劉興麗，楊龍松，趙雙麗，吳鳳，張華

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001；3.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001

0 引言

馬鈴薯蛋白(PP)為馬鈴薯淀粉加工后的副產(chǎn)物[1]，其氨基酸組成比例均衡，含有大多數(shù)谷物沒有的賴氨酸，營養(yǎng)價值可與動物蛋白媲美[2].PP按相對分子質(zhì)量大小可分為三部分：高相對分子質(zhì)量蛋白、馬鈴薯糖蛋白、蛋白酶抑制劑[3].其中，馬鈴薯糖蛋白具有良好的凝膠形成性、起泡性、乳化性等功能性質(zhì)[4].目前，我國對PP的研究較少且不深入，主要集中在淀粉廢液中蛋白的分離、改性等方面.

微凝膠是通過生物大分子間的交聯(lián)形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，同時保持大量的溶劑分子、尺寸在微米級及以下的凝膠顆粒[5].微凝膠在穩(wěn)定乳液等方面有著廣泛的應(yīng)用，其制備方法主要包括靜電復(fù)合法、噴射均質(zhì)法等[6].其中，靜電復(fù)合法是通過兩種或兩種以上聚合物間的靜電吸引力而相互聚集，如通過陰離子多糖與帶正電的蛋白質(zhì)靜電復(fù)合制備微凝膠.B.Yin等[7]利用大豆蛋白與大豆多糖，在pH值為3.5時所制備的靜電復(fù)合物具有良好的乳化能力，乳液粒徑達(dá)到250 nm，經(jīng)過加熱后的乳液可在NaCl濃度為200 mmol/L或pH值為2～8的介質(zhì)中保持穩(wěn)定.T.Tran等[8]通過研究大豆可溶性多糖對酸性大豆蛋白分散液和乳狀液的穩(wěn)定作用發(fā)現(xiàn)，二者之間相互作用的本質(zhì)是靜電復(fù)合，所得靜電復(fù)合物可通過空間排斥作用有效改善基于大豆分離蛋白的O/W乳液的動力學(xué)穩(wěn)定性.樊雪靜等[9]利用大豆分離蛋白與寡糖在pH值為6.0時制備了靜電復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白-水蘇糖和大豆分離蛋白-棉子糖的乳化穩(wěn)定性比大豆分離蛋白分別提高了132.40%和116.00%.以上研究表明，采用靜電復(fù)合法制備的凝膠復(fù)合物可有效改善乳液的穩(wěn)定性.

目前，與微凝膠相關(guān)的蛋白研究主要集中在蛋清蛋白、大豆蛋白等，而關(guān)于PP與多糖靜電復(fù)合的研究未見報道.黃原膠屬于陰離子多糖，在較低濃度時會形成不受溫度、鹽濃度變化影響的黏性溶液，與其他多糖溶液相比具有較高黏度，是一種非常有效的穩(wěn)定劑.鑒于此，本文擬采用靜電復(fù)合法制備馬鈴薯蛋白-黃原膠微凝膠(PP-XGM)，并對其結(jié)構(gòu)和乳化特性進(jìn)行研究，以期為PP和多糖的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PP(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.01%)，西安四季生物科技有限公司產(chǎn).食品級黃原膠(XG)，山東阜豐發(fā)酵有限公司產(chǎn)；福臨門大豆油，中國糧油食品集團(tuán)有限公司產(chǎn).實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純.

