王凱峰，王金鵬，韋萍，紀(jì)曉俊

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211816）

引 言

綠色生物制造利用可再生的生物質(zhì)資源為原料，將其綠色轉(zhuǎn)化為具有更高附加值的生物基產(chǎn)品，是一種新型的可持續(xù)發(fā)展的工業(yè)模式[1]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)資源與環(huán)境問(wèn)題的日益關(guān)注，利用微生物生產(chǎn)脂肪酸及其衍生物以代替?zhèn)鹘y(tǒng)化石和動(dòng)植物來(lái)源的相應(yīng)產(chǎn)品被認(rèn)為是綠色生物制造的典范。微生物來(lái)源的脂肪酸及其衍生物廣泛應(yīng)用于能源、材料和營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品等領(lǐng)域，可用于生產(chǎn)航空燃油、聚合物、增塑劑、潤(rùn)滑劑和食品添加劑等[2]。過(guò)去為了擺脫對(duì)化石原料的依賴(lài)，人們致力于利用動(dòng)植物來(lái)源的油脂來(lái)生產(chǎn)這些有用的脂肪酸及其衍生物。然而，由于植物生長(zhǎng)受環(huán)境、氣候等條件影響，動(dòng)物養(yǎng)殖周期長(zhǎng)等問(wèn)題，使得由動(dòng)植物生產(chǎn)油脂在原料供應(yīng)、生產(chǎn)控制方面存在一定的局限性，而利用富含油脂的微生物生產(chǎn)這些產(chǎn)品可以避免這些問(wèn)題[3]。

更重要的是，隨著代謝工程與合成生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，使得人們能夠充分挖掘微生物的代謝潛能，通過(guò)改造細(xì)胞內(nèi)部的代謝途徑，構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠，人為地調(diào)節(jié)脂肪酸鏈長(zhǎng)、不飽和度以及胞內(nèi)油脂總量以生產(chǎn)特定的脂肪酸及其衍生物[4-7]。通過(guò)這些微生物細(xì)胞工廠合成的脂肪酸及其衍生物被用來(lái)替代石油和動(dòng)植物來(lái)源的化學(xué)品，廣泛應(yīng)用于能源、材料、營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品等領(lǐng)域，提供了一種環(huán)境友好、可持續(xù)的綠色生物制造途徑。

為了實(shí)現(xiàn)構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)這些脂肪酸及其衍生物，研究者們首先在嘗試改造模式微生物大腸桿菌和釀酒酵母方面做了大量的工作[4-12]。近年來(lái)，解脂耶氏酵母作為一種新型的產(chǎn)油酵母而被廣泛關(guān)注。與釀酒酵母不同，解脂耶氏酵母油脂含量甚至能夠超過(guò)其自身細(xì)胞干重的80%以上[13]。同時(shí)，由于其生物安全性較高[14]，可以應(yīng)用于食品化合物的生產(chǎn)過(guò)程。因此，解脂耶氏酵母在生產(chǎn)面向能源、材料和營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品的脂肪酸及其衍生物方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)（圖1）。加之近年來(lái)，其遺傳改造工具發(fā)展迅速[15]，使其有潛力被改造成為高效合成脂肪酸及其衍生物的微生物細(xì)胞工廠。本文綜述了構(gòu)建解脂耶氏酵母細(xì)胞工廠生產(chǎn)面向能源、材料和營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品等脂肪酸及其衍生物的研究進(jìn)展，著重介紹了構(gòu)建細(xì)胞工廠過(guò)程中采用的代謝工程策略與合成生物學(xué)技術(shù)手段，為今后的研究提供技術(shù)參考。

1 解脂耶氏酵母

解脂耶氏酵母是一種二型、非致病酵母，因?yàn)槠浒踩⒛軌蛟谑杷h(huán)境中生長(zhǎng)以及具有高產(chǎn)油脂的能力，使其成為一種重要的非常規(guī)酵母。人們已成功構(gòu)建解脂耶氏酵母細(xì)胞工廠用于生產(chǎn)各種萜類(lèi)[16-17]、黃酮類(lèi)[18-19]、聚酮類(lèi)[20]化合物以及單細(xì)胞蛋白[21]和單細(xì)胞油脂[3]等。它還被研究用于處理和降解各種污染物，如油、鹵代烴、碳?xì)浠衔?、硝基化合物和有機(jī)磷化合物[22]。

圖1 解脂耶氏酵母合成的重要脂肪酸及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of the fatty acids and their derivatives produced by Yarrowia lipolytica

近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步促進(jìn)了各種改造解脂耶氏酵母的基因工程工具的蓬勃發(fā)展[15,23-24]。啟動(dòng)子影響微生物體內(nèi)基因表達(dá)水平，是構(gòu)建外源或內(nèi)源基因表達(dá)盒最重要的元件[25]。在解脂耶氏酵母中，組成型強(qiáng)啟動(dòng)子pTEF 和脂肪酸或烷烴誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pPOX2被普遍用于異源基因的表達(dá)[26]。研究發(fā)現(xiàn)pTEF 啟動(dòng)子序列若保留一段內(nèi)含子序列（pTEFin），其表達(dá)強(qiáng)度比pTEF 高17 倍[27]。另外，通過(guò)在pLEU2 啟動(dòng)子的核心區(qū)域上游插入四個(gè)XPR2基因上游的激活序列（UAS1）獲得雜合啟動(dòng)子hp4d，其強(qiáng)度顯著提高[28]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)可通過(guò)調(diào)整UAS1 的數(shù)目控制雜合啟動(dòng)子的強(qiáng)度[29]。在實(shí)際應(yīng)用中，啟動(dòng)子控制基因的表達(dá)并不是越強(qiáng)越好，因此，在代謝途徑構(gòu)建過(guò)程中，可以通過(guò)調(diào)整UAS1的數(shù)目構(gòu)建具有不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子庫(kù)的方法，篩選出最適于目標(biāo)蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子[30]。

