于富強，杜健軍，2，路楊，馬賀，樊江莉，2，孫文，2，龍颯然，2，彭孝軍

（1 大連理工大學精細化工國家重點實驗室，遼寧大連116024； 2 大連理工大學寧波研究院，浙江寧波315016）

引 言

光動力治療，作為一種新型腫瘤治療方法，可與傳統(tǒng)治療方法(如化療、放療和手術(shù))優(yōu)勢互補實現(xiàn)協(xié)同治療腫瘤的效果。光動力治療主要是利用光敏劑在光照條件下通過能量或電子轉(zhuǎn)移等方式與周圍氧氣、溶劑等小分子反應(yīng)產(chǎn)生有毒的活性氧物種(reactive oxygen species,ROS)，從而殺死腫瘤細胞。由于腫瘤細胞的惡性繁殖，大量消耗氧氣，實體腫瘤內(nèi)部的乏氧環(huán)境嚴重影響了光動力治療、化療及放療的治療效果[1-2]。同為光療策略，光熱治療的原理是基于小分子的光熱轉(zhuǎn)換能力，將光能轉(zhuǎn)化為熱能，通過提升局部微環(huán)境的溫度殺死腫瘤細胞[3]。由于光熱治療不依賴于氧氣，且同為光激發(fā)治療方法，因此常和光動力治療聯(lián)合使用[4]。目前，各類無機或無機-有機雜化材料被開發(fā)用于光動力-光熱聯(lián)合治療[5-7]，如金納米粒子[8]、碳納米管[9]、二氧化鈦[10]等。但上述無機材料的生物相容性及其生物代謝成為阻礙其臨床應(yīng)用的障礙。然而，多數(shù)文獻中報道的光療小分子大多只具備單一的光熱治療或光動力治療能力[3]。近期，研究發(fā)現(xiàn)Cy7菁染料同時具備光動力與光熱治療效果，但其光、熱穩(wěn)定性需要極大提升以滿足臨床應(yīng)用[11]。因此，開發(fā)具有良好生物相容性及光熱穩(wěn)定性的功能染料分子是實現(xiàn)光熱-光動力聯(lián)合治療的有效途徑。

酞菁類化合物具有吸收波長長(λmax＞660 nm)、消光系數(shù)高(εmax＞105L·mol-1·cm-1)、穩(wěn)定性好等特點，被廣泛應(yīng)用于太陽能電池、傳感器和催化等領(lǐng)域[12]。研究發(fā)現(xiàn)，鋅酞菁可以作為一種光敏劑，用于光動力治療[13-15]。Li 等[16]報道了通過超分子自組裝的方法，即直接用抗癌藥物米托蒽醌和鋅酞菁光敏劑組裝成納米結(jié)構(gòu)，該納米結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出核酸響應(yīng)分解的能力，能夠用于腫瘤成像，并顯著提高了抗癌效果。Li等[17]報道了銅酞菁(CuPc)可用于光熱治療，可有效地避免因腫瘤缺氧而導(dǎo)致治療效果下降的情況。Jiang等[18]報道了石墨烯作為CuPc的載體，有效增加了其光熱治療效果。藥物輸送系統(tǒng)能夠有效地增加循環(huán)時間并且能夠在病變部位釋放藥物[19-21]，不僅可以應(yīng)用于化療藥物[22-23]、基因藥物的輸送[24]，還適用于光熱治療[25]與光動力治療[26-27]試劑的輸送。血清白蛋白是血液中最主要的轉(zhuǎn)運蛋白之一，在血液循環(huán)中具有良好的穩(wěn)定性，是構(gòu)建納米藥物輸送系統(tǒng)最合適的原料之一[28]。小分子藥物與蛋白質(zhì)相互作用時一般存在以下幾種作用力：(1)小分子藥物進入血清白蛋白質(zhì)大分子的空腔中，藥物的疏水基團與血清白蛋白質(zhì)疏水空腔的疏水作用；(2)藥物與血清白蛋白超分子化合物形成過程中產(chǎn)生的氫鍵作用和范德華力；(3)藥物所帶的電荷與血清白蛋白所含電荷存在靜電作用[29]。血清白蛋白不但可以增加體系的生物相容性，還可以有效地攜帶藥物穿透細胞膜到達細胞質(zhì)，作用于細胞核或各種亞細胞器[30-31]。線粒體是細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS 的主要來源，在基因表達、細胞凋亡、細胞氧化應(yīng)激等細胞活動中都有著重要的調(diào)控作用?；蛲蛔?、代謝異常等會引起線粒體功能障礙從而導(dǎo)致ROS 的聚集，進而使線粒體結(jié)構(gòu)損傷、代謝異常，進而促進細胞死亡。腫瘤細胞具有快速增殖的特點，致癌基因的活化會使線粒體為其代謝活動提供足夠的能量。靶向線粒體的治療策略會影響線粒體的相關(guān)代謝活動，進而對細胞造成損傷[32]。

