榮 譽(yù)，郭東新，田 河

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，沈陽(yáng)100032；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng)110161）

近20 年來(lái)，干細(xì)胞生物學(xué)受到廣泛關(guān)注，人們對(duì)干細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)有了更深入的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也探索了將其應(yīng)用在不同領(lǐng)域的潛力[1-2]。 干細(xì)胞已經(jīng)用于治療人類血液系統(tǒng)疾病和皮膚再生，但在人類其他疾病的應(yīng)用還處于探索階段[3-4]。在獸醫(yī)領(lǐng)域，大量的動(dòng)物試驗(yàn)為細(xì)胞療法在多種疾病治療作用的評(píng)估提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[5-6]。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是由早期中胚層發(fā)育而來(lái)的非造血成體干細(xì)胞，該細(xì)胞在體外可以貼壁生長(zhǎng)，并呈現(xiàn)梭型[7]。 在適當(dāng)條件下可以大量擴(kuò)增，并轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)祖細(xì)胞，進(jìn)而分化成各種組織細(xì)胞，如脂肪、骨、成纖維細(xì)胞等。 羊膜是胎膜最內(nèi)層，是由羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞組成的，許多研究已經(jīng)證實(shí)這兩種細(xì)胞都具有干細(xì)胞特征。 胎盤在胎兒出生后常被丟棄，而動(dòng)物在分娩后會(huì)吃掉胎盤，可以說(shuō)胎盤是在胎兒產(chǎn)出后的廢棄物。 SCHERJON 等[8]從羊膜培養(yǎng)、擴(kuò)增出間充質(zhì)干細(xì)胞，并誘導(dǎo)分化，表達(dá)了脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的表型，證實(shí)了其干細(xì)胞特性。 羊膜來(lái)源廣泛，取材方便，并且無(wú)倫理學(xué)限制，與其他間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源組織相比，具有無(wú)可比擬的優(yōu)越性[9]。 本研究以人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)研究為基礎(chǔ)，分離培養(yǎng)兔羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，研究其基本生長(zhǎng)特點(diǎn)，鑒定其干細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，以期為獸醫(yī)領(lǐng)域提供新的干細(xì)胞來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2 只2 歲齡清潔級(jí)雌性待產(chǎn)新西蘭大白兔，由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院提供。動(dòng)物處理符合機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物使用指南。

1.2 試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)液、DPBS 緩沖液、LG-DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA、二甲基亞砜（DMSO）、Ⅰ型膠原酶、雙抗，均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；山羊血清，購(gòu)自中國(guó)北京市博奧森生物技術(shù)有限公司；臺(tái)盼藍(lán)染色液、4%多聚甲醛固定液， 購(gòu)自中國(guó)北京市索萊寶科技有限公司；PE-CD29、PE-CD34、PE-CD49d、PECD73、FITC-CD45、FITC-HLA-DR，均購(gòu)自美國(guó)BD 公司；地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、吲哚美辛、β-甘油磷酸鈉、牛血清白蛋白、茜素紅、油紅O、DAPI，均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；堿性磷酸酶顯色試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

全自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本TOMY 公司）、微量移液器（德國(guó)Eppendorf 公司）、超凈工作臺(tái)（中國(guó)江蘇省蘇凈集團(tuán)有限公司）、二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）、電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）、冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）、普通電冰箱（0～4℃）（中國(guó)青島市海爾股份有限公司）、超低溫電冰箱（日文SANYO 公司）、電熱恒溫水浴鍋（中國(guó)北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司）、倒置相差顯微鏡（日本Olympus 有限公司）、激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica 公）、流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司），以及培養(yǎng)皿、離心管、培養(yǎng)板、凍存管（美國(guó)Corning 公司）。