由于解脂耶氏酵母的復(fù)制型質(zhì)粒匱乏，在實(shí)際操作中，基因過(guò)表達(dá)一般通過(guò)將外源基因片段插入基因組來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種方法依賴(lài)于DNA 修復(fù)的非同源末端連接[31]，但其插入位點(diǎn)的隨機(jī)性可能會(huì)破壞有用基因。而通過(guò)添加同源臂的方式可以使目的片段插入基因組中的特定位點(diǎn)，在敲除非同源末端連接關(guān)鍵蛋白KU70 后能顯著提高解脂耶氏酵母的同源重組效率[15]。解脂耶氏酵母可以利用的篩選標(biāo)記有營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因，如亮氨酸缺陷型標(biāo)記基因（LEU2）和尿嘧啶缺陷型標(biāo)記基因（URA3）[32]，以及各種抗生素抗性基因，如博來(lái)霉素、潮霉素B和諾爾斯菌素的抗性基因[33]。其中，URA3 可配合5-氟乳清酸（5-FOA）實(shí)現(xiàn)URA3 標(biāo)記的回收，通過(guò)重復(fù)使用URA3標(biāo)記基因而實(shí)現(xiàn)不同位點(diǎn)的迭代基因修飾[23]?；诖?，將解脂耶氏酵母體內(nèi)擁有200 多個(gè)拷貝的26s rDNA 作為同源臂，并結(jié)合loxp-URA3-loxp 組件，配合Cre 酶能實(shí)現(xiàn)外源基因在26s rDNA位點(diǎn)的迭代整合[34]。另外，將URA3 的啟動(dòng)子截短至6bp 構(gòu)建URA3d4，啟動(dòng)子截短后其表達(dá)量降低，只有多個(gè)拷貝的URA3d4才能使酵母在尿嘧啶缺陷型平板上生長(zhǎng)，基于此可實(shí)現(xiàn)表達(dá)盒的多拷貝整合[35]。除了依賴(lài)于同源重組或者非同源末端連接的基因編輯手段，結(jié)合核酸內(nèi)切酶Cas9 和單鏈向?qū)NA（sgRNA）的CRISPR/Cas9 技術(shù)可實(shí)現(xiàn)基因的精確編輯[23-24]。另外，缺失切割活性的Cas9 突變體dCas9 可用于構(gòu)建CRISPR 抑制系統(tǒng)（CRISPRi）用于抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄，將轉(zhuǎn)錄激活因子和dCas9 融合便可構(gòu)建CRISPR 激活系統(tǒng)（CRISPRa）靶向增強(qiáng)特定基因的轉(zhuǎn)錄[23]。此外，在DNA 組裝技術(shù)方面，各類(lèi)快速組裝技術(shù)被廣泛研究，如DNA Assembler、Gateway 克隆、BioBricks、Gibson 組裝和Golden-Gate組裝[15]，這些技術(shù)的誕生解決了傳統(tǒng)的基于限制性?xún)?nèi)切酶切割和連接酶連接組裝技術(shù)效率低的問(wèn)題。隨著針對(duì)解脂耶氏酵母各種合成生物技術(shù)手段的快速發(fā)展，使其更易被工程改造成合成特定脂肪酸及其衍生物的微生物細(xì)胞工廠。

解脂耶氏酵母中的油脂主要是由脂肪酸和3-磷酸甘油合成的中性甘油三酯（TAG）以及甾醇酯構(gòu)成，其中TAG占絕大部分[36]。首先，細(xì)胞質(zhì)來(lái)源的乙酰輔酶A 經(jīng)過(guò)乙酰輔酶A 羧化酶（ACC1）催化生成丙二酰輔酶A。隨后，二者作為前體（乙酰輔酶A 為起始化合物，丙二酰輔酶A為延長(zhǎng)單位）在脂肪酸延長(zhǎng)酶（FAS1和FAS2）的作用下不斷伸長(zhǎng)2個(gè)碳骨架，最終以16 或18 碳脂肪酰輔酶A（C16:0 和C18:0）的形式釋放。接著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，C16:0 和C18:0 會(huì)被兩種脂肪酸延長(zhǎng)酶（ELO1 和ELO2）延伸為長(zhǎng)鏈（C18～C22）或超長(zhǎng)鏈（C22～C26）脂酰輔酶A，或者被Δ9 去飽和酶（OLE1）去飽和成單不飽和脂酰輔酶A（C16:1 和C18:1）[37]。C18:1 又會(huì)被Δ12 去 飽和酶（FAD2）進(jìn)一步催化生成多不飽和脂酰輔酶A（C18:2）。最后，二酰甘油（DAG）會(huì)通過(guò)磷脂：二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（LRO1）催化磷脂或者二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGA1）催化脂酰輔酶A 生成TAG，最終以脂滴的形式在胞內(nèi)積累[38]。脂滴是一種營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存形式，在培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡后會(huì)被脂肪酶（TGL3 和TGL4）降解為脂肪酸，進(jìn)而經(jīng)過(guò)脂肪酸 激 活 蛋 白（FAA1）或 者 轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白（PXA1 和PXA2）激活成脂酰輔酶A 并轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入過(guò)氧化物酶體中通過(guò)β-氧化降解。由于解脂耶氏酵母中天然存在上述脂肪酸合成、積累和降解途徑，因此其具有通過(guò)工程改造實(shí)現(xiàn)各類(lèi)脂肪酸及其衍生物合成的良好基礎(chǔ)（圖2）。

2 能源化學(xué)品

2.1 中鏈脂肪酸

圖2 解脂耶氏酵母中脂肪酸及其衍生物的合成途徑Fig.2 Metabolic pathways of fatty acids and their derivatives in Yarrowia lipolytica

中鏈脂肪酸（MCFA）通常指碳鏈長(zhǎng)度為6～14的脂肪酸，相比于長(zhǎng)鏈脂肪酸，其凝固點(diǎn)較低，可用作航空煤油在低溫下使用；相比于短鏈脂肪酸，其沸點(diǎn)較高、不易揮發(fā)、易于儲(chǔ)存。因此，中鏈脂肪酸及其衍生物可以提高生物燃料的性能，是化石燃料可持續(xù)的替代品[4]。解脂耶氏酵母中的脂肪酸合成酶屬于Ⅰ型系統(tǒng)（FASI），是一種包含8 個(gè)功能催化從頭合成脂肪酸的多功能蛋白，可分為α 亞基和β 亞基。α 亞基由酰基載體蛋白（ACP）、酮?；€原酶（KR）、酮酰基合酶（KS）和磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶（PPT）組成；β 亞基由酰基轉(zhuǎn)移酶（AT）、烯醇還原酶（ER）、脫水酶（DH）和丙二酰/棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（MPT）組成[39]。具體而言，首先乙酰輔酶A 和丙二酰輔酶A 在AT 和MPT 的轉(zhuǎn)酰活性下生成乙酰ACP和丙二酰ACP，二者被KS 催化縮合，并在KR、DH、ER作用下形成飽和?；鵄CP[40-41]。接著通過(guò)與丙二酰ACP 縮合增加2 個(gè)碳鏈不斷循環(huán)直至被MPT 轉(zhuǎn)化為?；o酶A 終止[42]。與酵母來(lái)源的FASⅠ不同，細(xì)菌和植物來(lái)源的FAS 屬于Ⅱ型系統(tǒng)，其脂肪酸的延伸需要硫酯酶參與[43-44]。相同的是，F(xiàn)ASⅡ和FASⅠ都需要KS域來(lái)進(jìn)行脂肪酸的延長(zhǎng)。