圖1 用于線粒體靶向光療的血清白蛋白-銅酞菁(LGSCuPc-BSA)納米粒子的制備及光療過程Fig.1 Schematic illustration of preparation of LGS-CuPc-BSA NPs for mitochondrial targeted phototherapy

綜上，如圖1，本文利用牛血清白蛋白(BSA)與β位磺酸二取代的銅酞菁染料直接藍86(LGS-CuPc)自組裝，制備了LGS-CuPc-BSA 納米粒子。結(jié)果表明，在671 nm 光源激發(fā)下，LGS-CuPc-BSA 表現(xiàn)出明顯光動力效果，其ROS 產(chǎn)率約為23.3%；同時，LGS-CuPc-BSA 展現(xiàn)出其固有光熱治療效果(光熱轉(zhuǎn)換效率為36.8%)。測試結(jié)果表明，BSA 不僅能夠增加體系的生物相容性，還可以提升光熱效果以及增加ROS 產(chǎn)率。經(jīng)BSA 負載的LGS-CuPc 納米粒子具有很好的穩(wěn)定性和較低的生物毒性，能夠穿透細胞膜定位于腫瘤細胞線粒體，為光動力-光熱聯(lián)合靶向治療腫瘤提供了一種有效的方法。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

牛血清白蛋白(BSA)；直接藍86(LGS-CuPc，C.I.Direct Blue86，購于上海染料研究所有限公司，結(jié)構(gòu)如圖A1)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)；1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)；亞甲基藍(MB)；鋅酞菁(ZnPc)；培養(yǎng)基(DMEM)；消化酶(EDTA)；噻唑藍(MTT)；鈣黃素(AM)；碘 化 丙 啶(PI)；Mito-Tracker Green；ROS 試 劑 盒(DCFH-DA); Hoechst33324；無水甲醇；實驗所用的去離子水均來自milli-Q 系統(tǒng)。人乳腺癌細胞(MCF-7)從中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所(IBMS)購買。

1.2 分析測試儀器

Cary60紫外可見分光光度計(美國Aglien公司)；HT7700 EXALENS 透射電子顯微鏡(日本日立公司)；ZS90 型納米粒徑/Zeta 電位分析儀；FV1000-IX81 共 聚 焦 熒 光 顯 微 鏡(日 本Olympus 公 司)；Thermo VarioskanTMLUX 多功能酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司)；小動物活體成像系統(tǒng)(NightOWL ⅡLB983)。

1.3 LGS-CuPc-BSA NPs的制備

將2 mg 的LGS- CuPc 分散在1 ml 甲醇中，將LGS-CuPc 甲醇溶液(1 ml)與BSA(30 mg)水溶液(11 ml)室溫攪拌12 h，然后用透析法透析除去游離的染料分子，離心后冷凍干燥得到LGS-CuPc-BSA 納米粒子。

