNA具有很強的吸附能力;另一方面,吸附單鏈核酸的MnO2NSs能以胞吞的形式進入癌細胞,隨后會被癌細胞中高表達的谷胱甘肽(GSH)降解為錳離子(Mn2+),將其表面吸附的DNA或RNA釋放到細胞質(zhì)中,從而實現(xiàn)對單鏈核酸的跨膜運輸。除此之外,MnO2NSs還具有強的熒光淬滅能力,會使吸附到MnO2NSs上的核酸上修飾的熒光基團發(fā)生淬滅,而當(dāng)MnO2NSs被GSH降解,核酸被釋放出來后,熒光信號會重新恢復(fù)[13]?;谶@種熒光信號從“關(guān)”到“開”的轉(zhuǎn)變,可以實時監(jiān)測負載核酸的MnO2NS探針的跨膜情況及核酸在細胞中的分布,而這些性質(zhì)都為MnO2NSs用于疾病診斷和治療提供了新的契機。

基于以上表述,本實驗中,我們試圖以MnO2NSs為載體,負載上5’端有熒光素(FAM)修飾的microRNA let-7a(FAM-let-7a),制備得到FAM-let-7a/MnO2NS探針,該探針以胞吞的形式進入癌細胞后,在癌細胞內(nèi)高表達的GSH的作用下MnO2NSs降解為Mn2+,從而將其表面吸附的FAM-let-7a釋放到細胞質(zhì)中,同時探針上被淬滅的FAM的熒光會重新恢復(fù)。利用激光共聚焦熒光顯微成像,根據(jù)實時觀察到的熒光信號的變化,判斷FAM-let-7a進細胞的情況。另外,作為抑癌基因,當(dāng)癌細胞內(nèi)的let-7a的表達被上調(diào)時,希望實現(xiàn)誘導(dǎo)癌細胞凋亡的目的。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氯化錳四水合物(MnCl2·4H2O),四甲基氫氧化銨(TMA·OH),還原型谷胱甘肽(GSH),二甲基亞砜(DMSO),氯化鈣溶液(1 M),氯化鎂溶液(1 M),過氧化氫(H2O2,3 wt%),Tris-鹽酸(Sigma-Aldrich購得),Tris-HCl 緩沖液(100 mM,25 mM MgCl ,5 mM CaCl2,pH 7.5),磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4,136.7 mM NaCl,2.7 mM KCl,8.72 mM Na2HPO4,1.41 mM KH2PO4),細胞培養(yǎng)試劑和3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)(定國生物科技有限公司),用超純水制備所有水溶液,王水由體積比3:1的鹽酸和硝酸混合而成。其它試劑均為市售分析純試劑。

FAM-let-7a的序列:5’-FAM-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’;

let-7a-RNA的序列:5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’;

control-RNA的序列:5’-AUAAAUAGGAGGGGGUAGAAGG-3’.

JEM-2100 透射電子顯微鏡(JEOL有限公司、日本),90 Plus/BI-MAS 設(shè)備(美國),Zetasizer(莫爾文 Nano-Z,英國),Lambda750 紫外可見分光光度計(PerkinElmer,英國),F(xiàn)-7000 熒光光譜儀(日立,日本),LSM880 激光掃描共聚焦顯微鏡(蔡司,德國),ELX808 酶標(biāo)儀(BioTek,美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 合成MnO2NSs并進行表征。在 15 s內(nèi)使 TMA·OH(0.6 M)和 H2O2(3 wt%)的混合物(20 mL)與 MnCl2·4H2O(10 mL,0.3 M)溶液反應(yīng),形成深棕色懸浮液后,將所得混合物在室溫下攪拌約24 h,以2000 rpm離心10 min,用去離子水和甲醇洗滌,然后在-60 ℃下干燥。隨后取10 mg干燥的粗產(chǎn)物,分散在20 mL去離子水中并超聲處理10 h,最后將分散體系在2000 rpm下離心30 min,并將上清液用于實驗中[13]。