目前，解脂耶氏酵母合成中鏈脂肪酸的代謝工程手段主要是圍繞引入外源硫酯酶和改造KS 以調(diào)節(jié)脂肪酸鏈長(zhǎng)展開(kāi)的。在細(xì)菌和植物中，F(xiàn)ASⅡ中的不同催化亞基是分散的，所以更容易表達(dá)外源的中鏈特異性硫酯酶來(lái)終止長(zhǎng)鏈脂肪酸合成以積累中鏈脂肪酸[10,45-46]。而解脂耶氏酵母中的FASⅠ各催化域結(jié)合緊密，使得表達(dá)外源的硫酯酶往往不能夠大幅度提高中鏈脂肪酸產(chǎn)量。Rutter 等[47]通過(guò)在解脂耶氏酵母中表達(dá)各類(lèi)對(duì)中鏈脂肪酸有特異性的?；鵄CP 硫酯酶，發(fā)現(xiàn)分子量較小的?；鵄CP 硫酯酶能夠改變解脂耶氏酵母的脂肪酸組成，如：加州月桂（Umbellularia californica）來(lái)源的?；鵄CP 硫酯酶能夠使解脂耶氏酵母合成辛酸或癸酸。同樣，Xu 等[39]的研究表明在解脂耶氏酵母中表達(dá)分子量較 小 的 酰 基CoA/ACP 硫 酯 酶（EGT、EcTesA′、EcTesC、EcYbgC 和EcYciA）能夠生產(chǎn)中鏈脂肪酸。這是因?yàn)榉肿恿枯^小的硫酯酶更容易擴(kuò)散到FASⅠ的腔室中發(fā)生催化作用，從而提前終止脂肪酸鏈的進(jìn)一步延伸。研究人員還嘗試用硫酯酶替換FASⅠ中的MPT 域，例如用大腸桿菌來(lái)源的硫酯酶（EcTesA′）替換MPT 能夠使C14 脂肪酸比例提高到29.2%，是直接表達(dá)EcTesA′的3倍。同樣，用加州月桂來(lái)源的硫酯酶（UcBTE）替換MPT能夠使C12脂肪酸含量提高6 倍。除此之外，KS 結(jié)構(gòu)域決定著脂肪酸的延伸，對(duì)其進(jìn)行突變能夠改變最終脂肪酸的鏈長(zhǎng)。采用分子模擬方法探究KS 對(duì)C16 脂肪酸的分子結(jié)合方式，發(fā)現(xiàn)異亮氨酸殘基I1220是影響KS 中?；o酶A結(jié)合口袋大小的關(guān)鍵氨基酸。當(dāng)用芳香族氨基酸取代I1220時(shí)，縮小了KS的催化口袋，使中鏈脂肪酸不能與其結(jié)合繼續(xù)延伸而被過(guò)早釋放出來(lái)，最終使得突變菌株積累占總脂肪酸11.6%的C14 中鏈脂肪酸[48]，這是在解脂耶氏酵母中通過(guò)突變KS 域生產(chǎn)中鏈脂肪酸的有益嘗試。Rigouin 等[49]在此基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)了來(lái)自油棕（Elaeis guineensus）對(duì)中鏈脂肪酸有特異性的甘油三酯酰轉(zhuǎn)移酶（DGAT）后，使中鏈脂肪酸積累在TAG 中，最終中鏈脂肪酸含量占總油脂的45%。

然而研究表明，中鏈脂肪酸的積累會(huì)影響必需脂肪酸的合成而影響細(xì)胞生長(zhǎng)[47]。為了提高細(xì)胞對(duì)中鏈脂肪酸的耐受性，在釀酒酵母中對(duì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體TPO1進(jìn)行定向進(jìn)化和對(duì)菌體進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，使中鏈脂肪酸的產(chǎn)量分別提高了1.3 和1.7 倍[4]。最近，在釀酒酵母中鑒定了中鏈脂肪酸響應(yīng)型啟動(dòng)子，并用于釀酒酵母合成中鏈脂肪酸及其衍生物的動(dòng)態(tài)調(diào)控[50]。因此，未來(lái)在利用解脂耶氏酵母合成中鏈脂肪酸過(guò)程中，可圍繞增強(qiáng)其對(duì)中鏈脂肪酸的耐受性展開(kāi)，并結(jié)合鑒定響應(yīng)中鏈脂肪酸的啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)調(diào)控平衡細(xì)胞的生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成，從而進(jìn)一步提高其中鏈脂肪酸產(chǎn)量。

2.2 脂肪酸乙酯

脂肪酸乙酯（FAEE）是可作為柴油替代物的重要生物燃料，目前常用的生物燃料乙醇對(duì)現(xiàn)有設(shè)備具有一定的腐蝕性，而且需要特定的儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件[40]，而FAEE 沒(méi)有這些缺點(diǎn)。目前，大多數(shù)FAEE是由乙醇與各種脂質(zhì)原料（例如植物油或動(dòng)物脂肪）在催化劑的作用下發(fā)生酯交換反應(yīng)生成[51]。為了解決FAEE 原料供應(yīng)受限并且生產(chǎn)過(guò)程不夠環(huán)保的問(wèn)題，工程改造微生物直接合成FAEE 提供了一種可持續(xù)、環(huán)境友好的生產(chǎn)路線。目前微生物生產(chǎn)FAEE 研究最多的宿主是釀酒酵母，其自身能夠合成乙醇，因此在合成FAEE 的過(guò)程中（由蠟酯合酶（WS）催化乙醇和脂酰輔酶A生成）無(wú)須外源添加乙醇[52]。然而釀酒酵母合成脂肪酸的能力有限，需要外源添加脂肪酸才能提高FAEE 產(chǎn)量[53]。相較而言，解脂耶氏酵母因?yàn)榫哂懈叩闹舅岱e累能力而被認(rèn)為是極具潛力的FAEE生產(chǎn)宿主。

工程改造解脂耶氏酵母合成FAEE 主要通過(guò)共表達(dá)來(lái)自不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baylyi ADP1）的蠟酯合酶（AbAtfA）和外源添加乙醇來(lái)實(shí)現(xiàn)，當(dāng)AbAtfA靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過(guò)氧化物酶體時(shí)，F(xiàn)AEE 的產(chǎn)生分別增加到136.5 和110.9 mg/L[39]。Gao 等[54]通過(guò)四種策略對(duì)該過(guò)程進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化：①利用雜交強(qiáng)啟動(dòng)子pUAS4B-TEFin 表達(dá)經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的除烴海桿菌（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）來(lái)源的蠟酯合酶MhAtfA 基因。②過(guò)表達(dá)自身的檸檬酸裂解酶（ACL）、釀酒酵母來(lái)源的乙酰輔酶A 合成酶（ACS2）和自身乙酰輔酶A 羧化酶（ACC1）以提高胞內(nèi)乙酰輔酶A 水平。③敲除油脂積累的關(guān)鍵基因dga1 和油脂氧化關(guān)鍵基因pex10 來(lái)增加FAEE 前體脂酰輔酶A。④優(yōu)化外源乙醇的添加濃度。最終改造后的解脂耶氏酵母在含有5%(體積)乙醇的搖瓶中培養(yǎng)，能夠以1.18 g/L 的濃度合成FAEE，是工程微生物生產(chǎn)FAEE 的最高產(chǎn)量。為了避免乙醇的外源添加，Yu 等[55]在解脂耶氏酵母中引入來(lái)自釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶（PDC1）和醇脫氫酶（ADH1）構(gòu)建了從丙酮酸到乙醇的完整外源途徑，試圖以自身合成的乙醇為底物來(lái)合成FAEE。隨后通過(guò)進(jìn)一步過(guò)表達(dá)甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）促進(jìn)NADH的再生，為乙醇-乙醛穿梭提供充足的NADH 供應(yīng)，進(jìn)而將乙醇產(chǎn)量提高至70.8 mg/L。然而，因?yàn)橐掖紳舛忍?，在引入蠟酯合酶MhAtfA 后僅能夠合成0.3 mg/L的FAEE，遠(yuǎn)低于外源添加乙醇時(shí)的產(chǎn)量。最后，作者將解脂耶氏酵母和釀酒酵母共培養(yǎng)，試圖以釀酒酵母合成大量乙醇供應(yīng)解脂耶氏酵母生產(chǎn)FAEE，優(yōu)化共培養(yǎng)方式后最優(yōu)混菌體系能合成500.4 mg/L的FAEE。以上研究表明解脂耶氏酵母利用內(nèi)源乙醇合成FAEE 的局限在于乙醇生產(chǎn)水平較低，未來(lái)可將研究的重點(diǎn)放在提高其FAEE 前體乙醇合成能力方面。