1.4 LGS-CuPc-BSA NPs的表征

采用紫外-可見分光光度計進行吸收測試，使用透射電子顯微鏡對納米粒子進行形貌分析以及粒徑檢測，采用納米粒徑/Zeta 電位分析儀進行粒徑大小和電位測試以及穩(wěn)定性測試。

1.5 LGS-CuPc-BSA NPs 的包封率以及載藥率的測定

首先測定不同濃度LGS-CuPc在DMF中的標準吸收曲線，將5 μg LGS-CuPc-BSA NPs 分散在10 ml含有1 mg·ml-1胰蛋白酶溶液，37℃攪拌過夜。上層清液過濾，用紫外可見分光光度法測定在671 nm 處的吸光度，通過標準吸收曲線計算濾液的濃度C0，載藥率和包封率計算如式(1)～式(2)[33-34]：

式中，C是LGS-CuPc濃度，μg·ml-1；C0是濾液中LGS-CuPc 濃度，μg·ml-1；V 是溶液體積，ml；MCuPc是LGS-CuPc總質(zhì)量，μg；MBSA是BSA總質(zhì)量，μg。

1.6 活性氧的檢測

采用活性氧響應(yīng)探針DPBF 評價LGS-CuPc-BSA NPs 的ROS 生成能力，MB 作為標準光敏劑，在DMF 中ROS 產(chǎn)率為0.52。將DPBF(30 μmol·L-1)與含LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs DMF 溶 液 混合，混合溶液在波長671 nm 光功率密度為2 mW·cm-2光照射每10 s 一次，在照射過程中記錄不同時間的吸收變化。此外，還記錄了DPBF 和LGS-CuPc以及LGS-CuPc-BSA NPs 溶液的吸收光譜變化。LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs 的ROS 產(chǎn)率ΦΔ計算公式如式(3)[35]：

式中，Φ 是單線態(tài)量子產(chǎn)率；K 是DPBF 隨時間增加吸光度值逐漸減小的斜率；F 是吸光度校正因子(F=1～10-OD，OD 為光敏劑的吸光度值)；下角標MB是標準光敏劑；PS是待測染料。

1.7 光熱轉(zhuǎn)換效率測試

用熱紅外攝像機實時記錄樣品的熱成像。LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs 在PBS 中的濃度分別為20、30 和40 μmol·L-1，以PBS 作為對比，采用波長671 nm，功率為800 mW·cm-2的激光照射每1 min 記錄實時溫度，觀察溫度變化，共照射10 min。為評價LGS-CuPc-BSA NPs 的光熱穩(wěn)定性，記錄100 min 對應(yīng)的溫度變化，每個循環(huán)20 min，共五個循環(huán)，利用式(4)～式(6)計算光熱轉(zhuǎn)換效率：

式中，η 是光熱轉(zhuǎn)換效率；h 是傳熱系數(shù)；s 是容器光輻射表面積；Tmax是系統(tǒng)最高溫度，℃；Tsurr是環(huán)境溫度，℃；QDis是石英樣品池與水系統(tǒng)內(nèi)部產(chǎn)生的基準能量，W；τ 是系統(tǒng)內(nèi)時間常量；I 是光照功率，W·cm-2；m 是 溶 液 質(zhì) 量，g；C 是 溶 液 比 熱 容，J·g-1·℃-1；Tmax,water是水的最高溫度，℃；Tsurr,water是水的環(huán)境溫度，℃；A671是溶液在671 nm波長處的吸光度。

1.8 MTT法測定細胞毒性實驗

將接種MCF-7 細胞(100 μl，1×105個/毫升)的96孔細胞培養(yǎng)板置于5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h。用含有不同濃度染料的培養(yǎng)基替換，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用激光(800 mW·cm-2)照射10 min 后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含有5 mg·ml-1MTT (100 μl)的培養(yǎng)基替換并繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在觀察到有大量藍紫色的結(jié)晶生成后移走培養(yǎng)基，加入100 μl DMSO 后輕輕搖晃，用酶標儀分別檢測570 nm和630 nm的吸光度值，依據(jù)式(7)計算細胞活性[36-37]：