1.4 方法

1.4.1 rAMSCs 的分離培養(yǎng) 參考人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方式，將待產(chǎn)母兔用丙泊酚誘導(dǎo)麻醉后，再使用異氟烷氣體維持麻醉，通過(guò)剖腹產(chǎn)手術(shù)取出胎兒并獲取兔胎盤組織，放入含雙抗的無(wú)菌生理鹽水瓶中保存并運(yùn)送至試驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)中用下機(jī)械剝離羊膜層與絨毛膜層，其中透明且沒(méi)有血管的一層為羊膜。將剝離下的羊膜放入無(wú)菌生理鹽水中清洗數(shù)次，再使用DPBS 清洗3 次。 使用眼科鑷子與剪刀將羊膜組織剪碎，移入50mL 離心管中，每管加入5mL 羊膜組織，等待進(jìn)一步處理。接下來(lái)分兩步對(duì)收集的羊膜進(jìn)行處理：首先去除羊膜上的單層上皮，向離心管中加入5mL 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA，放入37℃水浴鍋中消化30min，然后加入10mL 含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液終止消化，1500r·min-1離心5min 棄去上清， 使用DPBS 重懸后再次離心，重復(fù)操作2 次對(duì)羊膜進(jìn)行清洗以除去消化掉的上皮細(xì)胞；然后，向經(jīng)過(guò)清洗的羊膜組織中加入5mL 含有1mg·mL-1的Ⅰ型膠原酶，37℃水浴鍋中消化60min，然后加入10mL 含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液終止消化，消化液經(jīng)過(guò)細(xì)胞篩過(guò)濾后移入10mL 離心管，1500r·min-1離心5min 后棄去上清，細(xì)胞沉淀經(jīng)DMEM/F12 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100U·mL-1青霉素和100μg·mL-1鏈霉素）重懸后接種到培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔2d 換液，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.4.2 rAMSCs 的傳代培養(yǎng) 當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞的匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，棄掉舊培養(yǎng)液，使用DPBS 清洗細(xì)胞2 遍，加入2.5mL 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA，放入37℃培養(yǎng)箱中消化2min，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)大部分細(xì)胞收縮為圓形并漂浮起來(lái)后，加入5mL 含有10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)輕柔吹打使培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞全部漂浮于培養(yǎng)液中。將細(xì)胞懸液移入10mL 離心管中，1500r·min-1離心5min 后棄去上清，細(xì)胞沉淀經(jīng)DMEM/F12 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100U·mL-1青霉素和100μg·mL-1鏈霉素）重懸后接種到培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔2d 換液，當(dāng)細(xì)胞的匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)再次傳代培養(yǎng)。

1.4.3 rAMSCs 的生長(zhǎng)曲線測(cè)定 取生長(zhǎng)良好的P3 和P10 代rAMSCs，棄掉舊培養(yǎng)液，使用DPBS 清洗細(xì)胞2遍，加入2.5mL 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA，放入37℃培養(yǎng)箱中消化2min，然后在顯微鏡下觀察，當(dāng)大部分細(xì)胞收縮為圓形并漂浮起來(lái)后，加入5mL 含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)輕柔吹打使培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞全部漂浮于培養(yǎng)液中，再將細(xì)胞懸液移入10mL 離心管中，1500r·min-1離心5min 后棄上清，加入DMEM/F12 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100U·mL-1青霉素和100μg·mL-1鏈霉素）重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度后接種在24 孔板中，每孔3×104個(gè)細(xì)胞，每隔2d 換液。從第2 天起，每隔1d 隨機(jī)選取3 孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并求3 個(gè)孔的平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)8d。 以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4.4 rAMSCs 的凍存 取生長(zhǎng)良好的P3 代rAMSCs，棄掉舊培養(yǎng)液，使用DPBS 清洗細(xì)胞2 遍，加入2.5mL 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA，放入37℃培養(yǎng)箱中消化2min，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)大部分細(xì)胞收縮為圓形并漂浮起來(lái)后，加入5mL 含有10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)輕柔吹打使培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞全部漂浮于培養(yǎng)液中。將細(xì)胞懸液移入10mL 離心管中，1500r·min-1離心5min 后棄去上清，每個(gè)離心管中加入1mL 提前預(yù)冷的凍存液（含有450μL DMEM/F12 培養(yǎng)液、500μL 胎牛血清和50μL DMSO）重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入凍存管中，標(biāo)記好細(xì)胞名稱、凍存時(shí)間和操作人。 立即將裝有細(xì)胞的凍存管依次置于4℃冰箱30min，-20℃冰箱2h，-80℃冰箱過(guò)夜。 第2 天將這些凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。