1.2 主要儀器與設(shè)備

MS7-H550-Pro型磁力攪拌器，龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)；FE20 Plus 型pH測量計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)；LGJ-50FD型冷凍干燥機(jī)，京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)；Turbiscan Lab型多重光散射儀，法國Formulaction公司產(chǎn)；TD5M型低速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)；Nano-ZS90型激光納米粒度儀，英國Malvern公司產(chǎn)； FA25型高剪切分散乳化機(jī)，德國弗魯克流體機(jī)械制造有限公司產(chǎn)；UV762型紫外分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)；JSM-7100F型場發(fā)射掃描電鏡，日本電子公司產(chǎn)；F-7000型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司產(chǎn)；JEM-100CX-Ⅱ型透射電鏡，日本電子株式會社產(chǎn).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1PP-XGM的制備根據(jù)夏曉鳳[10]的方法，略有改動.稱取一定質(zhì)量的PP(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%)和XG(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05%、0.10%、0.20%、1.00%)，分別用去離子水進(jìn)行溶解，持續(xù)攪拌3 h，將制備好的溶液放入 4 ℃ 冰箱中過夜；將XG溶液加入到PP溶液中，持續(xù)攪拌 4 h，使用濃度為0.1 mol/L的HCl溶液將上述溶液pH值分別調(diào)節(jié)至2.0～4.0，得到相應(yīng)pH值的PP-XG靜電復(fù)合溶液；在80 ℃、90 ℃溫度下，將上述靜電復(fù)合溶液水浴加熱不同時間后，立即放入冰水中冷卻至室溫，即得PP-XGM；最后將PP-XGM凍干保存，備用.

1.3.2ζ-電位的測定在激光納米粒度儀上進(jìn)行ζ-電位的測定.分別將凍干后的PP-XGM樣品和馬鈴薯蛋白-黃原膠物理復(fù)合物(PP-XG)配成溶液，用相同pH值的磷酸鹽緩沖液稀釋到合適的質(zhì)量濃度.測試溫度為 25 ℃，設(shè)置平衡時間為2 min.

1.3.3 動力學(xué)穩(wěn)定性的測定乳液的動力學(xué)穩(wěn)定性由動力學(xué)穩(wěn)定性指數(shù)(TSI)表征，乳液的TSI越大，表明其動力學(xué)穩(wěn)定性越差；反之，乳液的TSI越小，表明其動力學(xué)穩(wěn)定性越好[11].取 7.5 mL質(zhì)量濃度為 0.001 g/mL 的蛋白微凝膠溶液，加入2.5 mL 大豆油，用高速分散均質(zhì)機(jī)于19 000 r/min 條件下均質(zhì)120 s，得到新鮮的皮克林乳液.在近紅外光源波長880 nm，溫度25 ℃條件下，使用多重光散射儀對樣品進(jìn)行動力學(xué)穩(wěn)定性測定.在儀器配套的圓柱形玻璃管中加入20 mL樣品，每隔25 s掃描一次，持續(xù)掃描1 h.

1.3.4 粒徑的測定用磷酸鹽緩沖液將樣品稀釋至相同質(zhì)量濃度，采用激光納米粒度儀對樣品的平均表觀流體力學(xué)粒徑和多分散系數(shù)(PDI)進(jìn)行測定[12]，其中，PDI越小，說明顆粒的分布越均勻.測定溫度為25 ℃，平衡時間為 2 min.

1.3.5 內(nèi)源性熒光光譜的測定內(nèi)源性熒光光譜用于評價色氨酸殘基周圍的構(gòu)象變化.首先將PP、PP-XG、PP-XGM用磷酸鹽緩沖液(pH=7.0，濃度為0.01 mol/L)稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL，然后用熒光分光光度計(jì)檢測溶液的內(nèi)源性熒光光譜[13].激發(fā)波長為290 nm，掃描發(fā)射光譜范圍為300～420 nm，激發(fā)波長和發(fā)射波長狹縫寬度均為2.5 nm.

1.3.6 微觀形貌的測定采用透射電鏡觀察PP-XGM的微觀結(jié)構(gòu)：取一滴樣品稀釋液(約20 μL)滴加到透射電鏡專用的碳膜銅網(wǎng)上，吸附15 min后，用濾紙吸附多余部分，室溫下干燥10 min，測試的加速電壓為 80 kV.

1.3.7 乳化特性的測定取一定量的PP-XGM于容器中，加入濃度為0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)，將PP-XGM溶液的質(zhì)量濃度稀釋至 1 mg/mL；取1 mL稀釋后的PP-XGM溶液加入3 mL大豆油中，用高剪切分散乳化機(jī)攪打2 min，設(shè)置轉(zhuǎn)速條件為10 000 r/min；分別于0 min和10 min時從容器底部量取50 μL乳液，加入到5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% 的十二烷基磺酸鈉溶液中，充分混勻后，用紫外分光光度計(jì)測其吸光度值，波長設(shè)置為500 nm，以SDS空白溶液調(diào)零[14].乳液的乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)計(jì)算公式如下：

式中，A0和A10分別表示乳液靜置0 min和10 min的吸光度值.