式中，ODdye是染料分子孔的吸光度值；ODKdye是染料分子孔的空白吸光度值；ODblank是對照孔的吸光度值；ODKblank是對照孔空白吸光度值。

1.9 活死細胞染色成像實驗

Calcein AM/PI 雙染試劑盒可以實現(xiàn)多活死細胞的標記。將MCF-7 細胞在含2 ml 培養(yǎng)基的共聚焦皿中于37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h 后，800 mW·cm-2的激光照射10 min，同時加入2 μl Calcein AM 和PI 對細胞進行染色處理30 min，在共聚焦顯微鏡下觀察熒光。

1.10 細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生成像實驗

取100 μl 的MCF-7 細胞(1×105個/毫升)在含2 ml 培養(yǎng)基的共聚焦皿中培養(yǎng)24 h(37℃，5%CO2)，隨后加入負載熒光染料的LGS-CuPc-BSA NPs，孵育1 h。PBS 清洗3 次后加入2 ml 含有10 μmol·L-1的DCFH-DA 培養(yǎng)基溶液，孵育30 min 后，用PBS 清洗3 次，加入2 ml 培養(yǎng)基，再用671 nm 的激光照射10 min后進行共聚焦成像。

1.11 細胞核染色

取100 μl 的MCF-7 細胞(1×105個/毫升)在含2 ml培養(yǎng)基的共聚焦皿中在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h 后，加入負載熒光染料的LGS-CuPc-BSA NPs(10 μmol·L-1)，孵育1 h 后用Hoechst33342 進行細胞標記，孵育10 min 后用PBS 清洗3 次后加入2 ml 培養(yǎng)基，最后進行共聚焦成像。

1.12 線粒體共定位成像

取100 μl 的MCF-7 細胞(1×105個/毫升)在含2 ml 培養(yǎng)基的共聚焦皿中在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h 后，加入負載熒光染料的LGS-CuPc-BSA NPs，孵育1 h，之后選用商業(yè)化染料(Mito-Tracker Green，λex=488 nm，λem=510～560 nm)孵育30 min 后，用PBS清洗3 遍，加入新鮮的培養(yǎng)基。共聚焦進行成像觀察，并且記錄熒光通道圖像，并進行疊加檢測納米粒子的定位。

1.13 體內(nèi)熒光成像

Balb/c 雌性小鼠(雌6 周齡左右)購自大連醫(yī)科大學SPF 實驗動物中心，動物實驗是根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院出版的《實驗動物護理和使用指南》進行的，該動物實驗得到了大連理工大學動物倫理委員會的批準。

將5×106個/毫升細胞PBS 懸液進行皮下注射，7 d后進行體內(nèi)熒光成像。由于LGS-CuPc 沒有熒光，引入亞甲基藍(MB)構(gòu)建LGS-CuPc/MB-BSA NPs；另一方面，采用具有熒光信號的ZnPc 代替CuPc。通過腫瘤小鼠尾靜脈注射50 μl PBS配制的藥物，使用小動物成像儀進行不同時間的體內(nèi)熒光成像，采用665 nm激發(fā)激光和700 nm發(fā)射濾光片。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 LGS-BSA-CuPc NPs的表征

對LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs 進行了紫外-可見吸收光譜的測試，如圖2(a)所示，CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs 的最大吸收波長均為671 nm。BSA 的透射電鏡圖如圖A2所示，并沒有形成明確的納米結(jié)構(gòu)。LGS-CuPc 通過疏水作用、范德華力以及靜電作用與BSA 相結(jié)合[38-39]，如圖2(b)所示，LGSCuPc-BSA 體系呈現(xiàn)均勻分散的球形結(jié)構(gòu)(粒徑約55 nm)，證明LGS-CuPc與BSA自組裝形成了球形納米粒子。動態(tài)光散射(DLS)結(jié)果顯示LGS-CuPc-BSA NPs 的平均粒徑約為60 nm(圖A3)，這是由于LGS-CuPc-BSA NPs 與溶劑層結(jié)合的水化粒徑略大于TEM 測量的結(jié)果[40]。LGS-CuPc-BSA NPs 的zeta電位約為-9.8 mV，表面帶負電荷和較小的粒徑能夠使其增強通透性和在腫瘤部位積聚滯留的效應(yīng)(圖A4)[41]。如圖A5 所示，制備的LGS-CuPc-BSA NPs 具有良好的穩(wěn)定性，從而可以延長納米顆粒的循環(huán)時間。