2.3 烷烴

烷烴是一種飽和碳?xì)浠衔铮瑑H由碳碳與碳?xì)鋯捂I構(gòu)成，可分為鏈烷烴與環(huán)烷烴。通過(guò)石油分餾獲得不同鏈長(zhǎng)的鏈烷烴，廣泛應(yīng)用于燃料、化工原料等方面，其中短鏈和長(zhǎng)鏈烷烴是汽油、航空燃油的重要組成部分[56]。利用生物質(zhì)原料通過(guò)微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)烷烴符合可持續(xù)發(fā)展要求，可代替石油基燃料。微生物合成烷烴是脂肪酸在一系列酶的催化下，經(jīng)過(guò)還原和脫羧反應(yīng)而形成。利用這一途徑已經(jīng)成功在大腸桿菌和釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了各種鏈長(zhǎng)烷烴的合成[6-7,56]。解脂耶氏酵母相較于大腸桿菌和釀酒酵母，因其能夠大量合成脂肪酸，所以更有潛力被工程化改造合成各種烷烴。

利用解脂耶氏酵母合成鏈烷烴主要有兩種途徑。脂氧合酶能夠?qū)⒅舅醿?nèi)的(Z,Z)-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)單元加氧，將多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸氫過(guò)氧化物。在大豆和花生中分別利用大豆脂氧合酶Ⅰ/Ⅱ和花生脂氧合酶將亞油酸(C18:2)轉(zhuǎn)化為中間體13-氫過(guò)氧亞油酸(13-HPOD)，進(jìn)而合成短鏈烷烴。在能夠生產(chǎn)亞油酸占總油脂47%的解脂耶氏酵母[57]中導(dǎo)入了大豆脂氧合酶I(Gmlox1)，并通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和敲除β-氧化第二步的多功能酶(MFE1)以提高前體亞油酸的供應(yīng)，最終能夠合成1.56 mg/L 的戊烷[58]，這是首次在微生物中合成短鏈烷烴的報(bào)道。解脂耶氏酵母合成鏈烷烴的另一種途徑是通過(guò)脂酰輔酶A或脂肪酸經(jīng)過(guò)脂酰輔酶A還原酶或羧酸還原酶催化生成脂肪醛，然后被醛脫甲氧合酶轉(zhuǎn)化為烷烴。Xu 等[39]在解脂耶氏酵母中共表達(dá)來(lái)自不動(dòng)桿菌的脂酰輔酶A 還原酶(AbACR1)和海洋原綠球藻(Prochlorococcus marinus)來(lái)源的醛脫甲氧合酶(PmADO)后，成功合成了3.2 mg/L 的烷烴混合物。進(jìn)一步將兩種酶靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，烷烴產(chǎn)量增加到16.8 mg/L。另外，他們?cè)诎麧{中表達(dá)海洋分枝桿菌來(lái)源的羧酸還原酶(MmCAR)、枯草芽孢桿菌來(lái)源與ACP 激活模塊相關(guān)的磷酰轉(zhuǎn)移酶(BsuSfp)和PmADO 能夠生成23.3 mg/L 的烷烴。未來(lái)，利用解脂耶氏酵母卓越的脂肪酸合成能力實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)烷烴的目標(biāo)，需要采用關(guān)鍵酶過(guò)表達(dá)、阻斷脂肪酸氧化以及增強(qiáng)細(xì)胞的魯棒性以緩解烷烴的細(xì)胞毒性等多種策略進(jìn)行改造。

3 材料化學(xué)品

3.1 蓖麻油酸

蓖麻油酸學(xué)名是12-羥基-十八碳-順-9-烯酸，是一種具有羥基官能團(tuán)的脂肪酸，具有多種用途[59-60]，尤其是在材料領(lǐng)域，其衍生物廣泛用于尼龍11、聚氨酯、聚酰胺等材料的合成[36,61]。蓖麻油酸主要從蓖麻籽中提取，然而由于蓖麻籽體內(nèi)含有對(duì)人體有害的蓖麻毒蛋白[62]，限制了蓖麻的廣泛種植。這促使人們嘗試通過(guò)多種替代方法來(lái)生產(chǎn)蓖麻油酸：如以植物油為原料化學(xué)催化制備蓖麻油酸[63]，基因工程改造各類(lèi)植物[64]、微生物[65-66]以生產(chǎn)蓖麻油酸。然而由于這些生物本身不能積累大量脂肪酸，研究者們開(kāi)始著眼于工程改造油料作物或者產(chǎn)油微生物合成蓖麻油酸。

蓖麻油酸主要是由蓖麻豆羥化酶（Δ12 油酸羥化酶，F(xiàn)AH12）催化油酸合成。解脂耶氏酵母中天然能積累較多的油酸，經(jīng)過(guò)工程改造后油酸含量高達(dá)總脂肪酸的92%[67]。通常，工程改造解脂耶氏酵母生產(chǎn)蓖麻油酸的主要策略包括三個(gè)方面：①異源表達(dá)合適的Δ12 油酸羥化酶（FAH12）；②敲除Δ12 去飽和酶以降低油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸；③表達(dá)對(duì)蓖麻油酸有底物特異性的甘油三酯酰轉(zhuǎn)移酶（DGAT）。Beopoulos 等[68]在解脂耶氏酵母中敲除pox1-6 和Ylfad2基因阻斷β-氧化途徑和亞油酸合成途徑以增加前體油酸的含量，在此基礎(chǔ)上，敲除了三種DAG?；D(zhuǎn)移酶DGA1、DGA2 和LRO1，接著回補(bǔ)LRO1使菌株僅通過(guò)磷脂途徑合成TAG，并進(jìn)一步探究了來(lái) 自 Claviceps purpurea 的 Δ12 油 酸 羥 化 酶（CpFAH12）和來(lái)自Ricinus communis 的Δ12 油酸羥化酶（RcFAH12）對(duì)蓖麻油酸合成的影響，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)2 個(gè)拷貝的CpFAH12 后蓖麻油酸產(chǎn)量最高。后來(lái)研究通過(guò)表達(dá)3拷貝CpFAH12和2拷貝LRO1，進(jìn)一步改進(jìn)了生產(chǎn)菌株，在10 L 生物反應(yīng)器中能合成12 g/L 的蓖麻油酸，占總脂肪酸的60%[68]。最后，他們嘗試表達(dá)Ricinus communis 來(lái)源的甘油三酯酰轉(zhuǎn)移酶（RcDGAT2）或Claviceps purpurea 來(lái)源的甘油三酯酰轉(zhuǎn)移酶（CpDGAT2）以提高蓖麻油酸的積累，結(jié)果反而降低了蓖麻油酸的產(chǎn)量。這些工程改造策略證明了解脂耶氏酵母作為高產(chǎn)蓖麻油酸菌株的可行性，未來(lái)，可通過(guò)進(jìn)一步鑒定限速步驟、提高總油脂和直接前體油酸的含量以提高蓖麻油酸的產(chǎn)量。