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016軟件處理，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)的形式表示.用Origin 8.5軟件作圖、SPSS 17.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，采用Duncan’s多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為判定顯著性的條件.

2 結(jié)果與分析

2.1 PP-XGM的制備條件分析

2.1.1pH值范圍的確定pH值會影響蛋白質(zhì)和多糖帶電基團(tuán)的解離程度，進(jìn)而影響二者的相互作用[15].因此，在制備PP-XGM前，首先需要考查pH值對PP和XG的影響.pH值對PP和XG的ζ-電位的影響如圖1所示.由圖1可以看出，當(dāng)pH值為4.3時，PP的ζ-電位為0；當(dāng)pH值大于4.3時，PP的ζ-電位均為負(fù)值，帶正電荷；當(dāng)pH值小于4.3時，PP的ζ-電位均為正值，帶負(fù)電荷.當(dāng)pH值在2.0～8.0范圍內(nèi)時，XG的ζ-電位均為負(fù)值.隨著pH值的增大，XG的羧基離子化程度增加，帶電量增多，ζ-電位的絕對值越來越高.當(dāng)pH值在 2.0～4.0范圍內(nèi)時，PP和XG帶相反電荷，可實(shí)現(xiàn)二者之間有效的靜電吸引作用.

圖1 pH值對PP和XG的ζ-電位的影響Fig.1 Effect of pH value on ζ-potential of potato protein and xanthan gum

圖2 pH值對皮克林乳液動力學(xué)穩(wěn)定性的影響Fig.2 The effect of pH value on the dynamic stability of Pikering emulsion

2.1.2pH值對皮克林乳液動力學(xué)穩(wěn)定性的影響依據(jù)2.1.1研究結(jié)果，進(jìn)一步研究pH值在 2.0～4.0范圍內(nèi)的PP-XGM對乳液動力學(xué)穩(wěn)定性的影響.pH值對皮克林乳液動力學(xué)穩(wěn)定性的影響如圖2所示.由圖2可以看出，所有乳液樣品的TSI均隨時間的延長而不斷增大，最后趨于平緩，說明時間越長，乳液越不穩(wěn)定.當(dāng)pH值為4.0和3.5時，所制備的PP-XGM穩(wěn)定乳液的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)劣于其他pH值下所制備的PP-XGM.這可能是因?yàn)榇藭r乳液的pH值處在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近，PP發(fā)生自聚集，與XG相互作用較弱.當(dāng)pH值為3.0時，乳液的TSI最低，說明該條件所制備的PP-XGM穩(wěn)定乳液的效果較好.

2.1.3 熱處理?xiàng)l件對皮克林乳液動力學(xué)穩(wěn)定性的影響熱處理?xiàng)l件對皮克林乳液動力學(xué)穩(wěn)定性的影響如圖3所示.未經(jīng)熱處理的PP與XG所形成的靜電復(fù)合物是可逆的，在復(fù)合物溶液 pH值高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的情況下，不能形成相互作用的聚集體.熱處理可使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)被破壞，與多糖結(jié)合的位點(diǎn)增加，疏水基團(tuán)暴露，疏水相互作用增強(qiáng)，同時，熱處理也使多糖的構(gòu)象發(fā)生改變，二者的相互作用增強(qiáng)[16].另一方面，熱處理可減少可逆反應(yīng)的發(fā)生，提高聚合物的穩(wěn)定性，抑制蛋白質(zhì)分子間的聚集.由圖3可以看出，與90 ℃熱處理不同時間所制備的PP-XGM相比，80 ℃熱處理不同時間所制備的PP-XGM穩(wěn)定乳液的效果更好.這可能是因?yàn)槌^一定溫度后，PP變性嚴(yán)重，PP與XG形成的微凝膠界面活性下降，從而穩(wěn)定乳液的能力下降.另外，由80 ℃熱處理30 min所制備的PP-XGM穩(wěn)定的乳液，其TSI最低，表明其動力學(xué)穩(wěn)定性最好.