圖2 LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs的吸收光譜(a)和LGS-CuPc-BSA NPs的透射電鏡圖(b)Fig.2 UV-vis absorption spectra of LGS-CuPc and LGS-CuPc-BSA NPs(a)and TEM image of LGS-CuPc-BSA NPs(b)

2.2 LGS-CuPc-BSA NPs載藥率與包封率的計算

LGS-CuPc-BSA NPs 的制備是將BSA 與LGSCuPc 混合，然后在純水中透析去除游離的LGSCuPc，離心后冷凍干燥后得到納米粒子?；贚GS-CuPc在671 nm處的標準曲線(圖A6，圖A7)，通過式(1)、式(2)計算LGS-CuPc-BSA NPs中LGS-CuPc的加載率為90.5%，包封率為5.8%。

2.3 LGS-CuPc與LGS-CuPc-BSA NPs 的光致活性氧產(chǎn)率的檢測

以亞甲基藍為參比，將DPBF(30 μmol·L-1)與LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs 溶液分別混合，使用波長671 nm(2 mW·cm-2)的光照射。其中，亞甲基藍樣品每5 s 照射一次[圖3(a)]，LGS-CuPc-BSA NPs[圖3(b)]和LGS-CuPc[圖3(c)]每10 s 照射一次，DPBF在410 nm 處的吸光度隨時間增加而不斷下降，表明LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs 產(chǎn)生了ROS。通過式(3)計算，LGS-CuPc 的ROS 產(chǎn)率為18.5%，LGSCuPc-BSA NPs 為23.3%[圖3(d)]。LGS-CuPc 會以二聚體或多聚體的形式存在，導(dǎo)致其吸光程度減弱，進而降低了ROS 的產(chǎn)率，而BSA 可以使其LGSCuPc 均勻分散，進而增強對光的吸收，從而增加ROS 產(chǎn)率[17]。此外，帶有磺酸基的LGS-CuPc 與BSA的胺基的相互作用，導(dǎo)致系間竄躍效率增加，有利于ROS的產(chǎn)生[42]。

2.4 光熱轉(zhuǎn)換效率測試

為了測定LGS-CuPc-BSA NPs 的光熱轉(zhuǎn)換效率，用波長671 nm(800 mW·cm-2)激光照射10 min。如圖4(a)所示，和PBS 對比溶液比較，不同濃度的LGS-CuPc 溶液溫度升高明顯，表明LGS-CuPc 可以快速將近紅外光有效地轉(zhuǎn)換為熱能。如圖4(b)所示，在相同濃度的條件下，LGS-CuPc-BSA NPs 比LGS-CuPc 的溫度平均升高2℃左右，這是由于單純的LGS-CuPc 部分會以二聚體或多聚體的形式存在，導(dǎo)致其吸光程度有所減弱，進而降低了光熱轉(zhuǎn)換效果；而BSA 的加入會使其分散均勻，展現(xiàn)良好的光熱效果[17]。如圖4(c)所示，LGS-CuPc-BSA NPs在5次循環(huán)周期下還具有很好的光熱穩(wěn)定性。通過式(4)～式(6)和圖4(d)計算其光熱轉(zhuǎn)換效率為36.8%，高于文獻中已報道的無機納米結(jié)構(gòu)[43]，如Cu2-xSe(22%)和Cu3BiS3(27.4%)等[44]。因此，LGS-CuPc-BSA NPs的高光熱性能和優(yōu)異的光穩(wěn)定性使其可以作為治療癌癥的光熱試劑。