3.2 長(zhǎng)鏈二元酸

長(zhǎng)鏈二元酸（DCA）是指10 個(gè)或以上碳原子的直鏈飽和二元羧酸，可用于生產(chǎn)特種尼龍、聚酰胺熱熔膠等一系列高附加值的材料，目前主要通過(guò)化學(xué)法合成。用微生物生產(chǎn)DCA 主要是以烷烴或脂肪酸為底物通過(guò)氧化途徑合成，脂肪酸的ω 末端被細(xì)胞色素P450單加氧酶和NADPH 依賴(lài)的細(xì)胞色素P450 氧化還原酶羥基化形成ω-羥基脂肪酸，隨后被脂肪醇氧化酶進(jìn)一步氧化為脂肪醛，最后，由NADH 依賴(lài)的脂肪醛脫氫酶催化形成DCA[36]。值得注意的是，解脂耶氏酵母細(xì)胞內(nèi)合成的DCA 會(huì)通過(guò)發(fā)生在過(guò)氧化物酶體中的β-氧化途徑降解，因此阻斷β-氧化途徑是促進(jìn)解脂耶氏酵母中DCA 積累的有效方法。Smit等[69]在解脂耶氏酵母中首次嘗試通過(guò)添加不同鏈長(zhǎng)的烷烴和烷烴降解的中間體來(lái)生產(chǎn)DCA。結(jié)果表明，解脂耶氏酵母可以轉(zhuǎn)化添加的化合物為DCA，但β-氧化途徑能夠快速地降解生成的DCA，所以需要敲除β-氧化途徑的關(guān)鍵基因pox1-6 阻止DCA 降解。此外，從烷烴或者脂肪酸合成DCA 的限速步驟是參與ω-氧化第一階段的羥基化反應(yīng)，為此，Thevenieau 等[70]在敲除pox1-6 基因之后，借鑒Picataggio 等[71]改造熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）的方法，過(guò)表達(dá)NADPH 依賴(lài)型細(xì)胞色素P450 還原酶和12種細(xì)胞色素P450 單加氧酶的編碼基因以增強(qiáng)ω-氧化第一階段的羥基化活性從而提高了DCA 的產(chǎn)量。Gatter 等[72]通過(guò)序列比對(duì)，在解脂耶氏酵母中鑒定出一個(gè)醇氧化酶基因（FAO），過(guò)表達(dá)FAO 后DCA 產(chǎn)量提高了10 倍。Mishra 等[73]為了在解脂耶氏酵母中鑒定新的能夠提高DCA 合成能力的遺傳改造靶點(diǎn)，通過(guò)建立基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型，從中篩選出有利于十二烷二酸合成的關(guān)鍵過(guò)表達(dá)靶點(diǎn)：蘋(píng)果酸脫氫酶、蘋(píng)果酸酶和谷氨酸脫氫酶，并最終通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明這3 個(gè)酶的過(guò)表達(dá)能夠提高十二烷二酸的產(chǎn)量。

3.3 聚羥基脂肪酸酯

聚羥基脂肪酸酯（PHA）是一類(lèi)可生物降解的聚酯，可用作替代化石類(lèi)聚酯的生物材料。PHA 通常是由微生物在過(guò)量碳源和一種必需營(yíng)養(yǎng)元素限制的條件下在胞內(nèi)積累的，這種生物聚合物是由羥基脂肪酸在PHA 合酶的催化下以顆粒形式聚合而成的，是一種用于碳和能量存儲(chǔ)的化合物[74]。PHA 根據(jù)其單體的側(cè)鏈可以分為短鏈長(zhǎng)度的PHA（具有3～5 個(gè)碳原子的scl-PHA）和中鏈長(zhǎng)度的PHA（具有6～14 個(gè)碳原子的mcl-PHA）[75]。解脂耶氏酵母因?yàn)槠涓咚接椭铣赡芰桶麅?nèi)乙酰輔酶A 含量較高，已被廣泛研究用于生產(chǎn)各類(lèi)PHA。解脂耶氏酵母可以通過(guò)補(bǔ)充外源脂肪酸和表達(dá)銅綠假單胞菌來(lái)源的PHA合酶用于生產(chǎn)各種PHA共聚物和均聚物。Haddouche 等[76]通過(guò)敲除脂質(zhì)合成途徑和過(guò)表達(dá)MFE 蛋白的2-烯脂酰輔酶A 水合酶結(jié)構(gòu)域以增強(qiáng)3-羥基脂肪酸前體的合成，將脂肪酸通量重定向至β-氧化，最終合成占細(xì)胞干重7%的PHA。聚-3-羥基丁酸酯（PHB）屬于scl-PHA，在解脂耶氏酵母中通過(guò)表達(dá)Ralstonia eutropha 菌株來(lái)源的β-酮硫解酶（PhaA）、乙酰乙酰輔酶A還原酶（PhaB）和PHA合酶（PhaC），可轉(zhuǎn)化乙酰輔酶A 生成PHB。在補(bǔ)充葡萄糖和乙酸鹽作為碳源后，能積累干重1.50% 和3.84%的PHB，以乙酸鹽作為唯一碳源分批發(fā)酵，PHB 能高達(dá)7.35 g/L，占干重的10.2%[77]。然而，PHA的性質(zhì)取決于其分子量和分子結(jié)構(gòu)，例如屬于scl-PHA的PHB力學(xué)性能通常較差，彈性性能不如mcl-PHA，而更適用于特定的醫(yī)學(xué)材料[78]。研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌PHA 合酶（PhaC1）對(duì)R-3-羥基辛酰輔酶A 具有特異性，在解脂耶氏酵母中多拷貝表達(dá)經(jīng)密碼子優(yōu)化的PhaC1 編碼基因可以增加mcl-PHA的積累[79]。Rigouin 等[78]通過(guò)油酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子POX2 過(guò)表達(dá)MFE 蛋白促進(jìn)脂肪酸降解生產(chǎn)mcl-PHA 共聚物，而過(guò)表達(dá)MFE 蛋白的2-烯脂酰輔酶A水合酶結(jié)構(gòu)域以避免3-羥基脂肪酸進(jìn)一步降解生成mcl-PHA 均聚物。另外，研究發(fā)現(xiàn)，解脂耶氏酵母中的酰基輔酶A 氧化酶（AOX）編碼基因pox1-6對(duì)不同鏈長(zhǎng)脂肪酸具有偏好性，可通過(guò)表達(dá)對(duì)非目標(biāo)鏈長(zhǎng)有特異性的pox 基因使得非目標(biāo)鏈長(zhǎng)的脂肪酸降解從而生產(chǎn)特定鏈長(zhǎng)的PHA[80]。