1.4.5 rAMSCs 的復(fù)蘇 取保存在液氮罐中的凍存管，放入提前預(yù)熱好的37℃水浴鍋中，快速搖晃凍存管使其解凍，當(dāng)凍存管中還存在一粒小冰塊時(shí)，使用75%酒精對(duì)凍存管外部消毒后移入超凈工作臺(tái)。 用移液器將凍存管中的細(xì)胞懸液移入10mL 離心管中，1500r·min-1離心5min 后棄去上清，加入DMEM/F12 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100U·mL-1青霉素和100μg·mL-1鏈霉素）重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度后接種在培養(yǎng)皿中，放入37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，1d 后換液。 取復(fù)蘇后的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)·mL-1，將100μL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液與900μL 細(xì)胞懸液混合均勻，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板分別技術(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞復(fù)蘇率。

1.4.6 免疫熒光檢測(cè)OCT4、SOX2 和NANOG 的表達(dá) (1)取生長(zhǎng)良好的P3 代rAMSCs，經(jīng)消化離心并重懸后，接種在放有載玻片的24 孔板中，生長(zhǎng)至60%～70%的匯合度時(shí)，移液器吸去舊的培養(yǎng)液，每孔500μL DPBS 輕柔沖洗3 次，棄去DPBS 后加入500μL 4%多聚甲醛，放入4℃冰箱中過(guò)夜固定；(2)次日棄去固定用的4%多聚甲醛，使用含有2%BSA 的DPBS 輕柔沖洗3 次，加入500μL TritonX-100 于37℃溫箱中通透2h，再使用含有2%BSA 的DPBS 輕柔沖洗3 次；(3) 加入500μL 山羊血清于37℃溫箱中封閉2h， 再使用含有2%BSA 的DPBS輕柔沖洗3 次；(4)分別加入100μL 經(jīng)過(guò)稀釋的OCT4、SOX2 和NANOG 一抗于4℃冰箱過(guò)夜孵育，使用DPBS代替一抗作為陰性對(duì)照；(5)加入含有2% BSA 的DPBS 放在搖床上清洗5min，加入100μL 經(jīng)過(guò)FITC 標(biāo)記的IgG 二抗，于37℃溫箱中避光孵育2h，再使用含有2%BSA 的DPBS 輕柔沖洗3 次；(6)加入100μL DAPI 染液于37℃溫箱中孵育10min；(7)使用含有2%BSA 的DPBS 輕柔沖洗3 次后取出載玻片，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.4.7 流式細(xì)胞技術(shù)鑒定細(xì)胞表型 取生長(zhǎng)良好的P3 代rAMSCs，棄掉舊培養(yǎng)液，使用DPBS 清洗細(xì)胞2 遍，加入2.5mL 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA，放入37℃培養(yǎng)箱中消化2min，加入5mL 含有10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液終止消化。 將細(xì)胞懸液移入10mL 離心管中，1500r·min-1離心5min 后棄去上清，使用DPBS 重懸細(xì)胞沉淀并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×107個(gè)·mL-1；在多支10mL 離心管中加入細(xì)胞懸液100μL，分別加入使用FITC標(biāo)記的CD45, HLA-DR 和PE 標(biāo)記的CD29,CD34,CD49d,CD73 抗體，37℃溫箱孵育30min，然后加入2mL DPBS溶液，混勻后1500r·min-1離心5min 后棄去上清，每管再使用500μL DPBS 重懸，將樣品送入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。 使用DPBS 代替抗體作為對(duì)照，每次檢測(cè)使用10000 個(gè)細(xì)胞，通過(guò)Cell Quest 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4.8 成脂誘導(dǎo)分化 取在6 孔板中培養(yǎng)的生長(zhǎng)良好的P3 代rAMSCs，當(dāng)生長(zhǎng)至80%～90%匯合度時(shí)，棄掉舊培養(yǎng)液，DPBS 清洗2 遍，試驗(yàn)組加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液，對(duì)照組加入LG-DMEM 完全培養(yǎng)液，每3d 換液，共誘導(dǎo)21d。