1.2.2 熒光淬滅和恢復(fù)。將不同量的MnO2NSs溶液(最終濃度分別為0、14、28、35、42、48 μg/mL)與let-7a RNA溶液(最終濃度為100 mM)混合,最后加入 Tris-HCl 緩沖液配置成200 μL的試樣。30 min后,記錄樣品的熒光強度。對于熒光恢復(fù)實驗,不同濃度的GSH(0、2、4、6、8、10、15 mM)與FAM-let-7a/MnO2NS探針(MnO2NSs:48 μg/mL;FAM-let-7a:100 nM)混合,最后加入 Tris-HCl 緩沖液配置成200 μL的樣品,靜置5 min,然后測定各體系的熒光強度(激發(fā)波長:488 nm)。

1.2.3 納米探針的制備。FAM-let-7a/MnO2NS探針:取220 μL DEPC水加入到FAM-let-7a(1 OD) 中,溶解混勻。之后,將FAM-let-7a(最終濃度為200 nM)加入到包含MnO2NSs(最終濃度為84 μg/mL)的Tris-HCl 緩沖溶液中,放置30 min后,即得 FAM-let-7a/MnO2NS探針母液,將其儲存在4 ℃條件下備用。let-7a-RNA/MnO2NS或control-RNA/MnO2NS探針:方法同上,得到的探針母液中RNA的最終濃度為200 nM,MnO2NSs最終濃度為84 μg/mL。

1.2.4 細胞培養(yǎng)。人宮頸癌細胞(HeLa),人肝癌細胞(HepG2)、人乳腺癌細胞(MCF-7)用Dulbecco’s modified Eagle 的培養(yǎng)基(DMEM GIBCO)在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),并加入 10% 胎牛血清、青霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL),在含5%二氧化碳、37 ℃濕潤的環(huán)境中培養(yǎng)。用細胞計數(shù)器測定細胞數(shù)量。

1.2.5 HeLa、HepG2、MCF-7細胞中進行 FAM-let-7a/MnO2NS探針的原位成像。 將癌細胞(0.4 mL,1×106細胞/mL) 接種在20 mm共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng) 24 h,然后將一定量的FAM-let-7a/MnO2NS探針母液加入到每個培養(yǎng)皿中,使探針中MnO2NS的濃度保持在30 μg/mL。之后,細胞在 37 °C 條件下繼續(xù)孵育 4 h后,除去培養(yǎng)基,用PBS溶液沖洗兩遍后,再加入一定量的PBS,隨后用激光共聚焦顯微鏡進行檢測成像,激發(fā)波長為488 nm。

1.2.6 細胞的存活率研究。將三種不同的細胞(包括HepG2、MCF-7以及HeLa 細胞)分別接種在 96 孔板(1×105細胞/孔)中培養(yǎng)24 h,然后將細胞與相同濃度的納米探針一起孵育不同時間(24、36、48 和 72 h)或與不同濃度的納米探針孵育72 h。處理后,除去培養(yǎng)基,并將制備的 MTT(0.5 mg/mL)加入孔中.在 37 ℃下孵育 4 h后,除去培養(yǎng)基,并向每個孔中加入 100 μL 二甲基亞砜。然后,在室溫下振蕩細胞板 10 min,以溶解由活細胞形成的晶體,之后使用酶標(biāo)儀在 490 nm 處測量每個孔的吸光度。 通過(ATest/AControl)× 100 計算相對細胞存活率。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

5’端有熒光分子FAM修飾的 FAM-let-7a會通過物理吸附直接結(jié)合到 MnO2NSs的表面,此時FAM的熒光信號會被淬滅,體系處于“turn-off”的狀態(tài),形成的FAM-let-7a/MnO2NS探針,隨后利用MnO2NSs能夠以胞吞的形式進入細胞,而將 FAM-let-7a輸送入細胞中。進入腫瘤細胞后,在 GSH的作用下,MnO2NSs降解成Mn2+,同時結(jié)合在MnO2NSs上的FAM-let-7a被釋放出來,之前被淬滅的FAM熒光信號恢復(fù)(turn-on),利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察該熒光信號,可以實現(xiàn)對細胞內(nèi)這一過程的原位監(jiān)測及熒光成像分析(如圖1所示)。由于FAM-let-7a在大多數(shù)癌細胞中都扮演抑癌基因的角色,而我們這里的設(shè)計就相當(dāng)于上調(diào)了癌細胞中的這種抑癌基因,從而進一步誘導(dǎo)癌細胞走向凋。

圖1 FAM-let-7a/MnO2 NS探針進細胞,釋放 FAM-let-7a及上調(diào)癌細胞內(nèi)let-7a表達誘導(dǎo)癌細胞凋亡示意圖