4 營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品

4.1 共軛亞油酸

共軛亞油酸（CLA）是亞油酸（C18:2）的同分異構(gòu)體，具有抗肥胖、抗動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防代謝性疾病以及參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的作用，常用作膳食補(bǔ)充劑[81]。然而各種異構(gòu)體中只有順-9，反-11 共軛亞油酸和反-10，順-12 共軛亞油酸具有上述功能。工業(yè)化生產(chǎn)CLA 主要是利用植物油堿性異構(gòu)化生產(chǎn)，得到是多種異構(gòu)體的混合物，限制了在營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品方面的應(yīng)用。因此，利用微生物中酶的特異性合成特定異構(gòu)體的CLA 是可行的替代方法。近年來(lái)，人們著眼于研究代謝工程改造解脂耶氏酵母生產(chǎn)CLA，因?yàn)槠潴w內(nèi)存在大量用于生產(chǎn)CLA 的前體亞油酸。目前，已經(jīng)成功挖掘出來(lái)自痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes）合成反-10，順-12 共軛亞油酸的亞油酸異構(gòu)酶以及兩個(gè)來(lái)自生孢梭菌（Clostridium sporogenes） 和 羅 伊 氏 乳 桿 菌（Lactobacillus reuteri）合成順-9，反-11 共軛亞油酸的亞油酸異構(gòu)酶[36,82]。在解脂耶氏酵母中多拷貝表達(dá)經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化痤瘡丙酸桿菌來(lái)源的亞油酸異構(gòu)酶基因，在葡萄糖培養(yǎng)基中成功獲得占總脂肪酸5.6%的反-10，順-12 共軛亞油酸[83]。進(jìn)一步，將UAS1B 與原啟動(dòng)子hp4d 融合構(gòu)建hp16d 強(qiáng)啟動(dòng)子，并用多拷貝整合質(zhì)粒共表達(dá)高山被孢酶來(lái)源的Δ12去飽和酶和密碼子優(yōu)化過(guò)的痤瘡丙酸桿菌來(lái)源的亞油酸異構(gòu)酶基因，能合成占總脂肪酸10%的反-10，順-12 共軛亞油酸[84]。當(dāng)重組菌在大豆油中培養(yǎng)38.5 h 后，目標(biāo)產(chǎn)物占總脂肪酸44%[84]。然而，共軛亞油酸會(huì)通過(guò)解脂耶氏酵母中的β-氧化途徑降解，針對(duì)該問(wèn)題，可通過(guò)抑制降解途徑提高其產(chǎn)量。Imatoukene 等[85]在解脂耶氏酵母中敲除pox1-6 基因以破壞β-氧化途徑，同時(shí)敲除油脂積累基因dga1、dga2、are1 和lro1 以提供更多游離脂肪酸作為前體。最終在表達(dá)自身的Δ12 去飽和酶和2 拷貝的痤瘡丙酸桿菌來(lái)源的亞油酸異構(gòu)酶基因后，能夠積累總脂肪酸6.5%的反-10，順-12 共軛亞油酸，并且菌株共軛亞油酸的降解速率明顯降低。

4.2 多不飽和脂肪酸

多不飽和脂肪酸指含有兩個(gè)及以上雙鍵且碳鏈長(zhǎng)度為18～22 個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)式中雙鍵距羧基端的位置，分為Omega-3 和Omega-6兩類(lèi)。多不飽和脂肪酸能夠賦予細(xì)胞膜系統(tǒng)以柔韌性、流動(dòng)性和選擇通透性，是人類(lèi)和其他哺乳動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)必需品[86-87]。多不飽和脂肪酸的傳統(tǒng)來(lái)源是基于植物和動(dòng)物組織提取獲得，這種方法不僅目標(biāo)產(chǎn)物含量低，而且生產(chǎn)受季節(jié)和地理位置的限制。充分利用自然界微生物的代謝潛能可以使其大量積累人們所需的各種多不飽和脂肪酸。解脂耶氏酵母中天然存在的兩種不飽和脂肪酸C18:1 和C18:2，可作為其他不飽和脂肪酸的前體，為代謝工程改造解脂耶氏酵母合成多不飽和脂肪酸提供了可能。

為了實(shí)現(xiàn)Omega-3 的α-亞麻酸（ALA）的生物合成，Damude 等[88]嘗試性在解脂耶氏酵母中導(dǎo)入雙功能鐮刀菌（Fusarium moniliformis）來(lái)源的Δ15去飽和酶，最終獲得了占總脂肪酸28%的ALA。Cordova等[89]選擇一株能夠積累高含量（80%）油酸的解脂耶氏酵母作為出發(fā)菌株，在其中表達(dá)3 個(gè)拷貝來(lái)自Rhodosporidium kratochvilovae 的Δ15 去飽和酶RkΔ 12-15，ALA 的含量由0.1%提高到8.1%。研究表明，脂肪酸組分與細(xì)胞膜的組成和流動(dòng)性相關(guān)，所以培養(yǎng)條件如溫度會(huì)影響微生物的脂肪酸組成[90]。總的來(lái)說(shuō)，降低培養(yǎng)溫度后微生物會(huì)為了維持膜的流動(dòng)性而提高膜中脂肪酸成分的不飽和度。于是，Cordova 等[89]進(jìn)一步將RkΔ12-15 三拷貝菌株處于20℃低溫發(fā)酵，最終ALA 產(chǎn)量提高至總油脂的17.0%，達(dá)到了1.4 g/L。二十碳五烯酸（EPA）具有多種生理與保健功能，是最重要的一種Omega-3 多不飽和脂肪酸。EPA 在微生物中具有天然的合成途徑，包括厭氧聚酮合酶途徑和需氧去飽和延長(zhǎng)途徑兩種[91]。目前，代謝工程改造解脂耶氏酵母合成EPA 主要是基于需氧去飽和酶和延長(zhǎng)酶途徑。美國(guó)DuPont 公司在這方面首開(kāi)先河，選擇來(lái)源于不同微生物的去飽和酶和延長(zhǎng)酶在解脂耶氏酵母中表達(dá)，并基于啟動(dòng)子工程、多拷貝策略和蛋白質(zhì)融合策略進(jìn)行菌株改造，獲得了一株能夠積累占總脂肪酸58%的EPA高產(chǎn)菌株[92]。經(jīng)過(guò)一系列的發(fā)酵優(yōu)化和工業(yè)放大，DuPont 公司成功地將其推向產(chǎn)業(yè)化，基于所獲得的高產(chǎn)菌株開(kāi)發(fā)了兩款富含EPA 的產(chǎn)品（New Harvest ?EPA oil 和Verlasso?salmo）[93]。DuPont 公司采用類(lèi)似的策略在解脂耶氏酵母中構(gòu)建了需氧去飽和延長(zhǎng)途徑合成了另一種重要的Omega-3 多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸（DHA），通過(guò)導(dǎo)入來(lái)自高山被孢霉的Δ4，Δ5，Δ6，Δ7 去飽和酶、C18～C20 延長(zhǎng)酶，以及Thraustochytrium aureum來(lái)源的C20～C22 延長(zhǎng)酶，并敲除內(nèi)源的?；D(zhuǎn)移酶和去飽和酶基因，最終獲得了占總脂肪酸5.6%的DHA[94]。為了進(jìn)一步提高解脂耶氏酵母合成DHA的能力，Gemperlein 等[95]在其中引入了DHA 合成的厭氧聚酮合酶途徑，通過(guò)異源表達(dá)經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后的4′-磷酸泛乙烯基轉(zhuǎn)移酶（PPTase）和長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸合成酶生物基因簇，能合成占總脂肪酸10.5%的DHA。與利用好氧途徑相比，該DHA 合成途徑不依賴(lài)內(nèi)源性脂肪酸作為生物合成前體，并降低了NAD(P)H的消耗。