通過(guò)油紅O 染色鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞中的脂肪滴。 細(xì)胞誘導(dǎo)21d 后，棄去舊的培養(yǎng)液，使用DPBS 輕柔沖洗2遍，4%多聚甲醛提前預(yù)冷后加入6 孔板中，移入4℃冰箱中固定1h，再DPBS 輕柔沖洗3 次，60%異丙醇輕柔沖洗1 次，加入油紅O 染色工作液，室溫染色10min，使用100%異丙醇輕柔沖洗1 次終止染色，再用DPBS 沖洗2 次，通過(guò)倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.4.9 成骨誘導(dǎo)分化 選取在6 孔板中培養(yǎng)的生長(zhǎng)良好的P3 代rAMSCs，當(dāng)生長(zhǎng)至80%～90%匯合度時(shí)，棄掉舊培養(yǎng)液，DPBS 清洗2 遍，試驗(yàn)組加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，對(duì)照組加入LG-DMEM 完全培養(yǎng)液，每3d 換液，共誘導(dǎo)28d。

通過(guò)堿性磷酸酶染色鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞中成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶。 細(xì)胞誘導(dǎo)28d 后，棄去舊的培養(yǎng)液，使用DPBS 輕柔沖洗2 遍，4%多聚甲醛提前預(yù)冷后加入6 孔板中，移入4℃冰箱中固定1h，再DPBS 輕柔沖洗3 次，加入堿性磷酸酶染色液，室溫避光染色20min，使用DPBS 沖洗2 次終止染色，通過(guò)倒置顯微鏡觀察并拍照。

通過(guò)茜素紅染色鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞的鈣鹽沉積。 細(xì)胞誘導(dǎo)28d 后，棄去舊的培養(yǎng)液，使用DPBS 輕柔沖洗2遍，70%乙醇提前預(yù)冷后加入6 孔板中，移入4℃冰箱中固定1h，再DPBS 輕柔沖洗3 次，加入0.1%茜素紅染色液，室溫染色20min，使用DPBS 沖洗2 次終止染色，通過(guò)倒置顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

通過(guò)酶消化法分離獲得的rAMSCs 呈典型的BMSCs 樣，剛接種的細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈大小不等的圓形和細(xì)胞團(tuán)塊（圖1A）；培養(yǎng)24h 后還有大量未貼壁細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中，但已開(kāi)始有部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)多樣；72h 后細(xì)胞開(kāi)始快速增殖，首次全量換液除去未貼壁細(xì)胞，可以觀察到細(xì)胞呈卵圓形、長(zhǎng)梭形和多角形等不規(guī)則形（圖1B）；6～8d 后原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%匯合度，此時(shí)可以傳代培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)多次換液和傳代培養(yǎng)后，雜細(xì)胞逐漸清除，細(xì)胞得到純化，P3代細(xì)胞形態(tài)單一，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形（圖1C）。 P1～P6 代rAMSCs 生長(zhǎng)速度較快，6d 即可鋪滿培養(yǎng)瓶底部， 形態(tài)均一呈長(zhǎng)梭形，P7～P10 代rAMSCs 生長(zhǎng)減緩，8～10d 鋪滿瓶底，P11 代以后，細(xì)胞生長(zhǎng)更加緩慢且形態(tài)扁平不規(guī)則，胞漿內(nèi)有折光性顆粒，并伴有細(xì)胞崩解死亡（圖1D）。

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

P3 代和P10 代rAMSCs 的生長(zhǎng)曲線都呈“S”型（圖2），1～2d 為潛伏期，細(xì)胞生長(zhǎng)平緩，3～6d 為對(duì)數(shù)期，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，7～8d 為平臺(tái)期，生長(zhǎng)趨于平緩，隨后細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入停滯狀態(tài)。 P3 代細(xì)胞增值能力強(qiáng)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，而P10 代細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。