2.5 LGS-CuPc與LGS-CuPc-BSA NPs 的細胞毒性研究

選用MCF-7細胞作為研究對象，采用相同濃度梯度的LGS-CuPc 與LGS-CuPc-BSA NPs 進行細胞毒性評價，測試結(jié)果如圖5(a)、(b)所示，在不同濃度(0～32 μmol·L-1)的LGS-CuPc-BSA NPs 與LGS-CuPc孵育下，細胞沒有表現(xiàn)出明顯的毒性(細胞存活率＞90%)。經(jīng)波長671 nm，功率為800 mW·cm-2光照射10 min后，LGS-CuPc-BSA NPs 與LGS-CuPc 對細胞都造成了明顯的殺傷，且LGS-CuPc-BSA NPs 對細胞損傷的效果明顯優(yōu)于LGS-CuPc。通過鈣黃素(calcein-AM，綠色)和碘化丙啶(PI，紅色)的細胞染色實驗結(jié)果進一步證實了光照后細胞的凋亡。如圖6所示，LGS-CuPc 組細胞在未經(jīng)激光照射時細胞正常存活，而經(jīng)激光照射后的細胞則表現(xiàn)出紅色熒光和部分綠色熒光，說明部分細胞死亡。LGS-CuPc-BSA NPs組細胞在未經(jīng)激光照射時細胞幾乎未死亡(綠色熒光)；而經(jīng)激光照射后，視野內(nèi)細胞均表現(xiàn)出均勻的紅色熒光，證明細胞完全死亡，表明LGSCuPc與BSA 自組裝后能夠顯著地提升其治療效果，與MTT實驗結(jié)果一致。

圖3 在DMF中DPBF檢測MB(a)、LGS-CuPc(b)、LGS-CuPc-BSA NPs(c)體系ROS的產(chǎn)生；MB、LGS-CuPc和LGS-CuPc-BSA NPs的時間與吸收的線性關(guān)系(d)Fig.3 Singlet-oxygen generation of MB(a),LGS-CuPc(b),LGS-CuPc-BSA NPs(c)in DMF with DPBF,and the linear relationship between time and absorption of MB,LGS-CuPc,and LGS-CuPc-BSA NPs(d)

2.6 細胞內(nèi)活性氧熒光成像

為了驗證LGS-CuPc-BSA NPs 的光動力治療機理，使用DCFH-DA(商業(yè)化的ROS 捕獲劑)，跟蹤光動力治療過程中的ROS 產(chǎn)生。如圖7 所示，在671 nm 光照射下，發(fā)現(xiàn)DCF 有強烈的熒光，表明LGSCuPc-BSA NPs作為一種有效的光敏劑，在光的照射下能在細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS。

2.7 細胞核染色與線粒體共定位成像

將近紅外熒光染料共同負載于LGS-CuPc-BSA NPs中，在MCF-7細胞中培養(yǎng)2 h。共聚焦成像如圖8所示，LGS-CuPc-BSA NPs的熒光主要分布于細胞的細胞質(zhì)，表明納米粒子有著良好的生物相容性和快速進入細胞的能力，并且發(fā)現(xiàn)納米粒子不定位于細胞核。

線粒體是細胞生產(chǎn)ATP 的主要場所，一旦線粒體遭到破壞將導(dǎo)致整個細胞的凋亡[45-48]。為了驗證LGS-CuPc-BSA NPs 的定位能力，選取商業(yè)化染料Mito-Tracker Green 與LGS-CuPc-BSA NPs 在MCF-7 細胞中共同孵育。如圖9 所示，綠色通道采集到的Mito-Tracker Green 染料信號與紅色通道LGSCuPc-BSA NPs的熒光信號有很好的疊加，共定位系數(shù)為0.86，表明LGS-CuPc-BSA NPs 進入細胞后主要分布于細胞的線粒體中。由細胞熒光成像和線粒體共定位成像表明BSA 能夠有效地提升LGSCuPc 的生物相容性和促進其穿透細胞膜的能力，并靶向線粒體中，經(jīng)光激發(fā)破壞線粒體進而使整個細胞凋亡。