除了上述3 種Omega-3 多不飽和脂肪酸，Omega-6 多不飽和脂肪酸，包括γ-亞麻酸（GLA）和花生四烯酸（ARA）也具有重要的生理功能，是重要的營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品[96]。本課題組[97]在解脂耶氏酵母中過(guò)表達(dá)了來(lái)源于高山孢酶的Δ6去飽和酶，合成了占總脂肪酸6.1%的GLA。此外，本課題組[98-100]還基于ARA在自然界微生物中存在的兩條合成途徑（Δ6和Δ9），通過(guò)比較不同途徑的效率，并基于一步組裝和連接肽融合表達(dá)等措施優(yōu)化了合成的異源代謝途徑，在解脂耶氏酵母中實(shí)現(xiàn)了ARA的高效合成。

5 其他化學(xué)品

解脂耶氏酵母合成的脂肪酸及其衍生物除了應(yīng)用于上述能源、材料和營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品等方面，還廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及日化等領(lǐng)域。如其胞內(nèi)豐富的脂肪酸前體可被脂氧合酶（LOX）和過(guò)氧化氫裂解酶（HPL）催化合成己醛[101]，其中富含的油酸經(jīng)羥基化生成蓖麻油酸，接著經(jīng)過(guò)四輪β-氧化，生成前體4-羥基癸酸，隨后可被異構(gòu)化和乳糖化形成γ-癸內(nèi)酯[102]，己醛和γ-癸內(nèi)酯可作為香精香料使用，是重要的食品添加劑。此外，奇數(shù)鏈脂肪酸和脂肪醇也在醫(yī)藥和日化領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用。

5.1 奇數(shù)鏈脂肪酸

微生物中的脂肪酸主要是碳原子數(shù)為偶數(shù)且介于16～20 之間，較為稀有的奇數(shù)鏈脂肪酸因其功能獨(dú)特性而具有很高的商業(yè)價(jià)值[103]。例如順-9-庚烯酸對(duì)銀屑病、過(guò)敏和自身免疫性疾病具有抗炎作用[104]。十五烷酸和七烷酸可以作為評(píng)估冠心病風(fēng)險(xiǎn)和Ⅱ型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)記物[105]。在工業(yè)上，奇數(shù)鏈脂肪酸可以作為添加劑以改變生物燃料的性能[106]。此外，奇數(shù)鏈脂肪酸及衍生物是很多化學(xué)品的前體，如殺菌劑、香料、液壓液、增塑劑、涂料等工業(yè)化學(xué)品。微生物中合成奇數(shù)鏈脂肪酸，可以通過(guò)丙酸酯轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A，丙酰輔酶A 與丙二酰輔酶A 縮合生成五碳化合物3-氧雜戊酰-ACP，隨后每個(gè)循環(huán)增加兩個(gè)碳合成各種奇數(shù)鏈脂肪酸。Park 等[107]實(shí)驗(yàn)證明了解脂耶氏酵母可以在100 g/L高濃度丙酸鹽作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且可以合成占總脂肪酸35%左右的奇數(shù)鏈脂肪酸。2-甲基檸檬酸脫水酶（PHD1）是一種線粒體蛋白，在檸檬酸甲酯循環(huán)中催化2-甲基檸檬酸轉(zhuǎn)化為2-甲基順式烏頭酸。缺失PHD1會(huì)阻止TCA 循環(huán)并抑制檸檬酸進(jìn)入線粒體從而改善油脂的合成。研究發(fā)現(xiàn)，丙酰輔酶A 可通過(guò)檸檬酸甲酯循環(huán)分解成丙酮酸和琥珀酸，這會(huì)競(jìng)爭(zhēng)奇數(shù)鏈脂肪酸合成途徑，因此，敲除PHD1 后在葡萄糖與丙酸鹽混合培養(yǎng)基中能夠合成占總脂肪酸46.82%的奇數(shù)鏈脂肪酸。Park 等[108]進(jìn)一步成功地在解脂耶氏酵母中構(gòu)建了以葡萄糖為底物從頭合成奇數(shù)鏈脂肪酸的代謝途徑。利用內(nèi)源蘇氨酸合成途徑，在蘇氨酸脫氨酶的作用下，催化蘇氨酸生成α-酮丁酸，然后，丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（PDH）將α-酮丁酸轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A用于奇數(shù)鏈脂肪酸合成。用TEF 啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)蘇氨酸生物合成途徑相關(guān)的7 個(gè)基因，能夠在葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中合成占總脂肪酸3.86%的奇數(shù)鏈脂肪酸。接著，在敲除了POX1-6、脂肪酶（TGL4）、過(guò)表達(dá)二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGA2）和3-磷酸甘油脫氫酶（GPD1）的高產(chǎn)油脂菌株中過(guò)表達(dá)上述基因，進(jìn)一步將奇數(shù)鏈脂肪酸提高至總脂肪酸含量的5.64%。