2.3 免疫熒光檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白OCT4、SOX2 和NANOG 的表達(dá)

通過(guò)免疫熒光對(duì)P3 代rAMSCs 檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白OCT4、SOX2 和NANOG 的表達(dá)， 結(jié)果顯示rAMSCs的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，細(xì)胞質(zhì)中存在綠色熒光。 對(duì)照組以DPBS 代替一抗，細(xì)胞質(zhì)中沒(méi)有熒光出現(xiàn)。 說(shuō)明rAMSCs表達(dá)OCT4（99.53%）、SOX2（98.36%）和NANOG（98.87%）蛋白（圖3）。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表型

通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定經(jīng)抗體標(biāo)記的P3 代rAMSCs，結(jié)果顯示，CD34 的表達(dá)率為0.87%；CD45 的表達(dá)率為0.42%；HLA-DR 的表達(dá)率為0.35%；CD29 的表達(dá)率為99.67%；CD49d 的表達(dá)率為99.36%；CD73 的表達(dá)率為99.12%； 以DPBS 代替抗體的對(duì)照組結(jié)果呈陰性表達(dá)（圖4）。 結(jié)果表明，P3 代rAMSCs 低表達(dá)CD34、CD45 和HLA-DR，高表達(dá)CD29、CD49d 和CD73。

圖1 rAMSCs 的細(xì)胞形態(tài)Figure 1 Cell morphology of rAMSCs

2.5 成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果

試驗(yàn)組rAMSCs 細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21d 后，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)槁褕A形或多角形， 細(xì)胞體積增大， 油紅O 染色可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中存在大量磚紅色脂肪滴（圖5A）。對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)始終為長(zhǎng)梭形，油紅O 染色的結(jié)果呈陰性（圖5B）。

2.6 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果

試驗(yàn)組rAMSCs 細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)28d，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形逐漸轉(zhuǎn)變成多角形，部分細(xì)胞出現(xiàn)堆積生長(zhǎng)，出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)塊，堿性磷酸酶染色可將成骨細(xì)胞染成紫色（圖6A），茜素紅染色將沉積的鈣鹽染色成深紅色（圖6B）；對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)始終為長(zhǎng)梭形，堿性磷酸酶染色結(jié)果均為陰性（圖6C）茜素紅染色也未見(jiàn)鈣鹽沉積（圖6）。

圖2 rAMSCs 的生長(zhǎng)曲線Figure 2 Growth curve of rAMSCs

圖3 免疫熒光檢測(cè)OCT4、SOX2 和NANOG 的表達(dá)Figure 3 Expression of OCT4, SOX2 and NANOG on rAMSCs detected by immunofluorescence

圖4 rAMSCs 細(xì)胞表型表達(dá)率Figure 4 Expression of cell surface markers on rAMSCs detected by flow cytometry

圖5 成脂誘導(dǎo)分化Figure 5 Adipogenic differentiation of rAMSCs

圖6 成骨誘導(dǎo)分化Figure 6 Osteogenic differentiation of rAMSCs

3 討論與結(jié)論

MSCs 來(lái)源于組織發(fā)育早期的中胚層與外胚層，是干細(xì)胞的一種，具有多向分化潛能、自我復(fù)制和免疫調(diào)控等特點(diǎn)，在組織工程領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景[10]。 MSCs 主要來(lái)源于骨髓，但是骨髓源MSCs 具有一些缺點(diǎn)：（1）供體年齡越大，細(xì)胞增殖能力下降；（2）采集過(guò)程中可能受到病毒感染；（3）采集過(guò)程較痛苦。這些缺點(diǎn)大大限制了骨髓源MSCs 的發(fā)展。因此，需要尋找新的細(xì)胞來(lái)源[11]。AMSCs 是提取自新鮮羊膜組織的細(xì)胞，同樣具有自我復(fù)制和多向分化潛能，來(lái)源廣泛可塑性高，是組織工程的理想種子細(xì)胞。