圖4 光照(671 nm，800 mW·cm-2)不同濃度的LGS-CuPc(a)和LGS-CuPc-BSA NPs(b)的光熱曲線溫度變化，LGS-CuPc-BSA NPs五個循環(huán)的溫度變化(每個循環(huán)20 min)(c)和τ值的計算曲線(d)Fig.4 Photothermal heating curves for the change of temperature with time in different concentrations (20,30,and 40 μmol·L-1)of LGS-CuPc(a),LGS-CuPc-BSA NPs irradiated by 671 nm laser(800 mW·cm-2)(b).The temperature variations of LGS-CuPc-BSA NPs for 5 cycles(20 min per cycle)(c).Calculation of τ value(d)

圖5 在671 nm(800 mW·cm-2)激光照射10 min下經(jīng)不同濃度的LGS-CuPc-BSA NPs(a)和LGS-CuPc(b)處理的細胞活性Fig.5 Cell viabilities after treatments with different concentrations of LGS-CuPc-BSA NPs (a)and LGS-CuPc(b)with and without 671 nm(800 mW·cm-2)laser irradiation for 10 min

圖7 在MCF-7細胞中ROS的產(chǎn)生Fig.7 ROS generation in MCF-7 cells

2.8 小鼠體內(nèi)熒光成像

靜脈給藥后隨著時間的延長(圖A8)，LGSCuPc/MB-BSA NPs 在腫瘤部位的富集逐漸提高，且熒光強度在24 h 達到最大，隨后逐漸減少，在72 h后依然有少量富集，說明LGS-CuPc-BSA NPs 在小鼠體內(nèi)具有很好的靶向效果及保留效率。相反，ZnPc(代替CuPc)在4 h腫瘤處的熒光強度達到最大，24 h后只有少量保留。同時小鼠不同器官有大量的染料分子富集，說明染料分子的靶向效果與保留效率不足，且在小鼠體內(nèi)的循環(huán)時間明顯短于納米粒子的循環(huán)時間。

3 結(jié) 論

(1)通過LGS-CuPc 和BSA 自組裝構(gòu)建得到LGS-CuPc-BSA NPs 納米顆粒，LGS-CuPc-BSA NPs在PBS緩沖溶液中分布均勻，平均粒徑約為60 nm。

(2)實驗證明LGS-CuPc-BSA NPs 具有光動力和光熱治療效果，且LGS-CuPc-BSA 的ROS 產(chǎn)率和光熱效果均高于LGS-CuPc。這是由于BSA 的加入可以抑制LGS-CuPc 自身的聚集，從而增加對光的吸收程度及利用。

(3)細胞實驗表明LGS-CuPc-BSA NPs 具有較低的細胞毒性和良好的光療效果，并且在體內(nèi)循環(huán)時間可以達到72 h。共定位實驗證明該納米粒子能夠穿透細胞膜并且定位于細胞線粒體中，通過使線粒體凋亡進而促進癌細胞凋亡。

圖8 Hoechst33342和LGS-CuPc-BSA NPs在MCF-7細胞中的熒光共聚焦成像Fig.8 Confocal fluorescence images of Hoechst33342 and LGS-CuPc-BSA NPs in MCF-7 cells

圖9 LGS-CuPc-BSA NPs與Mito-Tracker Green共定位成像Fig.9 Co-localization imaging of LGS-CuPc-BSA NPs and Mito-Tracker Green in MCF-7 cells

(4)提供了一種光動與光熱聯(lián)合治療的方法，為腫瘤治療提供了一種有應(yīng)用前景的光療染料。