2.2 二氧化錳納米片表征

TEM測試結(jié)果表明,MnO2NSs顯示二維片狀薄紗樣結(jié)構(gòu)(如圖 2(a) 所示),但在其用于載體制備FAM-let-7a/MnO2NS探針前,會利用超聲對MnO2NSs進行充分破碎,以利于其進入細胞。此外,MnO2NSs的 UV-vis 光譜約在 370 nm 處顯示出最大吸收峰(如圖 2(b)所示),這些實驗結(jié)果均與文獻報道一致[14],進而表明MnO2NSs被成功地制備出來。

圖2 (a) 二氧化錳納米片透視電子顯微鏡圖像;(b) 二氧化錳納米片UV-vis光譜圖

2.3 熒光淬滅和恢復(fù)

向FAM-let-7a溶液中各加入不同量的MnO2NSs,F(xiàn)AM-let-7a的濃度固定在100 nM,而MnO2NS的濃度依次增加(0、14、28、35、42、48 μg/mL),混合30 min,依據(jù)熒光淬滅強度來評估制備的MnO2NSs對FAM-let-7a的吸附效果。在不存在MnO2NSs的時候,如果以488 nm為激發(fā)波長,F(xiàn)AM-let-7a上修飾的FAM會在525 nm處有特征熒光發(fā)射,結(jié)果表明,隨著MnO2NSs濃度的增加,F(xiàn)AM的熒光強度逐漸降低,當(dāng)MnO2NSs在42 μg/mL 濃度下完全淬滅FAM的熒光(如圖3(a)),我們認為,在此MnO2NSs濃度下能夠完全有效吸附FAM-let-7a,因此,為保證探針溶液中,F(xiàn)AM-let-7a被有效吸附到MnO2NSs上,后續(xù)制備成的FAM-let-7a/MnO2NS探針母液中,F(xiàn)AM-let-7a和MnO2NSs的比例為100 nM:42 μg/mL。

另外,當(dāng)向完全淬滅的FAM-let-7a/MnO2NS探針中添加不同濃度的GSH(0、2、4、6、8、10、15 mM)時,隨著GSH濃度的增大,更多的MnO2NSs被降解,F(xiàn)AM標(biāo)記的FAM-let-7a被釋放出來,F(xiàn)AM的熒光逐步恢復(fù),體系中的熒光強度逐漸增強(如圖3(b)所示),從而證實MnO2NSs可以被 GSH 有效降解.但與沒有被MnO2NSs吸附的相同濃度FAM-let-7a的熒光強度相比,F(xiàn)AM的熒光并沒有完全恢復(fù),這可能是由于MnO2NSs的吸附會影響FAM的熒光效率造成的[13]。

圖3 (a) MnO2 NSs吸附FAM-let-7a熒光淬滅圖(a-f MnO2 NSs濃度逐漸增加);(b) 在GSH作用下FAM-let-7a/MnO2 NS探針的熒光恢復(fù)圖(a-g GSH濃度逐漸增加,h100 mM單純的FAM-let-7a)

2.4 細胞內(nèi)熒光成像

接下來我們希望實現(xiàn)FAM-let-7a/MnO2NS探針在癌細胞內(nèi)原位成像,選擇了人宮頸癌細胞HeLa、人肝癌細胞HepG2、及人乳腺癌細胞MCF-7作為研究對象。FAM-let-7a/MnO2NS 納米探針通過內(nèi)吞作用進入細胞,細胞內(nèi)所含的 GSH 會使 MnO2NSs 降解,F(xiàn)AM標(biāo)記的FAM-let-7a 將從 MnO2NSs上釋放,因此熒光恢復(fù)。為了獲得最佳成像效果,將細胞與探針一起孵育4 h后觀察細胞。在 HeLa、HepG2、MCF-7細胞中可以清楚地觀察到熒光信號(如圖4),從而證明在這里研究的三種癌細胞中的GSH能有效的將MnO2NSs 降解,使得被負載的FAM-let-7a釋放到細胞質(zhì)中。其中HeLa細胞給出的熒光圖清楚表明這種熒光體系在細胞質(zhì)中的分布,而對于不同的細胞類型,熒光信號分布則有一些差異(如MCF-7),但整體顯示,運送的FAM-let-7a都進入了細胞質(zhì)中。