胎盤是母親與胎兒之間提供物質(zhì)交換的器官，在妊娠期間可以為胎兒提供必須的各種營(yíng)養(yǎng)和氧氣，胎盤組織從內(nèi)到外依次由羊膜、絨毛膜和底蛻膜3 層膜結(jié)構(gòu)組成，胎盤的羊膜層位于最內(nèi)層，是一層薄而透明的膜，表面光滑，沒(méi)有神經(jīng)、淋巴管和血管分布，由表層的單層上皮和內(nèi)部基質(zhì)層兩層結(jié)構(gòu)構(gòu)成[12]。 研究表明，胎盤組織含有多種干細(xì)胞，已從多種動(dòng)物胎盤的不同部位分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，如臍帶、臍帶血、羊水、羊膜和絨毛膜等，從這些組織分離出的干細(xì)胞具有共同特點(diǎn)：（1）非侵入性、取材簡(jiǎn)單；（2）無(wú)倫理限制；（3）細(xì)胞純度高；（4）分離得到的細(xì)胞量大[13]。 經(jīng)鑒定，這些細(xì)胞都具有干細(xì)胞的特征，包括自我更新能力和多向分化潛能[14]。 近年來(lái)，兔間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)應(yīng)用于臨床研究，但其來(lái)源較單一，大部分是從骨髓與脂肪組織中獲取，因此，有必要為其提供新的干細(xì)胞來(lái)源。

羊膜由最內(nèi)層的單層上皮、中間的基底層與致密層和外面的間質(zhì)層構(gòu)成。 這3 層結(jié)構(gòu)均不含神經(jīng)、血管和淋巴管，組織細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)均來(lái)自羊水。 rAMSCs 存在于間質(zhì)層，因此在分離細(xì)胞時(shí)，需要通過(guò)胰蛋白酶除去上皮細(xì)胞，再使用膠原酶消化剩余的組織，最后將羊膜組織分散為單個(gè)rAMSCs 細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)。 但是在實(shí)際操作中，酶對(duì)羊膜組織的消化作用不可能受到精準(zhǔn)控制。 因此，原代培養(yǎng)的rAMSCs 中可能混含有羊膜上皮細(xì)胞。 由于羊膜上皮細(xì)胞貼壁牢固不易被消化掉，因此，經(jīng)過(guò)多次換液和傳代培養(yǎng)后，羊膜上皮細(xì)胞逐漸清除，剩下的是增殖迅速的rAMSCs。

本研究通過(guò)酶消化法分離獲得的rAMSCs 呈典型的BMSCs 樣，P3 代細(xì)胞形態(tài)均一， 呈長(zhǎng)梭形， 旋渦狀生長(zhǎng)，純度較高，生長(zhǎng)旺盛，優(yōu)與P10 代細(xì)胞。 P3 代細(xì)胞經(jīng)過(guò)凍存復(fù)蘇后，復(fù)蘇率較高，達(dá)到70%以上，復(fù)蘇的P3代細(xì)胞與凍存前細(xì)胞形態(tài)基本一致，并且生長(zhǎng)良好，都可以進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，說(shuō)明本研究分離培養(yǎng)的rAMSCs 可以進(jìn)行冷凍保存。 OCT4、SOX2 及NANOG 是維持和調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞自我更新能力和多向分化潛能的調(diào)控因子，是干細(xì)胞的標(biāo)志基因，三者存在密切的協(xié)同作用，共同維持著細(xì)胞的“干性”[15]。本研究通過(guò)免疫熒光發(fā)現(xiàn)，OCT4、SOX2 及NANOG 在rAMSCs 呈陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明分離得到的rAMSCs 存在較強(qiáng)的自我更新能力。