2.1.4 不同PP/XG質(zhì)量比對皮克林乳液動力學(xué)穩(wěn)定性的影響XG的加入可增加蛋白質(zhì)的潤濕性、分子的伸展程度和疏水基團(tuán)的暴露.當(dāng)XG質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時，因其不足以覆蓋所有液滴，會發(fā)生橋架絮凝現(xiàn)象；當(dāng)XG質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時，又會發(fā)生排斥絮凝現(xiàn)象[17].因此，XG和蛋白質(zhì)的質(zhì)量比會影響乳液的動力學(xué)穩(wěn)定性.保持PP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%，溶液pH值為3.0，80 ℃熱處理30 min，PP/XG質(zhì)量比對皮克林乳液動力學(xué)穩(wěn)定性的影響結(jié)果如圖4所示.由圖4可以看出，當(dāng)PP/XG質(zhì)量比為51時，乳液動力學(xué)穩(wěn)定性最差.這可能是因?yàn)樵趐H值為3.0時，PP所帶正電荷與XG所帶負(fù)電荷相中和，使復(fù)合物所帶凈電荷接近于0，此時所形成的PP-XGM吸附的油滴無法抵抗吸引力而發(fā)生絮凝，乳液的TSI隨之減小.當(dāng)PP/XG質(zhì)量比分別為201，101和11時，乳液的各TSI變化曲線相近，TSI均較小，其中，當(dāng)PP/XG質(zhì)量比為11時，乳液的動力學(xué)穩(wěn)定性最好.

圖3 熱處理?xiàng)l件對皮克林乳液動力學(xué)穩(wěn)定性的影響Fig.3 The effect of heat treatment conditions on the dynamic stability of Pickering emulsion

2.2 PP-XGM的結(jié)構(gòu)表征分析

2.2.1PP-XGM的粒徑和PDI分析PP、PP-XG 和PP-XGM的粒徑和PDI檢測結(jié)果見表1.由表1可知， PP-XG和PP-XGM的粒徑較PP均明顯增大.這是因?yàn)閄G本身的粒徑較大，XG和PP以靜電作用形成復(fù)合物后，該復(fù)合物的粒徑明顯增大.PP-XGM的粒徑(473.10 nm)遠(yuǎn)大于PP-XG的粒徑(222.85 nm)，這可能是因?yàn)榧訜釋?dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)被破壞，與多糖結(jié)合位點(diǎn)增加，相互作用增強(qiáng)，形成了較大的聚集體[18].PP-XGM的PDI明顯小于未處理的PP-XG，說明形成微凝膠后，顆粒分布更均勻.

圖4 PP/XG質(zhì)量比對皮克林乳液動力學(xué)穩(wěn)定性的影響Fig.4 The effect of potato protein/xanthan gum mass ratio on the dynamic stability of Pickering emulsion

2.2.2PP-XGM的內(nèi)源性熒光光譜分析PP-XGM的內(nèi)源性熒光光譜和熒光指數(shù)(FI)如圖5和表2所示.由圖5和表2可知，與PP相比，PP-XG和PP-XGM的最大吸收波長λmax發(fā)生了不同程度的藍(lán)移，這可能是因?yàn)闊崽幚頃r，原來包埋在PP分子內(nèi)的色氨殘基被暴露在溶劑中，而疏水作用又將色氨殘基重新包埋[19].PP-XGM的λmax向更短波長處移動，這是由于PP與XG通過靜電、氫鍵等非共價相互作用引起了藍(lán)移.PP-XGM的熒光強(qiáng)度(FI)下降最顯著，這可能是因?yàn)閄G與PP之間的靜電相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，發(fā)生熒光猝滅.