圖4 與 FAM-let-7a/MnO2NS探針一起孵育后HepG2、MCF-7、HeLa細胞的共聚焦圖像

2.5 細胞的存活率

microRNA let-7a在癌細胞中起到抑制其增殖的作用,在之前的很多工作中都得到了證實[15-17]。相對于正常細胞而言,在大部分癌細胞中,let-7a都是低表達的[4],而通過基因轉(zhuǎn)染的方法往癌細胞中人為輸送進一定量的let-7a,也就相當(dāng)于上調(diào)let-7a在癌細胞中的表達,應(yīng)該能夠達到誘導(dǎo)癌細胞凋亡的目的[18]。例如陳杰課題組[19]報道了一個膽固醇包裹let-7a模擬物轉(zhuǎn)染進細胞的工作,以人肝癌細胞為研究對象,結(jié)果表明,通過該方法上調(diào)let-7a的表達后有效抑制了癌細胞的增殖,體內(nèi)實驗證明膽固醇包裹let-7a模擬物可以明顯抑制肝癌移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

鑒于此,我們希望這里用到的FAM-let-7a/MnO2NS探針可通過上調(diào)抑癌基因let-7a的表達來達到誘導(dǎo)癌細胞凋亡的目的。為了評估這種效應(yīng),一定濃度的let-7a-RNA/MnO2NS探針與三種癌細胞作用不同時間(24、36、48、72 h),然后使用MTT 法測定癌細胞的存活率。研究表明,let-7a/MnO2NS復(fù)合物對不同癌細胞的存活率具有明顯的時間依賴性影響。作用時間越久,細胞的存活率越低(如圖5A、B、C),72 h后,三種癌細胞的存活率都降到60%以下,HepG2細胞的存活率甚至降到50%左右.這些結(jié)果與之前的報道吻合,例如,陳杰等人研究了膽固醇包裹let-7a對肝癌細胞的抑制作用,與HepG2細胞作用5 D后,細胞存活率下降到了37.7%[19]。另外,Takahashi等人進行的體外細胞實驗也證明,提高A549細胞中l(wèi)et-7a的含量可以有效抑制其增殖[20]。

作為對照,我們將與let-7a有相同長度的任意序列的Control-RNA結(jié)合到MnO2NSs上,得到了Control-RNA/MnO2NS探針。按照同樣的實驗操作,測定結(jié)果表明相同濃度的Control-RNA/MnO2NS探針對癌細胞增殖的影響明顯小于let-7a-RNA/MnO2NS探針。

另外,我們還測定了不同濃度的MnO2NSs及Control-RNA/MnO2NS探針與HeLa細胞作用72 h后對HeLa細胞存活率的影響。MTT實驗結(jié)果表明,當(dāng)MnO2NSs的濃度低于40 μg/mL時,HeLa細胞與其作用72 h后其生存率仍能保持在90%以上,而我們這里用到的MnO2NSs(20 μg/mL)的濃度處在這個范圍內(nèi)。這些結(jié)果都充分證明let-7a-RNA/MnO2NS探針通過上調(diào)癌細胞中l(wèi)et-7a的含量,對癌細胞的增殖起抑制作用,而非由于MnO2NSs自身的細胞毒活性。

圖5 let-7a-RNA/MnO2 NS探針與不同細胞作用不同時間后細胞的存活率(MnO2 NSs的濃度為20 μg/mL)(a)HepG2細胞;(b) MCF-7細胞;(c) HeLa細胞;(d)不同濃度的MnO2 NSs及control-RNA/MnO2NS探針與HeLa細胞孵育72 h后的的細胞存活率

3 結(jié)論

本實驗中,通過MnO2NSs負載著 FAM-let-7a 進入癌細胞,在癌細胞內(nèi)高表達的GSH的作用下,MnO2NSs發(fā)生降解,F(xiàn)AM-let-7a 被釋放到細胞質(zhì)中。根據(jù)細胞內(nèi)FAM熒光信號的恢復(fù)情況通過激光共聚焦熒光成像實現(xiàn)了對這一過程的原位監(jiān)測。同時,通過上調(diào)抑癌基因let-7a的方式實現(xiàn)了有效誘導(dǎo)癌細胞凋亡的目的。

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