通常使用含有3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素、吲哚美辛和胎牛血清的LG-DMEM 培養(yǎng)液對(duì)MSCs 進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化[16]。 濃度為1μmol·L-1的地塞米松能夠?qū)SCs 細(xì)胞膜上的糖皮質(zhì)激素受體激活，促進(jìn)MSCs 分化為脂肪細(xì)胞；吲哚美辛可以激活MSCs 中的PPARγ 通路，提高脂肪誘導(dǎo)劑cAMP 在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；胰島素能夠激活細(xì)胞中的ERK1/ERK2 信號(hào)通路，提高PPARγ 的表達(dá)，從而促進(jìn)向脂肪細(xì)胞的分化。油紅O 是一種具有脂溶性特性的染料，能夠與脂肪細(xì)胞中油脂發(fā)生顏色反應(yīng)，可用于成脂誘導(dǎo)分化的鑒定[17]。 本研究使用以上幾種成分的培養(yǎng)液對(duì)rAMSCs 進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，經(jīng)過(guò)21d 后可以發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)槁褕A形或多角形，細(xì)胞體積增大，油紅O 染色可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中存在大量磚紅色脂肪滴，染色結(jié)果呈陽(yáng)性，說(shuō)明成功將rAMSCs 誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。

體外誘導(dǎo)MSCs 分化為成骨細(xì)胞時(shí)，必須的物質(zhì)有維生素C、地塞米松和甘油磷酸鈉。 地塞米松是一種糖皮質(zhì)激素，對(duì)成骨誘導(dǎo)分化具有促進(jìn)作用，但有時(shí)也有抑制作用，這與地塞米松的作用濃度、對(duì)細(xì)胞的作用時(shí)間和細(xì)胞種類有關(guān)；甘油磷酸鈉與地塞米松具有協(xié)同作用，能夠提供磷離子給堿性磷酸酶，將有機(jī)磷處理成無(wú)機(jī)磷離子，加速成骨誘導(dǎo)分化過(guò)程中的鈣鹽沉積并促進(jìn)新骨形成與細(xì)胞鈣化，該過(guò)程是MSCs 成骨誘導(dǎo)分化的必要條件；維生素C 能夠使膠原中的脯氨酸或賴氨酸末端發(fā)生羥基化，從而提高堿性磷酸酶活性，加速鈣鹽沉積；堿性磷酸酶是成骨誘導(dǎo)分化鑒定的標(biāo)志性酶，堿性磷酸酶染色能夠鑒定這種酶的存在；茜素紅能夠與鈣離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成一種紅色物質(zhì)，可以用于鑒定成骨細(xì)胞中的鈣離子。 因此，這兩種染色方法都可以用于鑒定成骨誘導(dǎo)分化[18]。本研究在LG-DMEM 培養(yǎng)液加入維生素C、地塞米松和β-磷酸甘油對(duì)rAMSCs 進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化，經(jīng)過(guò)28d 的誘導(dǎo)培養(yǎng)以后，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形逐漸轉(zhuǎn)變成多角形，部分細(xì)胞出現(xiàn)堆積生長(zhǎng)，出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)塊。 對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色，可見(jiàn)大量成片紫色，染色結(jié)果陽(yáng)性；茜素紅染色后可見(jiàn)部分細(xì)胞團(tuán)塊處有深紅色。染色結(jié)果表明誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶且有鈣離子的沉積，說(shuō)明成功將rAMSCs 誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。

對(duì)rMSCs 進(jìn)行體外分離培養(yǎng)和鑒定是將rMSCs 應(yīng)用于臨床治療的前提。鑒定rMSCs 主要依賴其形態(tài)特征和細(xì)胞表型的鑒定，以及經(jīng)體外誘導(dǎo)能夠分化成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。 目前，rMSCs 的表面標(biāo)記尚無(wú)統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，普遍認(rèn)為rMSCs 表達(dá)表面標(biāo)記CD29, CD44, CD73, CD90 和CD105 等，不表達(dá)表面標(biāo)記CD14, CD19,CD34,CD45 和HLA-DR 等[19]。 本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rAMSCs 細(xì)胞表型，結(jié)果表明，P3 代rAMSCs 低表達(dá)CD34、CD45 和HLA-DR，高表達(dá)CD29、CD49d 和CD73，符合以上鑒定標(biāo)準(zhǔn)。