2.2.3PP-XGM的微觀形貌分析PP-XGM的微觀形貌如圖6所示.由圖6可以看出，PP為單分散的球形顆粒，與XG靜電復(fù)合后，PP-XG為圓球狀.將PP-XGM中的單一顆粒放大后發(fā)現(xiàn)，核與殼的密度不同，說明PP-XGM為核殼結(jié)構(gòu).有研究表明，核殼結(jié)構(gòu)內(nèi)部為蛋白質(zhì)，外部較疏松的結(jié)構(gòu)為多糖[12].PP與XG通過靜電作用形成PP-XG，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被加熱到接近其熱變性溫度時，會從PP-XG中分離出來，并聚集在一起形成蛋白質(zhì)核，而蛋白質(zhì)表面的陽離子與帶負(fù)電的XG相互吸引，形成具有核殼結(jié)構(gòu)的顆粒.PP-XGM的尺寸小于通過激光粒度儀測得的粒徑.這可能是因?yàn)榧{米顆粒中大部分水分在TEM的高真空室內(nèi)蒸發(fā)，導(dǎo)致一些顆粒收縮.由圖6c)可知，PP-XGM與背景對比強(qiáng)烈，表明PP與XG交聯(lián)緊密.

表1 PP、PP-XG和PP-XGM的粒徑和PDI檢測結(jié)果

圖5 PP、PP-XG和PP-XGM的內(nèi)源性熒光光譜Fig.5 Endogenous fluorescence spectra of PP、PP-XG and PP-XGM

表2 PP、PP-XG和PP-XGM的熒光指數(shù)

2.3 PP-XGM的乳化特性分析

油相的體積分?jǐn)?shù)在乳狀液乳化過程中起主導(dǎo)作用.PP、PP-XG和PP-XGM對乳液乳化穩(wěn)定性的影響如圖7所示.由圖7可以看出，所有實(shí)驗(yàn)組別的ESI值均隨油相體積分?jǐn)?shù)的增加呈先增大后減小的趨勢，其中，由PP和PP-XG穩(wěn)定的乳液在油相體積分?jǐn)?shù)為40%時穩(wěn)定性最好.這是因?yàn)橛拖囿w積分?jǐn)?shù)的增加提高了乳液黏度，降低了乳化速度[20].而隨著油相體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加，顆粒的數(shù)量變得不足以完全穩(wěn)定油滴，乳液的穩(wěn)定性下降[21].在油相體積分?jǐn)?shù)相同的條件下， PP-XGM的乳化穩(wěn)定性高于PP，這一方面可能是因?yàn)镻P-XGM的電位絕對值越大，微凝膠表面所帶電荷越多，顆粒之間的靜電斥力越強(qiáng)，可有效抑制顆粒之間的聚集，提高乳液穩(wěn)定性；另一方面可能是因?yàn)橛蒔P穩(wěn)定的乳液中絮凝物以開放的結(jié)構(gòu)存在，而由PP-XGM穩(wěn)定的乳液中，油滴被固定在微凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，乳液的穩(wěn)定性增強(qiáng)[22].此外，PP-XGM吸附到油滴表面可增加水相黏度，抑制液滴的移動，進(jìn)而提高乳液的穩(wěn)定性[23].

圖6 PP、PP-XG和PP-XGM的微觀形貌Fig.6 Micro-morphology of PP、PP-XG and PP-XGM

圖7 PP、PP-XG和PP-XGM對乳液乳化穩(wěn)定性的影響Fig.7 The influence of PP，PP-XG and PP-XGM on the emulsification stability of emulsion

3 結(jié)論

本研究對PP-XGM的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了PP-XGM的最佳制備條件為PP/XG質(zhì)量比11，pH值3.0，80 ℃熱處理 30 min.結(jié)構(gòu)表征分析發(fā)現(xiàn)：靜電復(fù)合后，PP-XGM的粒徑變大，PDI變小，顆粒分布更均勻；與PP相比，PP-XG和PP-XGM的最大吸收波長λmax發(fā)生了不同程度的藍(lán)移，且PP-XGM的FI下降最顯著； PP-XGM呈核殼結(jié)構(gòu).制備條件優(yōu)化后的PP-XGM可提高乳化體系的穩(wěn)定性.該研究可為馬鈴薯蛋白及多糖資源的開發(fā)利用提供一定的技術(shù)支持.