5.2 脂肪醇

脂肪醇廣泛應(yīng)用于化妝品、表面活性劑、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品和制藥領(lǐng)域。脂肪醇目前主要由石化產(chǎn)品或植物油催化加氫生成，由于過(guò)度依賴(lài)化石原料和占用農(nóng)用耕地，人們開(kāi)始嘗試?yán)梦⑸锖铣芍敬?。該過(guò)程主要涉及兩種代謝途徑：一是將脂肪酰ACP 轉(zhuǎn)化為脂肪醛，然后將其還原為脂肪醇；二是脂酰輔酶A 經(jīng)過(guò)脂酰輔酶A 還原酶（FAR）直接轉(zhuǎn)化為脂肪醇。事實(shí)上，針對(duì)微生物合成脂肪醇，研究者們選用了大腸桿菌和釀酒酵母在內(nèi)的多種宿主[6]。解脂耶氏酵母由于其脂肪酸合成能力較強(qiáng)，被認(rèn)為是合成脂肪醇的最有競(jìng)爭(zhēng)力的宿主。Xu等[39]在解脂耶氏酵母中共表達(dá)Synechococcus elongatus 來(lái)源的脂肪酰ACP 還原酶（SeFAR）和大腸桿菌來(lái)源的醛還原酶（EcAHR），發(fā)現(xiàn)僅能夠積累少于2.5 mg/L 的脂肪醇，可能是因?yàn)榘麅?nèi)脂肪酰ACP不足引起的。通過(guò)在過(guò)表達(dá)Marinobacter aquaeolei來(lái)源的脂酰輔酶A 還原酶（MaQu2220）的基礎(chǔ)上，過(guò)表達(dá)大腸桿菌來(lái)源的脂酰輔酶A 合成酶（EcFadD）以增加前體脂酰輔酶A 的供應(yīng)，能夠合成205.4 mg/L 的脂肪醇，比MaQu2220 的單一過(guò)表達(dá)增加了2.6倍。這表明提高胞內(nèi)的脂酰輔酶A含量能夠?yàn)楹铣芍敬继峁┣绑w。Wang 等[109]采取了三種策略利用脂酰輔酶A還原酶途徑逐步提高了解脂耶氏酵母中脂肪醇產(chǎn)量。首先敲除脂肪醇氧化酶（FAO1）減少脂肪醇的降解，進(jìn)一步過(guò)表達(dá)5 個(gè)拷貝脂酰輔酶A還原酶（FAR）編碼基因，最后敲除DGA1 增加脂酰輔酶A 的供應(yīng)，最終脂肪醇產(chǎn)量提高了63 倍。Zhang 等[110]發(fā)現(xiàn)脂肪醇能夠使糖酵解途徑上調(diào)，于是嘗試?yán)锰墙徒馔緩街胁煌虻膯?dòng)子來(lái)控制FAR 的表達(dá)。在FBAin 啟動(dòng)子的控制下，脂肪醇生產(chǎn)與FBAin 的表達(dá)相互促進(jìn)，在優(yōu)化葡萄糖濃度后脂肪醇產(chǎn)量達(dá)到報(bào)道最高產(chǎn)量5.75 g/L。上述研究中由于選用的FAR 底物特異性寬泛，目標(biāo)產(chǎn)物脂肪醇多是以混合物存在，為了獲得單一組成的脂肪醇，Rutter 等[111]發(fā)現(xiàn)擬南芥來(lái)源的FAR 能夠特異性催化癸酰輔酶A 生產(chǎn)1-癸醇，通過(guò)敲除與過(guò)氧化物酶體合成相關(guān)的編碼基因pex10 進(jìn)一步阻止1-癸醇的氧化，最終產(chǎn)量超過(guò)500 mg/L。另外，Cordova等[112]通過(guò)比較FAR 對(duì)不同鏈長(zhǎng)脂肪酸的特異性，最終選擇Marinobacter hydrocarbonoclasticus VT8 來(lái)源的MhFAR，使解脂耶氏酵母能夠合成亞麻油醇。同樣地，Wang 等[109]也通過(guò)選擇貓頭鷹（Tyto alba）來(lái)源的TaFAR，在解脂耶氏酵母中實(shí)現(xiàn)了十六醇的特異性積累。因此，研究FAR 的特異性能夠幫助人們更好地生產(chǎn)有特定價(jià)值的目標(biāo)脂肪醇產(chǎn)品。

針對(duì)提高解脂耶氏酵母合成特定脂肪酸及其衍生物，除了一些通用的代謝工程策略外，不同的產(chǎn)品均有相應(yīng)獨(dú)特的改造策略（表1）。值得一提的是，一方面脂肪酸類(lèi)產(chǎn)品可通過(guò)增強(qiáng)油脂積累途徑拉動(dòng)其積累至無(wú)毒性的TAG 中以增加產(chǎn)量，另一方面一些脂肪酸衍生物則需要抑制油脂積累途徑以增加相應(yīng)脂肪酸前體的供應(yīng)。因此，在未來(lái)的研究中，應(yīng)權(quán)衡好脂肪酸前體的供應(yīng)和脂肪酸積累成TAG 二者之間的關(guān)系。另外，增加乙酰輔酶A 含量是提高脂肪酸合成的一種通用策略，β-氧化途徑可以降解脂肪酸合成乙酰輔酶A，但這一過(guò)程造成了前體脂肪酸的損失?？梢蕾?lài)pox1-6 基因?qū)Σ煌滈L(zhǎng)脂肪酸的底物特異性，降解非目標(biāo)鏈長(zhǎng)脂肪酸生成乙酰輔酶A 供給目標(biāo)鏈長(zhǎng)脂肪酸及其衍生物的合成。

表1 解脂耶氏酵母合成特定脂肪酸及其衍生物的代謝工程策略Table 1 Metabolic engineering strategies to produce the tailored fatty acids and their derivatives in Yarrowia lipolitica

續(xù)表1

6 結(jié)論與展望

近年來(lái)，脂肪酸及其衍生物被廣泛利用在能源、材料和營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品等領(lǐng)域，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步深度開(kāi)發(fā)利用引起了人們的廣泛關(guān)注。利用微生物合成這些脂肪酸及其衍生物有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，符合可持續(xù)發(fā)展的需求。解脂耶氏酵母作為高產(chǎn)油脂的微生物，是研究最為透徹的非常規(guī)酵母，隨著研究的不斷深入，其遺傳操作工具不斷完善，使其成為生產(chǎn)脂肪酸及其衍生物的優(yōu)越宿主。本文綜述了構(gòu)建解脂耶氏酵母細(xì)胞工廠生產(chǎn)特定脂肪酸及其衍生物的研究進(jìn)展，著重介紹了改造解脂耶氏酵母合成面向能源、材料和營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品的脂肪酸及其衍生物所用的代謝工程策略。這些策略主要包括利用基因敲除或過(guò)表達(dá)的手段理性設(shè)計(jì),如:①過(guò)表達(dá)相關(guān)基因提高乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A等脂肪酸合成前體的供應(yīng)；②基因敲除β-氧化途徑相關(guān)元件減少脂肪酸的胞內(nèi)降解；③通過(guò)基因敲除或過(guò)表達(dá)改造FAS 途徑、脂肪酸延長(zhǎng)去飽和途徑、硫酯酶途徑以控制目標(biāo)產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)和不飽和度。然而，這些傳統(tǒng)的基因敲除和過(guò)表達(dá)等靜態(tài)代謝工程手段，通常會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)負(fù)擔(dān)，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，其局限性逐漸顯現(xiàn)。能夠時(shí)空特異性響應(yīng)細(xì)胞環(huán)境變化的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，已成為平衡細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的有力武器。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，未來(lái)可通過(guò)基于新型誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、響應(yīng)中間代謝物的生物傳感器等動(dòng)態(tài)調(diào)控的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，為防止過(guò)多的基因工程改造帶來(lái)的代謝負(fù)擔(dān)而驅(qū)使細(xì)胞逃避選擇壓力以恢復(fù)細(xì)胞生長(zhǎng)，可通過(guò)代謝成癮策略將細(xì)胞的生長(zhǎng)必需基因與目標(biāo)產(chǎn)品合成途徑進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以富集并獎(jiǎng)勵(lì)積極生產(chǎn)的細(xì)胞，從而更好地為生產(chǎn)服務(wù)。最后，除了針對(duì)細(xì)胞代謝的理性設(shè)計(jì)外，還可通過(guò)非理性設(shè)計(jì)尋找并驗(yàn)證新的基因靶標(biāo)，不斷優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物的合成能力。這些策略可以更好地指導(dǎo)構(gòu)建解脂耶氏酵母細(xì)胞工廠以生產(chǎn)特定脂肪酸及其衍生物，加快其工業(yè)化進(jìn)程。